Abstract
RB1
-inducible coiled-spole 1 (RB1CC1, også kjent som FIP200) spiller en rolle i forbedringen av RB1 sti gjennom direkte binding til en GC-rik region 201bp oppstrøms (fra initiering ATG) i
RB1
promoter. Her har vi identifisert hSNF5 og p53 som bindende partnere RB1CC1 ved immunoutfelling og immunfluorescens analyser. Interaksjon mellom disse molekyler og den RB1 reaksjonsveien ble analysert ved hjelp av analysene av kromatin immunoutfelling, luciferase reporter-, revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon, og immunoblot. Tumorveksthemming av RB1CC1 ble evaluert ved flow cytometri eller av et cellevekstanalyse. Atom RB1CC1 kompleks involverer hSNF5 og /eller p53 aktivert transkripsjon av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
, og undertrykte tumorcellevekst. Videre atom RB1CC1 uttrykk signifikant korrelert med de av RB1 og p16 i brystkreft vev
in vivo
, og Ki-67 spredning indeksen var avhengig av p53 samt RB1CC1. Denne studien viser at RB1CC1 sammen med hSNF5 og /eller p53 øker RB1 vei gjennom transcriptional aktivering av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. Evaluering av RB1CC1 uttrykk kombinert med RB1 og p53 status forventes å gi nyttig informasjon i klinisk praksis og fremtidige terapeutiske strategier i brystkreft
Citation. Chano T, Ikebuchi K, Ochi Y, Tameno H, Tomita Y, Jin Y, et al. (2010) RB1CC1 Aktiverer RB1 Pathway og hemmer spredning og Cologenic overlevelse i Human Cancer. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10,1371 /journal.pone.0011404
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 09.11.2009; Godkjent: 09.06.2010; Publisert: 30 juni 2010
Copyright: © 2010 Chano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av KAKENHI (Grant-i-Aid for Scientific Research på Prioriterte områder, nr 20012025) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan; og den japanske Society of laboratoriemedisin Fond for fremme av vitenskapelig forskning. Disse finansieringskilder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
retinoblastom tumor suppressor protein (RB1) regulerer G1 /S-fase cellecyklusprogresjonen og er en kritisk formidler av antiproliferativ signalering. Selv om fosforyleringen spiller en viktig rolle i den funksjonelle regulering av RB1, den transkripsjonelle regulering av RB1 er mye mindre kjent [1]. RB1-induserbar coiled-spole 1 (RB1CC1: symbolet som brukes her, som er godkjent av Human Genome Organization [HUGO] Gene Nomenclature Committee, det er også kjent som FIP200, brennvidde heft kinase familie samspill protein på 200 kDa) ble identifisert som en RB1 vei regulator som spesielt forbedrer
RB1
transkripsjon [2], [3]. Nylig har vi vist at atom RB1CC1 binder seg til en GC-rik region oppstrøms 201bp (fra initiering ATG) av RB1-promoteren og aktiverer ekspresjon av RB1 [4]. En genetisk omorganisering av
RB1CC1
har også blitt foreslått å være involvert i tumordannelse av brystkreft [3], [5]. Interessant nok har det blitt rapportert at RB1CC1 binder og stabiliserer p53 [6], som tyder på at RB1CC1 kan være en viktig mediator som forbinder de RB1 og p53-trasé. Vår studien undersøker mekanismen for RB1CC1 forbedring av RB1 pathway. RB1CC1 danner et kompleks med p53 og /eller hSNF5, en kromatin-remodeling faktor, i cellekjerner, og aktiverer transkripsjon av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. I tillegg atom RB1CC1 korrelerer signifikant RB1 og p16 uttrykk i brystkreft vev
in vivo
.
