Abstract
Målrette svulst stoffskiftet blir en stor nytt område av farmasøytiske forsøke. Følgelig, til en systematisk søk definere om det er spesielle energikilde avhengigheter i svulster, og hvordan disse kan være diktert av oppstrøms kjøre genetiske mutasjoner, er nødvendig. Den PI3K-AKT-mTOR signalveien har en banebrytende rolle i å regulere ulike cellulære prosesser, inkludert celleproliferasjon og overlevelse, men har også vært assosiert med metabolsk feilregulering. I denne studien, søkte vi å definere hvordan mutasjoner innenfor
PI3KCA
kan påvirke metabolske avhengighet av en kreftcelle, ved hjelp av nettopp utviklet isogene cellelinjer. Studier avslørt genekspresjonssignaturer i
PIK3CA
mutante celler som indikerer en konsistent oppregulering av glykolyse. Interessant, genene opp- og ned-regulert variert mellom isogene modeller som tyder på at den primære noden for regulering er ikke det samme fra modell til modell. Andre genuttrykk endringer ble også observert, noe som tyder på at metabolske veier enn glykolyse, for eksempel glutaminolysis, ble også berørt. Nutrient avhengighetsstudier viste at veksten av
PIK3CA
mutante celler er svært avhengig av glukose, mens glutamin avhengighet er uavhengig av
PIK3CA
status. I tillegg glukose avhengighet utstilt ved
PIK3CA
mutante celler kan ikke overstyres av kosttilskudd med andre næringsstoffer. Denne spesifikke avhengighet av glukose til vekst ble ytterligere illustrert ved studier for evaluering av effektene av målrettet avbrytelse av glykolysen ved hjelp av siRNA og ble også funnet å være til stede i et større panel av cancercellelinjer husing endogene
PIK3CA
mutasjoner. Avslutningsvis har vi funnet at
PIK3CA
mutasjoner føre til en dreining mot en svært glycolytic fenotype, og det til tross for forslag at kreftceller er flinke til å utnytte alternative næringskilder,
PIK3CA
mutante celler er ikke i stand til å kompensere for glukose uttak. Forstå metabolske avhengig av
PIK3CA
muterte kreftformer vil gi viktig informasjon for utforming av effektive behandlinger og tumor visualiserings strategier
Citation. Foster R, Griffin S, Grooby S, Feltell R, Christopherson C, Chang M, et al. (2012) Multiple Metabolsk Endringer Eksisterer i Mutant PI3K Kreft, men Bare Glukose er viktig som en næringskilde. PLoS ONE 7 (9): e45061. doi: 10,1371 /journal.pone.0045061
Redaktør: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, USA
mottatt: 17 februar 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Foster et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien fikk ingen ekstern finansiering. Arbeidet ble i sin helhet finansiert av Horizon Discovery Ltd og Celera Corporation som en del av en intern forskningsprogram. Study design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet ble utført av ansatte i Horizon Discovery Ltd og Celera Corporation
Konkurrerende interesser:. Rebeccca Foster, Sue Griffin, Suzanne Grooby, Ruth Feltell og Chris Torrance er alle ansatte i Horizon Discovery Ltd. Chris Torrance er co-grunnlegger av Horizon Discovery Ltd og sitter i styret. Cindy Christopherson, Monica Chang, John Sninský og Shirley Kwok er alle ansatte i Celera Corporation. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
PI3K-AKT-mTOR veien er en viktig onkogen signalveien og som sådan har en sentral rolle i regulering av celleproliferasjon, celleoverlevelse, kreftcelleinvasjon og metastase [1] – [3]. Hyper-aktivering av veien er vanlig i humane kreftformer, og kan oppnås på en rekke måter, inkludert mutasjon av
PIK3CA
.
