Abstract
kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) er rapportert å støtte tumorigenesis ved å stimulere angiogenese, kreftcelle spredning, og invasjonen i de fleste solide tumorer. Men rollene til kafeer i leveren kreft mikromiljøet ikke blitt grundig undersøkt. I vår forrige undersøkelse, vi lyktes i å isolere kafeer fra leverkreft (HCC) (H-kafeer) og beviste at H-kafeer trykt aktiveringen av NK-celler og dermed skapt grobunn for HCC progresjon. I vår nåværende studie fant vi at spredning av MHCC97L og Hep3B celler ble betydelig fremmet av behandling med kondisjonert medium fra H-kafeer. Patologisk analyse viser også at H-kafeer økt andelen av Ki-67 (+) ondartede celler og hindret dem fra gjennomgår nekrose. Videre er konsentrasjonen av hepatocytt-vekstfaktor (HGF) cytokin i det kondisjonerte medium av H-kafeer var høyere enn kondisjonert medium fra normal hud-fibroblaster (NSFs). Anti-HGF betydelig redusert spredning fremmende evnen til H-kafeer. I tillegg fant vi at overflod av H-kafeer positivt korrelert med tumorstørrelse. Disse resultatene tyder på at H-kafeer er en viktig faktor for å fremme veksten av HCC
in vitro Hotell og
in vivo
, og at HGF spiller en nøkkelrolle i HCC spredning indusert av H-kafeer .
Citation: Jia CC, Wang TT, Liu W, Fu BS, Hua X, Wang GY, et al. (2013) Kreft-Associated fibroblaster fra leverkreft Fremme Ondartet Cell Proliferation av HGF sekresjon. PLoS ONE 8 (5): e63243. doi: 10,1371 /journal.pone.0063243
Redaktør: Song Guo Zheng, University of Southern California, USA
mottatt: 10 november 2012; Godkjent: 01.04.2013; Publisert: 07.05.2013
Copyright: © 2013 Jia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av: State 973 National grunnforskningsprogram of China (2009CB522404), National Natural Science Foundation of China (NSFC-30972914, 81000936, 81172036, 81170451, 81170452), 985 Project (82000-3281901), grunnleggende forskning Midler for sentral universiteter (10ykpy05), State Key Prosjekter på Infeksjon Sykdommer i Kina (2012ZX10002016-023, 2012ZX10002010-001-007), National Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (10151008901000208) samt Key prosjekt of Medical Science i Sun Yat-sen-universitetet ( 10YKJC03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den merkede påvirkning av tumor stroma på veksten av ondartede kreftceller har blitt demonstrert og undersøkt med entusiasme i denne epoken av målrettet terapi [1], [2]. Som en viktig komponent av svulsten stroma, har økende bevis vist at cancerassosierte fibroblaster (kafeer) er en betydelig ombygging av kreft evolusjon [3], og de fremmer tumorigenesis [4], progresjon [5], invasjon [6] og chemoresistance [7] av kreftceller av forskjellige mekanismer. Dette gjelder spesielt for hepatocellulært karsinom (HCC) [8], [9], fordi de fleste HCC tilfeller kan stamme fra levercirrhose [10]. Kafeer er hovedsakelig resistent overfor kjemoterapi og radioterapi på grunn av en liten andel av prolifererende celler i motsetning til ondartede celler [11], som gjør kafeer en potensiell kilde for tumorprogresjon og tilbakefall [12]. Målrettet terapi mot kafeer har vist lovende anti-kreft effekt [6], noe som ytterligere har forsterket behovet for å studere sammenhengen mellom kafeer og deres verter [13].
Men lite er kjent om de kafeer i HCC (H-kafeer). H-kafeer ble isolert og karakterisert i vår tidligere studie [8], som var sammenlignbare med studiet av Antonio Mazzocca [9]. Vi fant ut at H-kafeer utdannede NK-celler til å skaffe seg en deaktivert fenotype og skape en svarer tilstand svulster [8]. I tillegg studien av Antonio Mazzocca [9] indikerte at lysofosfatidisk syre (LPA) akselererer HCC progresjon ved å rekruttere peri-tumor fibroblaster (PTFer) og fremme deres transdifferensiering i myofibroblasts. Men visste at studien ikke fastslå effekten av kafeer på leveren kreftceller in vitro. Rollen til H-kafeer i HCC er ukjent. Flere studier er nødvendig for å få full oversikt over krysstale mellom H-kafeer og HCC i verten.
kafeer er antatt å bli aktivert, som er preget av uttrykket av α-glatt muskulatur aktin (α -SMA), fibroblast-aktiveringsprotein (FAP), fibroblast-overflateprotein (FSP), og vimentin [1] – [3]. Denne aktiveringen tilskudd kafeer flere funksjoner for å fremme utvikling av kreft, for eksempel å lette angiogenese, epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [14], chemoresistance [5], [7], dysfunksjon av det lokale immunsystemet [6], [8], og enda mer grunnleggende, malign celleproliferasjon [1] – [3]. Men nøkkelen molekylære mekanismen og funksjonell signalveien involvert i disse biologiske prosesser er dårlig forstått, og langt fra ferdig etterforsket.