Resultater
RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53
Vi først forsøkt å identifisere RB1CC1-bindende proteiner i MCF-7 brystkreftceller ved en immunoutfelling assay fulgt av væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS). En kromatin remodelle faktor, hSNF5 (også kjent som BAF47 eller INI1) var co-immunopresipitert med RB1CC1 (Fig. 1a). Den pull-down-analyse ved bruk av RB1CC1 deletion-mutanter viste at den C-terminale region av RB1CC1 (aa 1364-1594) var nødvendig for interaksjon med hSNF5 (Fig. 1 B og C). Den N-terminale ende av RB1CC1 interagerer med p53 [6], så vi betraktet som RB1CC1 kan danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53 for å hemme tumorvekst. Den kompleksdannelse mellom RB1CC1, hSNF5 og p53 ble evaluert ved immunoutfelling og immunofluorescens-analyser. RB1CC1, hSNF5 og p53 ble co-immunopresipitert med to typer antistoffer som gjenkjenner ulike områder av RB1CC1 (aa 25-271 og 549-817.); sammensetningen av hver av de utfellinger er forskjellig, sannsynligvis på grunn av de foretrukne fraksjonene til hvert antistoff (Fig. 1D). RB1CC1-1 og -2 antistoffer har hatt en tendens til å binde mer fortrinnsvis til de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner, henholdsvis. hSNF5 og rikelig atom p53 (som kan være mer fosforylert og sakte mobilisert i PAGE) kan være foretrukket co-utfelt med kompleks mellom atom RB1CC1 og RB1CC1-1 antistoff. Gjensidig, kan RB1CC1-2 antistoff dominant binde seg til rikelig cytoplasma RB1CC1 samt hSNF5 og noen av p53 i cytoplasma. RB1CC1, hSNF5 og p53 ble ko-lokalisert i cellekjerner med unntak av nucleoli (figur 1E og F,.. Fig S1). Dataene indikerte at RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53 hovedsakelig i cellekjerner.
(A) MCF-7-cellelysatene ble immunopresipitert (IP) med anti-RB1CC1 antistoff og analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av sølvfarging. Molekylet som co-immunopresipitert med RB1CC1 ble identifisert som hSNF5 ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS). (B) Flag-RB1CC1 og HA-hSNF5 var co-transfektert inn HEK293 celler. Lysatene ble immunopresipitert med anti-Flag eller anti-HA-antistoff og analysert ved immunoblot som angitt. Pilspisser indikerer co-immunopresipitert signaler. (C) HEK293 celler ble transfektert med både HA-hSNF5 villtype (full) og Flag-RB1CC1 varianter; villtype (wt), DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC. Skjematiske tegninger av RB1CC1wt og mutanter er også indikert på venstre side. Rektangelet viser bindingssetet for hSNF5, og den ødelagte rektangelet viser at for p53. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-HA-antistoff og immunoblottet som angitt. (D) MCF-7-lysater ble immunopresipitert med to typer anti-RB1CC1 antistoff og analysert ved immunoblot. (E) RB1CC1 (grønn), hSNF5 (rød), p53 (blå) og det sammenslåtte bildet i HeLa celler. Hvert protein immunofluorescently merket med Alexa 488, 594 eller 350 kroner. Scale bar, 50 mikrometer. (F) RB1CC1 (grønn), DAPI og det sammenslåtte bildet i HeLa celler. RB1CC1 er immuno-merket med Alexa 488, og DAPI vises med blå fluorescens i cellekjerner. Scale bar, 50 mikrometer.