PIK3CA
, genet som koder for alfa katalytiske subenhet av kinase, er mutert hos omtrent 15% av kolorektal tumorer og ca 30% av brystkreft, med de fleste mutasjoner skjer på tre hotspots,
E542K
,
E545K Hotell og
H1047R product: [4] – [9]. De to første hotspot mutasjoner,
E542K Hotell og
E545K
, er funnet i ekson 9, som ligger innenfor den spiralformede domene, mens
H1047R
, den mest utbredte mutasjon i bryst kreft, finnes i exon 20, som ligger innenfor kinase domene. Mutasjoner i begge regionene føre til konstitutiv aktivering av PI3K-AKT-mTOR signale [3], [5], [10].
PI3K-AKT-mTOR veien ikke bare regulerer celleproliferasjon og celleoverlevelse, men er en viktig vei i kontroll og regulering av kreft metabolismen [2], [11] – [15]. Integreringen av metabolske forandringer med spredning signalering er avgjørende for overdragelse et konkurransefortrinn på en kreftcelle, noe som resulterer i onkogenese og metastase.
Sammenlignende gen-ekspresjon analyse ble utført i et sett av gener som representerer forskjellige metabolske veier ved bruk av (A ) den MCF10A PI3Kα isogen par (+ /+ og H1047R /+) og (B) HCT116 PI3Kα isogen par (+/- og H1047R /+). Ox fosf, oksidativt phosphorytion; PPP, pentosefosfateveien pathway. Replikere datasett har vært gjennomsnitt og genuttrykk endringer for PI3Kα muterte cellene er representert som fold-endring i forhold til PI3Kα villtype celler. Ulike glykolyse gener var oppregulert som følge av
PIK3CA
mutasjon i de ulike cellemodeller.
Metabolsk tilpasning av kreftceller er et velkjent fenomen, med studier av Otto Warburg som viste kreftceller forbruker glukose ved en forhøyet hastighet, selv i nærvær av oksygen, gjenværende seminal til feltet (gjennom [16] – [18]). Metabolske forandringer ikke bare føre til endringer i energiproduksjon, men er nøkkelen for å regulere produksjonen av makromolekylære byggeklosser som kreves av en celle og for opprettholdelse av redoks-balanse [16], [19] – [22]. Selv om aerob glykolyse (Warburg-effekten) er den mest utbredte dokumentert metabolsk aktivitet i tumorer og kreftcellelinjer, videre reaksjonsveier slik som mitokondrie glutamin og metabolisme av fettsyrer samvirker for å fremstille makromolekylene som trengs for å understøtte vedvarende cellevekst. Faktisk bidrar glutamin til mange sentrale metabolske oppgaver voksende kreftceller og er ofte bare anses som sekundære til glukose i form av betydning i tumor celle metabolisme. Glutamin er den mest tallrike aminosyren i humant plasma, og kreftceller metabolisere glutamin i overkant av en hvilken som helst annen aminosyre [23] – [25]. Tross, har en rekke publiserte studier knyttet andre aminosyre avhengig med metabolske effekter og overlevelse av kreft celler [26] – [28]. Disse næringsStudier viser komplekse og litt fleksibel natur svulst metabolisme, siden kreftceller kan ikke bare tilpasse seg og veksle mellom ulike metabolske veier, men har også samtidig tilgang til flere næringsstoffer.
PI3K signalveien, hovedsakelig gjennom dens virkning på AKT og mTOR, har vært forbundet med regulering av en rekke metabolske effekter, deriblant glukoseopptaket, stimulering av Warburg-effekten, og forbedret syntese av lipider og proteiner, [11], [29], [30]. AKT aktivering for eksempel er blitt vist å stimulere glykolyse ved å øke ekspresjon og membrantranslokasjon av den glukosetransportør GLUT4. Aktiv AKT fungerer også via GSK3p å regulere glykogen syntase og fremme sammenslutning av Hexokinase 2 med mitokondrie membranen, der Hexokinase to lettere kan fosforylere glukose [11], [13], [29] -. [33]
Proteinekspresjon ble vurdert ved Western blotting for å bekrefte genuttrykk av data i både (A) MCF10A PI3Kα isogene par (+ /+ og H1047R /+) og (B) HCT116 PI3Kα isogene par (+/- og H1047R /+ ) av cellelinjer.