I denne studien, forsøkte vi å belyse rollen til H-kafeer i å fremme HCC celleproliferasjon og den underliggende mekanismen.
Materialer og metoder
pasienter og valgbarhet
Vi har undersøkt en rekke av 43 pasienter med histologisk bekreftet leverkreft, som ble tatt opp til den tredje Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet (Guangzhou, Kina) fra november 2008 til august 2011. Pasientene ble inkludert med følgende inklusjonskriterier: (a) patologisk bekreftet som HCC, (b) age≥18, (c) behandlet med radikal eksisjon for HCC, (d) tilgjengelighet av CT data for svulst morfologi, (e) mangel på kreftbehandling, slik som Kateter arteriell chemoembolization (TACE), sorafenib, kjemoterapi og strålebehandling før operasjonen. Studien ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for tredje Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet, Guangzhou, Kina. En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter ved tidspunktet for opptak. De parafininnstøpte prøver og kliniske data ble hentet for hver pasient.
Isolering av primære fibroblaster fra HCC prøver
tumorprøver ble hentet fra HCC pasienter, normale prøver lever ble oppnådd fra lever hemangioma pasienter og forhuden prøver ble innhentet fra friske givere fra den tredje Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet. Diagnosen HCC hos alle pasienter som gjennomgikk hepatolobectomy ble bekreftet av patologiske og kliniske tester. Prøvene ble anonymt kodet i henhold til lokale etiske retningslinjer (som fastsatt av Helsinkideklarasjonen), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter og friske frivillige. Arbeidet ble utført i henhold til de studiedesign som er godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for tredje Tilknyttet Hospital ved Sun Yat-sen-universitetet i Guangzhou, Kina.
H-kafeer ble isolert fra kreft region og noncancerous fibroblaster (NFS) inkluderte tre typer av fibroblaster: peritumoral fibroblaster (PTFs) tatt fra vev på minst 2 cm distalt til den ytre kanten av kreft massen, fibroblaster avledet fra lever godartet hemangioma som normale lever fibroblaster (NLFs) og fibroblaster innhentet fra forhuden som normal hud fibroblaster (NSFs). Vevene ble finhakket og spaltet i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 1 mg /ml kollagenase type I ( Sigma, St. Louis, MO) og 100 U /ml hyaluronidase (Sigma, St. Louis, MO) ved 37 ° C i 6 til 8 timer, vasket to ganger med PBS (Sigma, St. Louis, MO) og sentrifugert ved 450 g for 8 minutter hver gang. De ble til slutt resuspendert i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og deretter dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 miljø. Differensial trypsinering ble tilført i løpet av sub-dyrkning for å selektere for vekst av fibroblaster. Prosentandelen av rensede fibroblaster var 95% etter 2-3 passasjer, noe som ble bestemt ved immunfluorescens, Western blotting og strømningscytometri ved bruk av antistoffer mot vimentin, cytokeratin, FAP, og α-SMA. Påfølgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av disse cellene i løpet av 3-10 passasjer.
Celler og cellekultur
HCC-cellelinjen Hep3B (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ble dyrket i minimum Essential Medium (MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% FBS. Mhcc-97L celler (97L; Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY) supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), L-glutamin (300 ug /ml) og 10% FBS. Lo2-celler (erholdt fra vårt laboratorium lagring) ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% FBS. Alle celler ble passert ved et forhold på 1:4 hver 4-5 dager.