RB1CC1 binder seg til og aktiverer arrangører av RB1, p16 og p21, samarbeider med p53 og /eller hSNF5
RB1CC1 [2], [4] , [6] og hSNF5 [7], [8], [9], [10] forsterke transkripsjon av de som er involvert i RB1 pathway molekyler, så vi undersøkt hvorvidt RB1CC1, hSNF5 og p53 binder til promoter-regionene i
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. Kromatin immunoutfellingsstudier (chip) analyser ved hjelp av antistoffer mot RB1CC1, hSNF5 og p53 indikerte at promotor fragmenter av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
, som ble forsterket fra HeLa celle kromatin ble utfelt ved hvert antistoff (fig. 2A), noe som tyder på at molekylene blir rekruttert til promoter-regioner av RB1 pathway. Involvering av disse tre molekylene i uttrykket av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
ble validert ved å innføre sh-RNA for
RB1CC1 plakater (sh –
RB1CC1
),
hSNF5 plakater (SH-
hSNF5
) og
p53
(SH-
p53
) i HeLa-celler . Knockdown effekter på
RB1CC1
,
hSNF5
,
p53
,
p21
,
p16 Hotell og
RB1
mRNA-ekspresjon ble analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR. SH-
RB1CC1 Hotell og SH-
hSNF5
redusert mRNA nivåer av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
, mens SH-
redusert p53
bare
p21
mRNA (fig. 2B). Med andre ord, er RB1CC1 og hSNF5 nødvendig for å opprettholde transkripsjoner av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
, mens p53 er spesielt nødvendig for transkripsjon av
p21
. RB1CC1 aktivert arrangører av betydelig
RB1
,
p16 Hotell og
p21 plakater (figur 2C.), Og knockdown av RB1CC1 undertrykte dem (fig. 2D). Disse promoter forbedringer av RB1CC1 ble sammenlignet blant HeLa, TTC642 (hSNF5-null) og H1299 (p53-null) celler, for å validere kravet om hSNF5 eller p53 når RB1CC1 aktiverer
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. RB1CC1 var ikke i stand til å gi betydelig forbedring av
RB1 Hotell og
p16
arrangører i TTC642 celler, og spilte bare en liten rolle i
p16 Hotell og
p21
transkripsjon i H1299 celler (fig. 2E). Med tanke på RB1 vei initiert av RB1CC1 krever RB1CC1 hSNF5 for forbedring av
RB1 Hotell og p53 for forbedring av
p21
transkripsjoner, men begge hSNF5 og p53 er nødvendig for RB1CC1 forbedring av
p16
transkripsjon. I sammendraget, krever RB1CC1 samspill med både hSNF5 og p53 å gi en sterk aktivering av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
arrangører.
(A ) Chromatin immunoprecipitation (chip) analysen ble utført i HeLa celler. Den kromatin ble immunopresipitert med anti-RB1CC1, anti-p53, eller anti-hSNF5 antistoff. Hver utfelt DNA ble analysert ved kvantitativ og semi-kvantitativ PCR hjelp av promoter-spesifikke primere for
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. Signal intensiteter ble definert basert på de som stammer fra inngang DNA (2NG /mikroliter) av HeLa-celler, som ble satt som 1000. (B) Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført ved den enkelte syklus nummer for hver avskrift i HeLa-celler behandlet med shRNA for
RB1CC1
,
hSNF5
eller
p53
. SH-
GL3
, SH-
p21 Hotell og SH-
p16
ble brukt som kontroller. Parentes indikerer PCR-syklusnummer. (C-D) I HeLa-celler, luciferase aktivitet av arrangøren for
RB1
,
p16 Hotell og
p21
økt betydelig ved transfeksjon av plasmid som uttrykker RB1CC1 (RB1CC1wt) (
C
) og redusert markert på knockdown av RB1CC1 hjelp SH-
RB1CC1
-1 og -2 (
D
), sammenlignet med celler transfektert med pcDNA eller sh-RNA krafse, henholdsvis, som kontroller. Verdiene angir gjennomsnitt ± standardfeil fra kvadruplikat-eksperimenter. (t-test; stjerne (*) indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom pcDNA og RB1CC1wt eller mellom krafse og SH-
RB1CC1 product: *, p. 0,05, og **, p 0,01). Effektiviteten av over-ekspresjon eller knockdown av RB1CC1 ble bekreftet ved Western blot som angitt i de øvre paneler. (E) etter innføringen av RB1CC1wt, luciferase aktiviteter av arrangører for
RB1
,
p16 Hotell og
p21
ble sammenlignet blant HeLa, TTC642 (hSNF5-null) og H1299 (p53-null) celler. Stjerner (**) indikerer statistisk signifikante forskjeller (t-test, p 0,01). Mellom HeLa og TTC642 eller mellom HeLa og H1299
RB1CC1 aktiverer RB1 sti og undertrykker tumorvekst
for å vurdere om RB1CC1 forbedrer RB1 veier å undertrykke kreftcellevekst, ble HeLa-celler lentivirally transduced med
RB1CC1
cDNA eller shRNA. Ektopisk uttrykk for RB1CC1 økt proteinnivå p53, p21, p16 og RB1, og hemmet cellevekst (Fig. 3A og B, venstre panel). I motsetning til dette knockdown av endogent RB1CC1 ved SH-
RB1CC1
reduserte nivåene av p53, hSNF5, p21 og p16, og forbedret cellevekst (Fig. 3A og B, høyre panel). De samme eksperimenter i to brystcancercellelinjer (MCF-7 og SK-BR3) ga lignende resultater (fig. S2A-D). I
RB1CC1
-transduced celler, ble antall G0 /G1-fase-celler økte samtidig med reduksjon av antall celler i S og G2 /M faser. Innføring av SH-
RB1CC1
redusert G0 /G1 befolkningen og økte bestander av celler i S og G2 /M. (Fig 3C;. Fig. S2E)
(A) HeLa-celler ble lentivirally transduced med
RB1CC1
eller SH-
RB1CC1
. Lysater ble immunoblottet som angitt. (B) Vekst analyser i HeLa celler transduced som i
en
. Dataene ble kvantifisert fra triplikate eksperimenter (nedre kolonne). Representative immunoblotter, plater og mener koloni tall ± standardfeil vises. (C) Etter lentiviral modifisering av RB1CC1 uttrykk, ble NIH3T3 celler analysert ved flow-cytometri.