Mens historiske studier har vist sammenhenger mellom PI3K-AKT-mTOR sti og metabolisme, modellsystemer som brukes ofte har stolt på sammenligninger mellom cellelinjer som har flere genetiske forskjeller eller brukt over-uttrykk strategier som ikke er representative for pasientkreftgenetikk. Den dominerende fokus for forskning har sentrert på påvirkning av tumor genetikk på glukosemetabolismen. Imidlertid kan genetiske forandringer også diktere alternativ næringsstoff og metabolske avhengigheter.
For å utforske hvordan endogene
PIK3CA
mutasjoner spesifikt endre metabolske veier og for bedre å forstå om noen av disse potensielle endringene etablere terapeutisk målrettes cellulære metabolske avhengigheter, har vi utført fokusert metabolske genekspresjonsanalyser, nærings svitsjing og siRNA eksperimenter ved hjelp av isogene cellelinje modeller som er genetisk identiske, bortsett fra mutasjonsstatus av den endogene
PIK3CA
genet.
Materialer og metoder
Cell Culture
Alle MCF10A og HCT116 X-MAN ™ isogene cellelinjer ble hentet fra Horizon Discovery Ltd (https://www.horizondiscovery.com). Følgende X-MAN ™ isogene cellelinjer ble brukt i denne studien: MCF10A PI3Kα (H1047R /+), heterozygot knock-in på
PIK3CA
kinase domene aktivere mutasjon (HD 101-011); MCF10A PI3Kα (E545K /+), heterozygot knock-in på
PIK3CA
spiraldomene aktivere mutasjon (HD 101-002); HCT116 PI3Kα (+/-), knock-out av
PIK3CA
kinase domene mutant allel (
H1047R
) i heterozygote foreldre celler (HD 104-007). Foreldrecellelinjer, MCF10A PI3K (+ /+) og HCT116 PI3K (H1047R /+) ble også anvendt. Alle isogene cellelinjer ble opprettet ved hjelp rAAV-mediert homolog rekombinasjon presist og stabilt endre bestemt mål genomisk loci [3], [34]. Alle MCF10A isogene cellelinjer ble holdt i DMEM /F12 media (PAA) supplementert med 5% hesteserum (Invitrogen), 10 ug /ml insulin (Sigma), 0,5 ug /ml hydrokortison (Sigma) og 0,1 ug /ml koleratoksin ( Sigma). MCF10A parentale celler ble også supplert med 20 ng /ml hEGF (R 0,05, ** p 0,01)
MCF10A PI3Kα (+ /+) og MCF10A PI3Kα. (H1047R /+) celler ble dyrket i 120 timer i medium inneholdende 25 mM glukose eller uten glukose som angitt. Alle medier inneholdt 2 mM glutamin. I tillegg, ble celler dyrket uten glukose supplert med enten 0,5 mM fruktose (+ fruct), 10 mM galaktose (+ galact), fettsyre cellekultur supplement (+ FA) eller 0,1 mM asparaginsyre (+ AA). Cellevekst ble vurdert ved hjelp av SRB.
MCF10A PI3Kα (+ /+) og MCF10A PI3Kα (H1047R /+) celler ble transfektert med ikke-målrettede siRNA (NT) og to individuelle siRNA målretting
HK2
ble HK2 A og HK2 B. (A) Cell vekst vurderes 96 timer etter transfeksjon ved hjelp av SRB. Veksten ble målt som en prosentandel av ikke-målrettet kontroll (* p 0,05, ** p 0,01). (B) knockdown av HK2 protein ble bekreftet ved Western blotting. Ht1 Western blotting ble utført for å bekrefte spesifisiteten av knockdown.