Samling av kondisjonert medium og enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA)
For oppsamling av kondisjonert medium fra disse fibroblaster, fibroblast-celler ble sådd ut i 75 cm
2 kolber, vasket to ganger med PBS 4 dager senere, og inkubert i 48 timer med serumfritt DMEM. Deretter ble supernatanten høstet, sentrifugert ved 3000 rpm i 5 minutter, passerte gjennom et sterilt 50 ml Millipore filtreringssystem med en 0,45 um polyvinylidenedifluoride membran og lagret i en -80 ° C kjøleskap til senere bruk.
måle oppløselige cytokiner i det kondisjonerte medium, 2 x 10
5 fibroblaster ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i 24 timer, og det kondisjonerte medium ble oppsamlet for ELISA. Den samme metode ble anvendt for å oppnå kondisjonert medium fra lo2-celler. Nivåene av human stromal celle-avledet faktor 1 (SDF-1), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) og epidermal vekstfaktor (EGF) ble bestemt ved å bruke humane ELISA-sett (R 0,05; **
P
0,01).
For å vurdere bidraget fra H-kafeer og NSFs i form av svulst veksten
in vivo
, en leverkreft xenograft systemet ble etablert som beskrevet i metodedelen. Nude mus ble subkutant injisert med HCC celler, fibroblast celler, eller med HCC celler og fibroblast celler. Tumorvekst registrert i maksimalt 28 dager etter celle injeksjon. Tumorstørrelse måling viste at implantering av ren H-kafeer eller NSFs ikke resulterte i tumordannelse. Videre co-injeksjon av H-kafeer bidro til dannelsen av større svulster (HCC + H-kafeer
vs
HCC,
P
. 0,05, n = 5) i motsetning til co-injeksjon av NSFs, som ikke forbedre tumormasse dannelse eller vekst (HCC + NSFs
vs
HCC,
P
. 0.05, n = 5). (fig 2C og fig. 2D).
Videre denne kampanjen evne ble bekreftet av andelen Ki-67-positive tumorceller i tumor noder. Ki-67 (+) overflod direkte gjenspeiler den økende fraksjon av tumorvev. Som forventet, tumorer dannet av HCC og H-kafeer viste sterk og tett Ki-67 ekspresjon, mens de andre to gruppene viste moderat og spredt Ki-67-farging (fig. 3A). Interessant nok var en høy forekomst av Ki-67-positive celler funnet rundt fibroblaster i seriesnitt, særlig i områder med massiv nekrose, noe som ytterligere foreslått fremmende rolle fibroblaster på overlevelse av tumorceller (Fig. 3B).
(A) Ki-67 ekspresjon i HCC celler som var betydelig høyere i tumor knutepunkter dannet ved ko-injeksjon av 97L celler og H-kafeer, som var i kontrast til resultatene av tumorer dannet ved ko-injeksjon av 97L og NSFs eller 97L celler alene. (B) Ki-67-positive celler var rikelig nær α-SMA (+) CD31 (-) fibroblaster innenfor serietumorsnitt. I prøvene som ble dobbelt immunostained med α-SMA (rød farge, svart rad) og CD31 (brun farge, rød rad), ble CD31 ikke uttrykkes i α-SMA-positive celler (Øvre panel). Når dobbeltimmunfarget med α-SMA (rød farge) og Ki-67 (brun farge), en høy forekomst av tumorceller med Ki-67 uttrykket (brun farge, rød rad) ble observert funnet i nærheten av H-kafeer med α -SMA-positiv farging (rød farge, svart rad) (Nedre panel). (C) Nekrose var massivt redusert i tumor noder generert ved samtidig injeksjon av fibroblaster (+ NSFs eller + H-kafeer), sammenlignet med tumorer dannet ved 97L celleinjeksjon alene (kontroll). (D) α-SMA uttrykk ble observert i alle tumorxenotransplantater, inkludert kreft noder dannet uten fibroblast co-injeksjon (kontrollgruppen).
Denne forbedrede svulst node vekst kan ikke bare styrket ved spredning markedsføring, men også støttet ved å unngå nekrose. Nekrose forekom i tumor noder av de tre gruppene når noden diameter økt til et visst nivå. Interessant, nekrotiske områder innenfor seriesnitt var mye mindre i tumormasser som er utviklet med fibroblaster (Fig. 3C). Videre ble rest-tumorceller i nekrotiske områder fordelt rundt fibroblaster som uttrykker α-SMA, som sterkt indikerte overlevelsen rollen som fibroblaster for maligne celler (fig. 3B).
I tillegg er et interessant fenomen ble observert i vårt eksperiment. H-kafeer ble også observert i tumor noder dannet av bare HCC celler, som foreslo at kreftceller kan indusere visse celler med ukjent opprinnelse å forvandle seg til kafeer (Fig. 3D).