RB1CC1 Hotell og SH-
RB1CC1
er merket med en rød (til venstre) og blå (til høyre), henholdsvis. Dataene (gjennomsnittlig prosentandeler ± standardavvik) ble bekreftet i triplikate eksperimenter, og en representant strømningscytometrisk grafen er demonstrert. pLenti6 og sh-GL3 ble anvendt som kontroller. Pilene viser at økninger (opp-pilen) og reduserer (nedoverpil) var statistisk signifikant i henhold til t-test; p. 0,05 (D) RB1CC1, hSNF5 og p53 skjemaet transkripsjonskomplekset i cellekjerner, og aktiver
RB1
,
p16 Hotell og
p21
til sammen de ovennevnte data indikerte at RB1CC1 dannet et kompleks med hSNF5 og /eller p53, og globalt aktivert transkripsjon av
RB1
,
p16 Hotell og
p21 product: (fig. 3D).
uttrykks analyse av de involverte i RB1CC1-RB1 veien i brystkreft molekyler
in vivo
for å vurdere sammenhengen mellom den proliferative aktivitet, og det ovennevnte RB1CC1 vei av RB1 aktivering involverer p53 og hSNF5 i tumorvev
in vivo
, evaluerte vi den uttrykksmessige status for RB1CC1, RB1, p16, p21, Ki-67, p53 og hSNF5 i 59 tilfeller av brystkreft. Fire tilfeller av RB1 nullizygotes indikerte en høy Ki-67 spredning index (gjennomsnitt ± standardfeil = 69,7 ± 6,6%). Immunreaktiviteten av p53-henvise til p21 ekspresjon-ble delt inn i to kategorier, «normal» (p53nor) for svak farging og «unormale» (p53ab) for sterk farging, noe som sterkt indikerte at mutant p53-protein ble akkumulert. Det var 41 og 14 tilfeller av p53nor og p53ab, henholdsvis i denne serien. hSNF5 ble svært opprettholdt i brystkreft, uavhengig av RB1CC1 eller p53 status (data ikke vist). De immunhistokjemiske resultater for RB1CC1 ble kvantitativt gradert som I-III. Grad III, uttrykker RB1CC1 rikelig i cellekjerner, ble registrert som RB1CC1 (+), mens karakterer I-II uten kjernefysiske RB1CC1 ble registrert som (-) (Fig. 4A). Som rapportert tidligere [4], ble uttrykket av RB1 ganske godt korrelert med RB1CC1 uttrykk i de tilfeller som er spilt inn som RB1CC1 (+) og var høyere enn i RB1CC1 (-) tilfeller (Fig. 4B, venstre). p16 uttrykk ble også positivt korrelert med atom RB1CC1 uttrykk (Fig. 4B, 2
nd venstre). Merking indekser av p21 og Ki-67 i p53nor tilfeller – men ikke i p53ab tilfeller – var godt korrelert med uttrykket status for RB1CC1 (Fig. 4B, 3
rd venstre og høyre). Sammen, ble ekspresjonen av status RB1CC1 og p53 assosiert med økt uttrykk for RB1, p16 og p21, som i sin tur påvirket Ki-67 indeksen for spredning aktivitet i kliniske brystkreft. Derfor immunhistokjemisk status av RB1 og p53, så vel som for RB1CC1 bør være gode prediktorene for den proliferative aktivitet; dermed kunne RB1CC1-RB1 vei demonstrert i våre eksperimenter spille en betydelig rolle i utviklingen av kliniske brystkreft