Cellelinjer ble dyrket i 120 timer i media som inneholder 2 mM glutamin, og den indikerte konsentrasjonen av glukose og vekst vurdert ved hjelp av SRB. Vekst av hver cellelinje ble uttrykt som en prosent av vekst i 25 mM glukose (* p 0,05, ** p 0,01)
Growth Assays Avhengighet
proliferasjon av celler. i løpet av en 120 timers periode ble evaluert ved bruk av sulphorhodamine B (SRB) analyse [35]. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i triplikat i glukose og glutamin fri DMEM (PAA) supplert med den nødvendige konsentrasjonen av glukose (Sigma) og glutamin (PAA). MCF10A isogene cellelinjer ble også supplert med 5% hesteserum, 10 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrokortison, 0,1 ug /ml koleratoksin og 0,2 ng /ml hEGF. Alle andre cellelinjer ble supplert med 10% føtalt bovint serum bare. Hvor indikert media ble også supplert med 0,5 mM fruktose, 10 mM galaktose, 0,5 ml /l fettsyre cellekultur supplement eller 0,1 mM asparaginsyre (Sigma).
genuttrykkstudier
MCF10A isogen cellelinjer ble sådd ut på 25 cm
2 kolber i DMEM /F12 medium supplert med 5% hesteserum, 10 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrokortison, 0,1 ug /ml koleratoksin og 0,2 ng /ml hEGF. HCT116 isogene cellelinjer ble sådd ut på 25 cm
2 kolber i McCoys 5A media supplert med 10% føtalt bovint serum. Etter 48 timer ble cellene høstet ved trypsinering og RNA utarbeidet etter den RNeasy Kit (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner.
Total RNA ble revers transkribert ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). De transkripsjons nivåer av 45 gener som er involvert i glykolysen, glutaminolysis, pentosefosfateveien pathway, oksidativ fosforylering, og lipidmetabolisme ble kvantifisert ved real-time PCR sammen med tre normaliserings gener (
NUP214
,
PPIG
og
SLU7
). 5 ng cDNA ble anvendt pr PCR. Amplifikasjoner ble utført med
ΔZO5
DNA polymerase i en buffer som inneholder 20 mM Tris pH7.85, 30 mM KCl, 3 mM MgCl
2, 100 mikrometer dA, G, CTP, 200 pM dUTP, 0.8units uracil N-glykosylase, 6% glyserol, 1X ROX, og 0,2x SYBR grønt. Reaksjonene ble amplifisert på Prism 7900 ved hjelp av følgende Syklusparametrene: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 12 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med 95 ° C i 20 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. En referanse basseng (Universal Menneskelig Reference RNA, Stratagene) på 2,5 ng ble forsterket med hvert gen. Alle amplifikasjoner ble utført i duplikat.
Genekspresjon ble bestemt ved anvendelse av 2 (-ΔΔCt) metoden beskrevet av Livak og Schmittgen [36]. Uttrykket av et gen i
PIK3CA
mutante celler i forhold til
PIK3CA
villtype celler ble bestemt ved hjelp av formelen 2
(ΔΔCt PI3K mutert-ΔΔ Ct PI3K WT).
Western blotting
Celler ble lysert i TG lysis buffer på is og proteinkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av BCA proteinanalyse (Sigma). Like mengder protein ble fylt på 10% Bis-Tris-geler løses ved hjelp av SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membran (Invitrogen). Membranene ble blokkert i 5% vekt /volum fettfri tørrmelk, 1 x Tris-bufret saltvann, 0,1% Tween-20 i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert i primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Følgende antistoffer ble brukt: anti-GLUT1 (1:5000 fortynning, Epitomics 2944-1), anti-GLUT5 (1:500 fortynning, Santa Cruz ac-271055), anti-Hexokinase 1 (1:500 fortynning, Cell Signal Technology 2804), anti-Hexokinase 2 (1:500-1000 fortynning, Cell signale Technology 2106), anti-MCT4 (1:500 Millipore AB3314P), anti-fosfor-AKT (1:1000; Cell signale Technology 9271) og anti -β-aktin (1:500 000, Sigma A5441). Deretter ble membranene inkubert med de passende sekundære antistoff (Cell Signal Technology) i 1 time ved romtemperatur. Proteiner ble oppdaget ved hjelp av ECL-Plus (GE Healthcare) og eksponering for å filme.