HGF er involvert i å forbedre spredning av HCC celler
det var sterkt antydet at H-kafeer kan kommunisere med HCC celler gjennom parakrine moduser fordi H-CAF kondisjonert medium fremmet spredning av HCC celler. Derfor kan vekstfaktorer og kjemokiner være de viktigste mediatorer gjennom hvilke fibroblaster kommuniserer med kreftceller. Vi målte nivåene av fire tidligere rapportert cytokiner, SDF-1 [15], HGF [16], TGF-β [1], [3] og EGF, i det kondisjonerte medium med H-kafeer. ELISA viste at HGF-konsentrasjonen i det kondisjonerte medium av H-kafeer var den høyeste av de fire typer av fibroblaster. PTFs viste også en høy grad av utskillelse av HGF, med ingen signifikant forskjell sammenlignet med H-kafeer. HGF utskilt av NLFs ble betydelig redusert sammenlignet med H-kafeer og presenterte en avtagende tendens sammenlignet med PTFer. Videre NSFs ikke utskiller HGF. Disse resultatene indikerte at HGF sekresjon ble korrelert med fibroblast type. Men dette lignende tendens ble ikke observert i konsentrasjonene av SDF-1, TGF-β eller EGF utskilt av de forskjellige fibroblaster (Fig. 4A).
(A) Nivået av SDF-1, HGF, TGF-β og EGF i det kondisjonerte medium avledet fra H-kafeer ble bestemt ved hjelp av ELISA. H-kafeer og PTFer skilles HGF på betydelig høyere nivåer enn NLFs, mens NSFs utskilles nesten ingen påviselig HGF. Imidlertid NSFs utskilt et høyere nivå av SDF1 enn de tre andre fibroblast-typer. TGF-β og EGF sekresjon var lik for de fire fibroblast-typer. (B) Celleproliferasjon økes ved eksponering for forskjellige konsentrasjoner av HGF, som demonstrert av CCK-8 tester. HGF fremmet HCC celleproliferasjon ved alle konsentrasjonsnivåer. (C) Økning i proliferasjon av HCC celler som medieres av H-CAF kondisjonert medium ble betydelig antagonisert av HGF-nøytraliserende antistoff. Videre fikk anti-HGF ikke forstyrre spredning av 97L celler. (*
P
0,05; **
P
0,01).
Det var interessant at tendensen til HGF produksjonen var konsistent med at av tumorvolumvekst, noe som førte til hypotesen om at HGF spilte en mellommann rolle i HCC spredning tilrettelagt av H-kafeer (fig. 2D og 4A fig.). Følgelig HGF ble analysert med CCK-8 tester for å bestemme dens proliferativ potensial. Resultatene var positive for alle gruppene ved forskjellige konsentrasjoner av HGF (Fig. 4B). I tillegg ble anti-HGF administrert for å motvirke effekten av H-CAF kondisjonert medium på HCC celler og betydelig redusert spredning (fig. 4C). Videre HGF ble ikke påvist i det kondisjonerte medium fra 97L-celler, noe som utelukket HGF autokrine stimulerende reaksjonsvei av HCC celler. Dette funnet ble også dokumentert av det faktum at anti-HGF ikke forstyrre spredning av 97L celler (fig. 4C). Imidlertid proliferasjon ble ikke fullstendig eliminert, noe som antydet at HGF er ikke den eneste cytokin som er involvert i den molekylære mekanisme av malign cellevekst mediert av H-kafeer.
H-CAF-utskilt HGF indusert celleproliferasjon HCC
Videre, analyserte vi HGF nivå i kondisjonert medium av H-kafeer, normale hepatocytter (LO2) og HCC celler (97L og Hep3B) ved hjelp av ELISA for å utelukke muligheten for en HGF autokrin mekanisme. Våre resultater viser en stor forskjell i HGF utskillelsen mellom H-kafeer og utvunnet fra lever cellene uavhengig av ondartet karakter. Videre HGF ble ikke påvist i LO2 kondisjonert medium (Fig. S1A). For å undersøke den spesifikke rollen med H-kafeer i HCC progresjon videre, sammenlignet vi spredning fremmende evne med H-kafeer til at av lo2 celler. Våre resultater viser at H-kafeer hadde en betydelig sterkere virkning på proliferasjonen HCC enn lo2-celler. Alle våre funn tyder på at HCC celleproliferasjon ikke er forårsaket i en autokrin måte (Fig. S1B). Dermed våre data tyder på at HCC spredning er fremmet i en parakrint måte ved HGF skilles ut av H-kafeer.