(A) immunhistokjemiske graderinger av RB1CC1 ble klassifisert som I-III. I, negative flekken i både cytoplasma og kjerner; II, positiv flekken bare i cytoplasma og negativ i kjerner; III, positiv flekken i kjerner og /eller cytoplasma. Karakterer III, uttrykker RB1CC1 rikelig i cellekjerner, ble registrert som RB1CC1 (+), mens karakterer I-II uten kjernefysiske RB1CC1 ble registrert som RB1CC1 (-). Scale bar viser 50 pm. (B) Sammenheng mellom RB1CC1 og RB1, p16, p21 eller Ki-67 i p53normal (øvre grafer) og unormale (lavere grafer) tilfeller. RB1CC1 (-) eller (+) status vises på den horisontale linjen, og hver merking indeksen indikeres på en vertikal linje i grafene. En unormal p53 status ble definert som et tilfelle av brystkreft når mer enn 50% av tumorcellene var sterkt positive for p53, mens mindre enn 10% av cellene var positive for p21. Et slikt tilfelle meget indikerte at mutant p53-protein ble akkumulert, og at de intakte funksjonene til p53 (som transkripsjonen aktivering for
p21
) var tap. Elevens
t
-test ble brukt til å evaluere sammenhenger (*, p 0,05, og **, p 0,01)
Diskusjoner
RB1CC1 er. en roman regulator av RB1 som dephosphorylates RB1 [2], [6] og øker dens uttrykk [2], [4]; i tillegg er en genetisk rearrangering av
RB1CC1
kan være involvert i brystkreft tumorigenesis [3], [5]. Mer nylig rapporterte vi at kjernefysisk RB1CC1 aktiverer direkte på
RB1
arrangøren gjennom en 201bp oppstrøms GC-rik region (-201 /U-GCbox) [4]. For å klargjøre mer nøyaktig den molekylære mekanisme av den RB1CC1 virkning, en immunoutfelling assay fulgt av LC-MS /MS ble forsøkt, og en kromatin ombygging faktor, ble hSNF5 identifisert. RB1CC1 interagerer med p53, så RB1CC1 er tenkt å danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53. Det er antatt at RB1CC1 induserer
RB1 product: [2], [4], og at hSNF5 forbedrer
p16 plakater (også kjent som INK4a eller CDKN2A) og /eller
p21
(også kjent som CIP1, WAF1 eller CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. Faktisk har immunoutfellingsstudier og immunfluorescens analyser indikerte at et kompleks mellom RB1CC1, hSNF5 og p53 former i cellekjerner, og chip, kvantitativ RT-PCR og luciferase analyser for
RB1
,
p16
og
p21
har antydet at de koordinerte transkripsjons forbedringer av disse molekylene er påvirket av komplekse inkludert RB1CC1, hSNF5 og p53. Imidlertid RB1CC1, hSNF5 og p53 er ikke like viktig for stimulering av hver av de promotorer av
RB1
,
p16
eller
p21
, mens tre molekyler blir rekruttert for å hver promoter. For eksempel stanse
p53
i HeLa-celler hadde ingen effekt på transkripsjon av
RB1
, og RB1CC1 over-uttrykk kan aktivere
RB1
promoter i H1299 (p53- null-celler). Dette betyr at p53 er ikke egentlig nødvendig for å
RB1
transkripsjon, og at RB1CC1 og hSNF5 kan samarbeide for å aktivere
RB1
transkripsjon. Dermed er alle de tre molekylene ikke alltid nødvendig for aktivering av hver av arrangørene, mens alle tre er nødvendig for koordinerte transkripsjoner av
RB1
,
p16 Hotell og
p21
. Vi har også etablert tidligere at atom RB1CC1 binder seg til og aktiverer
RB1
promoter [4]. Interessant, en punkt-mutasjon i -201 /U-GCbox av
RB1
promoter ble identifisert i en arvelig retinoblastom familie [11]. Det bør påpekes at -201 /U-GCbox av
RB1 Hotell og bindingen transkripsjonen kompleks som inkluderer RB1CC1, hSNF5 og p53 spiller viktige roller i menneskelige kreftutvikling.