siRNA Studier
ON-TARGETplus ikke-måls basseng siRNA (Dharmacon # D-001810-10-20) og to individuelle ON-TARGETplus siRNA mot Hexokinase 2 (Dharmacon # J-006735-06 og # J-006735-07) ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), etter produsentens anvisninger for fremover transfeksjon. Transfeksjon komplekser ble igjen på celler for 6 timer før du bytter med vekstmedier. Cellevekst ble bestemt 96 timer etter transfeksjon ved bruk av SRB-analyse som beskrevet ovenfor. Hexokinase to knockdown ble bekreftet ved Western blotting som beskrevet, med Hexokinase en uttrykk overvåkes for å bekrefte spesifisiteten av knockdown.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av to-veis ANOVA tester etterfulgt av Bonferroni multippel sammenligningstest. For enkelhets skyld, er p-verdiene representert som p 0,05 (*) eller p. 0,01 (**) bare
Resultater
tilstedeværelsen av en PIK3CA Aktivering Mutasjons Resultater i Gene Expression endringer knyttet med økt glycolytic Avhengighet og Tilleggs Metabolsk Pathway endringer
for å fullkarakter påvirkning av en
PIK3CA
mutasjon på metabolske forandringer som helhet, ble en målrettet genet sett første kompilert, som representerer 45 gener fra forskjellige metabolske veier som glykolyse, oksidativ fosforylering, glutaminolysis, pentosefosfateveien pathway og fettsyremetabolisme. Genekspresjon ble deretter analysert på tvers av replikate RNA prøver, fremstilt fra to isogene modellsystemer. Den første celle modellsystemet var en ikke-tumorigen cancercellelinje par består av MCF10A parentale celler hvori PI3Kα er villtype (WT), PI3Kα (+ /+) og MCF10A celler i hvilke
H1047R
aktiverende mutasjon hadde blitt innført, PI3Kα (H1047R /+). Den andre var en tykktarmskreft cellelinje HCT116, som er heterozygot for
H1047R PIK3CA
mutasjon, PI3Kα (H1047R /+), sammen med celler der mutant allel har vært slått ut til å gjøre cellene funksjonelt WT, PI3Kα (+/-). Analyse av genuttrykk for
PIK3CA
mutante celleprøver i forhold til
PIK3CA
WT-celler viste noen slående endringer i metabolsk genuttrykk nivåer. Mens de nøyaktige genene opp- og ned-regulert i
PIK3CA
mutante celler sammenlignet med
PIK3CA
WT skilte mellom de to cellemodellsystemer, de generelle endringer i genuttrykk var et tegn på økt aerobic glycolytic fenotype innenfor
PIK3CA
mutante celler. Innføring av en aktiverende mutasjon i
PIK3CA
i MCF10A celler førte til en økning i uttrykk av nøkkelen glycolytic enzym
Hexokinase to plakater (
HK2
), og en samtidig reduksjon i uttrykk for fruktose transporter,
GLUT5 plakater (figur 1A). I HCT116 tykktarmskreftcellen bakgrunn, er tilstedeværelsen av en mutert
PIK3CA
resulterte i forhøyet ekspresjon av glukosetransportør,
GLUT1
(figur 1B).
Other genekspresjon endres som en følge av tilstedeværelsen av en
PIK3CA
mutasjon antydet at ytterligere metabolismeveien forandringer kan forekomme. I MCF10A PI3Kα (H1047R /+) celler, fettsyre transporter
SLC27A1
viste redusert uttrykk, med flere gener involvert i oksidativ fosforylering også viser redusert uttrykk (figur 1A). Økning i uttrykket av gener som
asparagin syntetase (bilsportforbund) Hotell og
glutaminase (GLS)
ble konsekvent sett i PI3Kα (H1047R /+) celler, som tyder på forhøyet glutaminolysis (figur 1A og 1B).
endringer i mRNA-ekspresjon ble deretter bekreftet ved proteinnivå, demonstrerer forhøyede nivåer av nøkkel glykolytiske enzymer så som HK2 og GLUT1, og i tillegg avslører oppregulering av laktat transportøren MCT4 i MCF10A PI3Kα ( H1047R /+) celler (figur 2). Aktivering av PI3K veien ble bekreftet i både isogene modeller som vist med AKT fosforylering.