Patologisk aktivering er en av de viktigste funksjonene i H-kafeer
Likheter ble funnet i fenotype og spredning forbedring blant NLFs, PTFer og H-kafeer (fig. 1A, fig. 1B, fig. 2A og figur 2B) i
in vitro
eksperimenter, inkludert α-SMA uttrykk. Imidlertid fibroblaster avledet fra regioner i tumorvev, peri-tumorvev og normale levervev uttrykt forskjellige nivåer av α-SMA, den spesifikk markør for fibroblast aktivering. Denne inkonsekvensen i resultatene kan være forårsaket av det faktum at fibroblaster vil transformere fra en statisk, pericyte-lignende fenotype til en aktivert fenotype som ligner myofibroblasts etter et par dager med kultur
in vitro
. Sammenlignet med en tidligere studie, ble normale fibroblaster aktivert etter en uke med kultur
in vitro
, som var preget av α-SMA uttrykk (Fig.1A og 1B fig.). Dermed var det logisk å hypoteser om at PTFene og NLFs var statiske i tumorer og aktiveres under kultur. Videre, H-kafeer ble forholdsvis aktivert i tumorer. I samsvar med denne hypotesen, denne studien viste at PTFer og NLFs var «pericyte like», mens H-kafeer var «myofibroblast som» når de opprinnelig ble isolert fra vevsprøver (Fig. 5A). For ytterligere å teste denne hypotese, ble immunofluorescens anvendt for å detektere α-SMA uttrykk blant forskjellige typer av fibroblaster inkubert i 24 timer etter isolering av opprinnelig vev. Som vist i figur 5B, H-kafeer var i en aktivert fase, som antydet ved α-SMA-ekspresjon, mens PTFs og NLFs presentert en hvile fenotype, som demonstrert ved negativ α-SMA flekker, noe som indikerer at patologisk aktivering kan være hovedårsaken for forskjellen mellom normale fibroblaster og H-kafeer.
(A) Mikroskop bilder av H-kafeer, PTFer og NSFs ruges i 24 timer. Når opprinnelig isolert fra vevsprøver, PTFer og NLFs presentert med en statisk, pericyte-lignende fenotype, mens H-kafeer næret en aktivert fenotype som ligner myofibroblasts. (B) Uttrykket av α-SMA, FAP, FSP og fibronektin i H-kafeer, PTFer og NSFs inkubert i 24 timer ble bestemt ved immunfluorescens farging. α-SMA uttrykk var bemerkelsesverdig høyere i H-kafeer og relativt ikke-eksisterende i de andre fibroblast typer når analyseres umiddelbart etter høsting fra vevsprøver. Denne forskjellen antyder patologisk aktivert natur med H-kafeer og relativt statiske natur de andre fibroblaster innenfor de opprinnelige vev.
Tilstedeværelsen av H-kafeer positivt korrelerer med tumorstørrelse
for å bestemme den kliniske viktigheten av H-kafeer i forbindelse med tumorvekst, undersøkte vi nærvær av H-kafeer innen tumorprøver oppnådd fra 43 pasienter med α-SMA-immunoreaktivitet. Våre resultater viser at tjuesju pasientprøver viste en høy grad av farging for H-kafeer, mens de resterende seksten prøver presentert med et lavt nivå av farging for H-kafeer (Fig. 6A). Spesielt, aggregering av H-kafeer var signifikant assosiert med større tumorstørrelse (fig. 6B og tabell S1), noe som antyder en positiv korrelasjon mellom relative overflod av H-kafeer og tumorvekst på det kliniske plan.
(A) overflod av H-kafeer ble dikotomisert i to nivåer, høy tetthet og lav tetthet. (B) Tumor volumer av high-density gruppe (n = 27) var betydelig høyere enn kreft volumer av lav tetthet gruppen (n = 16,
P
= 0,006).
Diskusjoner
leverkreft (HCC) er den femte mest utbredte formen for kreft og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall, sto for 90% av alle tilfeller av primær leverkreft. Rollen av svulsten mikromiljøet i løpet av karsinogenese stor grad har vært studert som et dynamisk system instrumentert av inflammatoriske celler, innbefattende kreftceller. Mikromiljøet av HCC er sammensatt av fibroblaster, invasjon av inflammatoriske celler, endotelceller (ECS), pericytes tilstøtende til ECS, og omfattende ekstracellulær matriks (ECM) komponenter. Carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) er en av de mest avgjørende komponentene i HCC mikromiljøet. I vår forrige undersøkelse, vi lyktes i å isolere spesifikke carcinoma-assosiert fibroblaster av HCC (H-kafeer) fra primære HCC vev og beviste at H-kafeer trykt aktiveringen av NK-celler og skapte en gunstig immunsuppressiv skjold for HCC celler.