I denne undersøkelsen , RB1CC1, i samarbeid med hSNF5 og p53, aktiverer RB1 sti og undertrykker tumor cellevekst. For å aktivere RB1 pathway effektivt, må RB1CC1 uttrykkes i cellekjerner og bør danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53, som foreslått i immunocytokjemiske og immunhistokjemiske data i denne studien. PIASy (en protein-hemmer av aktivert STAT proteiner y) samvirker med den C-terminale ende (aa 1350-1594) av RB1CC1 og rekrutterer et samspill kompleks mellom PIASy og RB1CC1 fra cytoplasma til kjernen [12]. I tillegg PIASy regulerer negativt hos pattedyr målet for rapamycin (mTOR) aktivitet stimuleres ved cytoplasmisk RB1CC1, og positivt aktiverer p53-p21 signalveien sammen med atom RB1CC1 [12]. Disse dataene ser ut til å være kompatibel med våre presenterte data på sublocalization av komplekset består av RB1CC1, hSNF5 og p53. Atom molekylære komplekse, inkludert RB1CC1, hSNF5, p53 og ytterligere PIASy, kan danne en stor transkripsjonen komponent for å aktivere RB1 sti coordinately og undertrykke tumorigenesis i menneskelig brystvev.
Nuclear uttrykk for RB1CC1 kan være viktig for svulst undertrykkelse. Som rapportert tidligere, er RB1CC1 ligger ikke bare i kjernen, men også i cytoplasma [4], [6], [13], [14]. Cytoplasmatiske RB1CC1 har blitt foreslått å være tilsvarende gjær Atg17, og flere studier har indikert at RB1CC1 fungerer som en viktig molekyl i autofagi regulering [13], [14], [15]. Autofagi har vært innblandet i tumorigenesis, men dens presise rolle er tvetydig. Det kan tenkes at autofagi har ulike roller i de ulike stadiene, eller sammenhenger, av tumorigenesis. Young, et al. [16] har rapportert at autofagi formidler mitotisk senescence, et vindu inn tidlig svulst utvikling. Vi foreslår at cytoplasma-kjernefysisk overgang fra RB1CC1 spiller en nøkkelrolle i autofagi-senescence forening. Våre data
in vitro Kjøpe og
in vivo
tyder på at RB1CC1 spiller ulike roller i henhold til sin subcellulære sted. Nuclear RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5, p53 og en hvilken som helst annen komponent som bidrar til transkripsjonen av RB1 veien, noe som indikerer en mulig binding til mitotisk begynnende alderdom. Imidlertid synes cytoplasmatiske RB1CC1 til å spille noen rolle som en tumor suppressor aktivere RB1 veien.
Nuclear RB1CC1 uttrykk signifikant korrelert med de av RB1 og p16 i brystkreft vev
in vivo
, uavhengig av p53 status. Ki-67 spredning indeks og p21 uttrykk ble påvirket av både RB1CC1 og p53, og Ki-67-indeksen også avhengig av RB1 status. Uttrykkene av RB1, p16 og p21 påvirke Ki-67 indeks av proliferativ aktivitet, så immunhistokjemisk status av RB1 og p53, så vel som for RB1CC1 kan forutsi den proliferative aktivitet av tumoren. Foreliggende data antydet at progresjon av brystkreft ble under sterk påvirkning av RB1CC1, samt RB1 og p53 status. Vi forventer at den kombinerte immunhistokjemisk evaluering av RB1, vil RB1CC1 og p53 gi innsikt i deres kliniske applikasjoner, for eksempel mulig bruk som prognostiske biomarkører.
I sammendraget, vi har rapportert her at RB1CC1, kobler RB1 og p53 trasé som en mulig megler, danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53 som forbedrer RB1 veien globalt. Immunhistokjemisk evaluering av RB1 og p53 i kombinasjon med RB1CC1 kan være en nyttig biomarkør i praktiske, rutinemessige kliniske tester og gi en prediksjon av den biologiske oppførsel av bryst svulster og /eller svulster i andre organer.