Vekst av PIK3CA mutante celler er selektivt Avhengig Glukose Mens Glutamin er viktig i både WT og PIK3CA mutante celler
resultater fra genuttrykk profilering var forenlig med en rekke endringer i cellenes stoffskifte som følge av mutert
PIK3CA
, spesielt økt glykolyse og endret glutaminolysis. For å undersøke muligheten for at cellene kan være avhengig ikke bare på bestemte reaksjonsveier, men også demonstrere næringskilde avhengighet, undersøkte vi effekten av næringsutarming på cellulær vekst, med fokus på celle avhengighet av glukose og glutamin. Over 120 timer, fullstendig tilbaketrekking av glukose (i nærvær av glutamin) negativt påvirket evnen til MCF10A PI3Kα (H1047R /+) for å spre seg og vokse, samtidig som de har ingen effekt på veksten av MCF10A PI3Kα (+ /+) celler (Figur 3A). Dette Konsekvensene var også til stede for en andre MCF10A cellelinje som inneholder et alternativ
PIK3CA
mutasjon, MCF10A PI3Kα (E545K /+) (figur 3A). Likeledes, en vekst på HCT116 PI3Kα (H1047R /+) ble mer alvorlig påvirket følgende glukose uttømming og tilbaketrekking enn HCT116 PI3Kα (+/-) celler (Figur 3B). Denne observasjonen foreslo at
PIK3CA
WT celler var bedre i stand til å tolerere glukose tilbaketrekking enn
PIK3CA
mutante celler, om enn i nærvær av glutamin. For bedre å forstå involvering av glutamin, utførte vi en matrise av studier, evaluere glukose uttømming og uttak i forbindelse med glutamin uttømming og tilbaketrekning. Veksten av MCF10A celler, uavhengig av
PIK3CA
mutasjonstatus ble alvorlig kompromittert ved fullstendig tilbaketrekking av glutamin, selv i nærvær av glukose (figur 3C). Delvis uttømming av glutamin også negativt påvirket veksten av cellene, men omfanget av avhengighet synes ikke å relatere til
PIK3CA
mutasjonsstatus. Tilsvarende komplett glutamin tilbaketrekking alvorlig kompromittert vekst av HCT116-celler. I motsetning til MCF10A celler, HCT116-celler var bedre i stand til å tolerere et mellomliggende nivå av glutamin tilbaketrekning, med ingen veksthemming sett i enten
PIK3CA
WT eller muterte celler (Figur 3D). Mønsteret av glukose følsomhet ble opprettholdt med dette mellomnivået glutamin (figur S1).
The Glucose Dependency utstilt ved PIK3CA mutante celler kan ikke overstyres av Tilskudd med andre næringsstoffer
For å videre karakteriserer glycolytic fenotype og tydelig glukose avhengighet av
PIK3CA
mutante celler, vi brukte MCF10A isogen modellsystem for å vurdere om alternative næringskilder kan kompensere for glukose og overstyre avhengighet. Bytte næringskilde til en alternativ monosakkarid (fruktose eller galaktose) var ikke i stand til å kompensere for glukose uttak i MCF10A PI3Kα (H1047R /+) celler, mens veksten av MCF10A PI3Kα (+ /+) celler forble upåvirket av fjerning av glukose eller næringsstoff veksling (figur 4). Siden genuttrykk data antydet at
PIK3CA
mutante celler kan ha endringer i andre enn glykolyse metabolske veier, vi videre undersøkt om glukose vekst avhengighet kan overstyres ved å supplere med næringsstoffer som kan fremme disse alternative veier. Basert på genekspresjon endringer i aspargin-syntetase og fettsyre transportører, supplert vi cellene med asparaginsyre eller en blanding av fettsyrer. Verken supplement var i stand til å overstyre effekten av uttak av glukose på veksten av MCF10A PI3Kα (H1047R /+) celler (figur 4). Lignende resultater ble sett når MCF10A PI3Kα (E545K /+) og HCT116 PI3Kα (H1047R /+) celler ble profilert (figur S2).
Forstyrrelse av glykolysen Demonstrerer Anti-proliferative effekter i PIK3CA mutante celler
MCF10A PI3Kα (H1047R /+) celler som viser et høyt nivå av glukose avhengighet og er ikke i stand til å kompensere for fravær av glukose ved å benytte andre næringsstoffer. I forbindelse med våre data som viser at
PIK3CA
mutante celler viser økt ekspresjon av nøkkelen glykolysen enzymet HK2, hypotese vi at forstyrrelse av glykolysen bør være tilstrekkelig, selv i nærvær av glukose, for å hemme veksten av mutante celler. Vi vurderte derfor effekten av målrettet forstyrrelse av glykolyse bruke to siRNA-molekyler til knockdown nivåer av HK2 i MCF10A isogene celler. Ved hjelp av en ikke-målrettede siRNA molekyl som en kontroll, fant vi det bestemte HK2 knockdown gjør faktisk resultere i anti-proliferative effekter, selektiv for
PIK3CA
mutante celler (figur 5A). Knockdown av HK2 proteinnivåer i både
PIK3CA
WT og mutante cellelinjer ble bekreftet ved Western blotting (figur 5B), med spesifisitet knockdown bekreftet ved å overvåke Ht1 uttrykk.
Glukose Avhengighet er sett i andre kreftcellelinjer Harbouring Endogen PIK3CA Mutasjoner
Våre undersøkelser har brukt en presis og genetisk definert system for å undersøke effektene av en
PIK3CA
mutasjon på cellenes stoffskifte i isolasjon. Vi har utvidet våre studier for å forstå hvorvidt disse funnene var sant over et bredere panel av kreftcellelinjer. Vi bestemte derfor glukose vekst avhengighet av seks tykktarm og brystkreft cellelinjer, alle med endogen
PIK3CA
mutasjoner (tabell 1). Men disse linjer har også den forbeholdet av å ha en rekke andre genetiske forskjeller, noe som kan modulerer eller omgå den antatte glukose avhengighet bestemt i isogene cellesystemer. I hvilken grad veksten ble påvirket variert mellom linjene, med tre av de 6 cellelinjer (T47D, BT20 og DLD-1) som viser redusert vekst etter delvis glukose mangel (figur 6). Men veksten av alle 6 cellelinjer ble svekket av fullstendig tilbaketrekking av glukose selv i nærvær av glutamin, støtter ideen om at
PIK3CA
mutante kreft er sterkt avhengig av glukose for å støtte cellevekst.
diskusjon
Interessen for å studere kreft metabolisme og utvikle metabolske målrettede midler som terapi har vokst de siste årene, og så en bedre forståelse av den unike metabolismen av kreftceller er avgjørende for effektiv drug design og rasjonell behandling av pasienter , samt merket næringsstoff visualisering og behandlingsrespons overvåking. Til tross for aktivering av PI3K-AKT-mTOR-ledningen er et felles trekk ved mange kreftformer, og aktivering av denne veien blir i forbindelse med regulering av en rekke metabolske effekter, omfattende profilering av konsekvensen av
PIK3CA
mutasjoner på metabolsk avhengigheter er ikke undersøkt. Ved å bruke genetisk definerte isogene cellemodeller, har vi vært i stand til å presisere hvordan
PIK3CA
mutasjoner kan påvirke metabolske veier innenfor en svulst.