Materialer og Metoder
Cell kultur
TTC642 ble vennlig levert av legene. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada og Timothy J. Triche (Childrens Hospital Los Angeles, Los Angeles, California). HeLa, HEK293, MCF-7, SK-BR3 og H1299-celler ble anskaffet fra American Type Culture Collection (MD), og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) eller RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum. Alle cellekulturmedier ble supplert med penicillin (50 enheter /ml) og streptomycin (50 mg /ml).
Antistoffer og reagenser
Kanin antisera mot RB1CC1 (aa. 25-271, 549 -817 som hver epitop) ble samlet som tidligere rapportert [4], [17], og det rensede IgG ble anvendt i eksperimentene. Anti-p53 (FL-393) og anti-p21 (F-5) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (CA). Anti-HA (3F10) var fra Roche (Tyskland). Anti-Flag (M2) og anti-tubulin α (DM 1A) ble kjøpt fra Sigma (MO). De andre antistoffer var fra BD Biosciences (CA).
Immunpresipitasjon av protein kompleks etterfulgt av væske chromatography- tandem massespektrometri (LC-MS /MS)
De MCF-7 brystkreft celler ble lysert i EBC lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,25% natrium-deoksycholat, 0,2 mM Na
3VO
4, 100 mM NaF og 1% protease inhibitor cocktail (Wako Chemicals, Japan), og deretter sentrifugert i 20 minutter ved 20 000 x g ved 4 ° C. 5 ml supernatant (~10mg /ml) ble inkubert med 100 ug av anti-RB1CC1 renset IgG primært antistoff ved 4 ° C over natten. De immunkomplekser ble bundet til protein G-agarose (Pierce, IL) i ytterligere 2 timer ved 4 ° C og vasket fem ganger med NETN (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP- 40). Proteinene som er bundet til protein G-Sepharose ble eluert ved tilsetning av Laemmli SDS-prøvebuffer som inneholdt 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% glycerol, 5% 2-merkaptoetanol, 2% SDS og 0,01% bromfenol blå til gelen og koke det for 3 min. Etter sentrifugering ved 10000 x g i 2 minutter, ble supernatanten underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), og de separerte proteiner ble visualisert ved hjelp av sølvfarging. Den sterkt farget bestemt bandet ble i-gel fordøyd med trypsin, og de gjen peptider ble analysert ved hjelp av en elektro ion-felle massespektrometer (LCQ, Finnigan MAT, CA) kombinert online med kapillær HPLC (magiske 2002, Michrom BioResorces, CA) til erverve massespektrometri /massespektrometri (MS /MS) -spektra. Data som stammer fra MS /MS spektra ble brukt til å søke en samlet protein database, som var sammensatt av database NR og en seks-leseramme oversatt EST database, for å identifisere protein ved hjelp av offentlig tilgjengelige programmet Prowl (http: //prowl.rockefeller.edu).
Plasmid DNA og genoverføring
Eksterne og interne delesjonsmutanter for
RB1CC1 plakater (GenBank no. NM_014781) ble generert i pcDNA3.1 plasmid-vektor (Invitrogen), ved en kombinasjon av PCR-baserte manipulasjoner med egnede eksterne primere til de stillingene som er beskrevet nedenfor og restriksjonsenzymspaltning. Nukleotidene til alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
RB1CC1
mutanter DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC slettet aminosyrer 863-1083, 1078-1363, 1364-1594, 1-1356, 824-1594 og 1-863, henholdsvis ( fig. 1C, venstre panel). Transfeksjon ble utført ved anvendelse Fugene HD (Roche) i henhold til leverandørens anbefalinger. Plasmidvektorer av RNAi for
RB1CC1
ble fremstilt som beskrevet tidligere [17]. Kort fortalt, to typer lentiviral sh-RNA vektorer (SH-
RB1CC1
-1 og -2) som tilsvarer ulike målområder (nt. 2070-2090 og NT. 4611-4631, henholdsvis) på
RB1CC1
mRNA (GenBank nr. NM_014781) ble syntetisert in vitro ved å sette inn oligonukleotider kunstige inn i pSIH1-H1-Puro sh-RNA vektor (System Biosciences, CA). Vektorer for sh-RNA
hSNF5 Hotell og
p53
ble utarbeidet av OpenBiosystems (AL). For ikke-stanse kontroller, SH-
GL3 Hotell og krafse vektorer ble kjøpt fra System biovitenskap og OpenBiosystems hhv. I tillegg er human
RB1CC1
cDNA ble subklonet inn i en pLenti6 vektor (Invitrogen). Lenti-virus overføring sh-RNA eller cDNA ble utarbeidet med hver emballasje mix, i henhold til hver produsentens anvisninger. Klonet og utvidede celler ble valgt i nærvær av puromycin eller blasticidin, henholdsvis, og som brukes i forsøkene.
Pull-down analysen
Flag-tagget-villtype (wt)
RB1CC1
eller dets mutanter (DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC) ble transfektert inn HEK293 celler kombinert med HA-merket hSNF5 (full). Cellene ble lysert i TNE-buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40 og 1 mM Na
3VO
4 inneholdende en blanding av protease-inhibitorer). Lysatene ble sentrifugert, og supernatantene ble inkubert med anti-Flag eller anti-HA immobiliserte perler i 2 timer ved 4 ° C. Kulene ble vasket fem ganger med TNE buffer og kokt i nærvær av Laemmli SDS prøvebuffer. Proteinkompleksene ble løst ved hjelp av SDS-PAGE, overført til PVDF-membranfiltre og underkastet immunoblotanalyse med de angitte antistoffer.
Immunoutfelling å påvise proteinkomplekset
MCF-7-celler ble skylt monolags med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og skrapet i iskald NP-40 lyseringsbuffer (20 mmol /liter Tris (pH 8,0), 137 mmol /l NaCl, 1% NP-40, 10% glycerol) supplert med 1% proteasehemmer cocktail (Wako Chemicals) og 3 mmol /l Na
3VO
4. Lysater ble inkubert på is i 20 minutter, fjernet ved sentrifugering, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bicinchoninic syreanalyse (Pierce). Oppløsninger inneholdende 400 til 1000 ug protein ble kort-klaret med protein-G-agarose-kuler (Pierce) og deretter anvendt for immunopresipitering omsetning med 2 typer anti-RB1CC1 kanin polyklonale IgG eller normale kontroll kanin IgG ved 4 ° C over natten, fulgt ved inkubasjon med protein-G-perler i 2 timer for å samle immunkomplekser. Til slutt, ble kulene vasket med NP-40 buffer fem ganger, resuspendert i SDS-prøvebuffer, kokt, løst på SDS-PAGE og analysert ved immunoblot som beskrevet nedenfor.
immunoblotanalyse
celler ble vanligvis lysert for Western blotting som beskrevet av Sarbassov, et al [18]. Etter avregning lysert materialer ved sentrifugering ved 15.000 x g i 1 minutt, ble supernatantene kokt i SDS prøvebuffer. Proteiner løses ved SDS-PAGE ble overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) filtre. Etter blokkering av de filtre med TBS-T (10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM natriumklorid, 0,1% Tween 20) inneholdende 5% bovint serumalbumin (BSA), ble filtrene inkubert over natten med de angitte primære antistoffer i TBS-T inneholdende 2% BSA ved 4 ° C. Filtrene ble deretter vasket i TBS-T og inkubert i 1 time i pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus-anti-kanin eller anti-rotte-IgG (GE Healthcare, UK) fortynnet 1:20,000 i TBS-T inneholdende 2% BSA . Etter flere gangers vask med TBS-T ble immunoreaktivitets oppdaget ved hjelp av ECL-systemet (GE Healthcare) i henhold til prosedyrene som er anbefalt av produsenten.
immunfluorescens analysen
MCF-7 og HeLa celler dyrket på LabTek ™ kammers objektglass (BD Biosciences) til 70% konfluens, fiksert med 1% bufret formaldehyd og 70% etanol, og deretter permeabilisert med 0,1% Triton X-100. Den primære kanin anti-RB1CC1 IgG, anti-mus IgG2a hSNF5 (BAF48), og kanin-anti-p53-IgG (FL393) ble konjugert med Alexa 488, 594 og 350 ved den ZenonTM merkingskit (Molecular Probes).