Regulering av metabolske prosesser og næringsutnyttelse er komplekse prosesser. Genekspresjonsanalyse i denne studien har avdekket at den samlede konsekvensen av
PIK3CA
mutasjoner er en dreining mot økt glycolytic fenotype. Imidlertid kan den nøyaktige måten en celle effekter dette skiftet variere. Snarere enn en enkelt hastighetsbegrensende molekyl, kan flere trinn skape en regulatorisk pathway «dele homeostatic kontroll av energiomsetningen. Multi-trinns regulering ble markert med differensial genet oppregulering av nøkkel glykolyse enzymer i de forskjellige isogene modeller. Selv om forskjeller ble sett, er nettoeffekten tyder på oppregulering av glykolyse i begge tilfeller. Denne koblingen mellom pasient relevante
PIK3CA
mutasjoner og resulterer glycolytic fenotype er i samsvar med tidligere studier som har knyttet aktivering av AKT signalveien med å stimulere Warburg effekten [11], [13]. Dette konseptet er bygget på og styrket av å ha avslørt en klar avhengighet av
PIK3CA
mutante celler på glukose for fortsatt vekst. Til tross for forslagene som kreftceller er flinke til å utnytte andre næringskilder, har denne studien viste at
PIK3CA
mutante celler ikke er lett i stand til å kompensere for glukose uttak, enten ved bruk av glutamin, alternative monosakkarider eller andre næringsstoffer. Avhengighet av glukose for vekst ble også vist over et bredere panel av kreftcellelinjer husing endogene
PIK3CA
mutasjoner. Resultatene av denne studien kan gi viktig informasjon for å designe terapeutiske strategier, siden de har markert viktige noder i metabolske veier som kan være nøkkelen til å målrette. Faktisk, bekreftet knockdown studier som rettet mot glykolysen for avbrudd resultater i anti-proliferative effekter, spesifikke for
PIK3CA
mutante celler, noe som tyder på at dette kan være et terapeutisk strategi for spesielt rettet mot pasienter med
PIK3CA
mutante svulster. Utilslørt glukose avhengighet av celler med denne mutasjonen har også ruter for non-invasiv avbildning av PI3K-pathway aktivert svulster.
Gjennom karakterisering av metabolsk fenotype av genetisk matchet isogene celler, har vi vært i stand til å definere den metabolske konsekvensene av en enkelt konstruert genetisk forandring, i dette tilfellet en aktiverende mutasjon i
PIK3CA
genet. Mens bekrefter at aktivering av PI3K-AKT-mTOR sti fører til økt glycolytic fenotype, har vi også demonstrert en spesifikk avhengighet for
PIK3CA
muterte cellene på glukose og illustrert som målgruppe denne veien tilbyr terapeutisk potensial og tumor bildebehandling innsikt.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Glukose følsomheten HCT116 PI3Kα (H1047R /+) celler ble opprettholdt da dyrket i 0,5 mM glutamin medier. HCT116-celler isogene (+/- og H1047R /+) ble dyrket i 120 timer i media inneholdende 0,5 mM glutamin og de indikerte konsentrasjoner av glukose. Cellevekst ble vurdert ved hjelp av SRB farging. Veksten av hver cellelinje er uttrykt i forhold til veksten i media som inneholder 0,5 mM glutamin og 25 mM glukose
doi:. 10,1371 /journal.pone.0045061.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
glukose avhengighet av
PIK3CA
mutant celler ikke kan overstyres av kosttilskudd med alternative næringsstoffer. MCF10A PI3Kα isogene celler (+ /+ og E545K /+) og HCT116 isogene celler (+/- og H1047R /+) ble dyrket i 120 timer i media inneholdende 2 mM glutamin og de indikerte konsentrasjoner av glukose (A og B henholdsvis). I tillegg, ble celler dyrket uten glukose supplert med enten fettsyre cellekultur supplement (+ FA) eller 0,1 mM asparaginsyre (+ AA). Cellevekst ble vurdert av SRB farging
doi:. 10,1371 /journal.pone.0045061.s002 plakater (TIF)
