Abstract
Kreftceller vise bemerkelsesverdige endringer i cellenes stoffskifte, spesielt i deres nærings underlaget preferanse. Vi har utviklet en rekke eksperimentelle metoder som raskt analyserer metabolsk substrat fluksen i kreftceller: glykolysen og oksydasjon av store brensel substrater glukose, glutamin og fettsyrer. Ved hjelp av XF Ekstracellulær Flux analysator, disse metoder måle, i sanntid, oksygenforbruksrate (OCR) og ekstracellulær surgjøring hastighet (ECAR) av levende celler i en mikroplate som de reagerer på substrater og metabolske perturbasjonsteknikker midler. I proof-of-prinsippet eksperimenter, analyserte vi underlaget flux og mitokondrie bioenergi av to menneskelige glioblastom cellelinjer, SF188s og SF188f, som ble hentet fra den samme foreldrecellelinje, men sprer på langsomme og raske priser, henholdsvis. Disse analysene førte til tre interessante observasjoner: 1) begge cellelinjer respirerer effektivt med betydelig endogent substrat åndedrett; 2) SF188f celler gjennomgikk en betydelig endring fra glycolytic til oksidativ metabolisme, sammen med en høy grad av glutamin oksidasjon i forhold til SF188s celler; og 3) mitokondrie proton lekkasje bundet respirasjon av SF188f celler økte betydelig sammenlignet SF188s celler. Det er sannsynlig at proton lekkasje av SF188f celler kan spille en rolle i å la kontinuerlig glutamin-drevet anaplerotic TCA syklus forandring ved delvis frakobling av TCA syklus fra oksidativ fosforylering. Samlet utgjør disse raske, sensitive og høy gjennomstrømming underlaget flux analysemetoder innføre svært verdifulle tilnærminger for å utvikle en større forståelse av genetiske og epigenetiske veiene som regulerer cellenes stoffskifte, og utvikling av behandlinger som er rettet mot kreft metabolisme.
Citation: Pike Winer LS, Wu M (2014) Rapid Analyse av glycolytic og oksidativt Substrat Flux av kreftceller i en Micro. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10,1371 /journal.pone.0109916
Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 25 august 2013; Godkjent: 01.09.2014; Publisert: 31 oktober 2014
Copyright: © 2014 Pike Winer, Wu. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble gjennomført i og finansiert av Seahorse Bioscience. LSPW er en ansatt og MW var en ansatt på tidspunktet for arbeidet i selskapet. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Lisa S. Pike Winer er ansatt ved Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA. Min Wu var en ansatt ved Seahorse Biovitenskap på tidspunktet for dette arbeidet, North Billerica, MA, USA. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreftceller betydelig omprogrammere stoffskiftet å kjøre tumorvekst og overlevelse. Otto Warburg først observert at under aerobe betingelser, tumorer hadde høye priser for glykolyse i forhold til det omgivende vev, et fenomen kjent som Warburg effekt, eller aerob glykolyse [1]. Han hevdet at økt glykolyse og nedsatt mitokondrier respirasjon er den viktigste årsaken til kreft [2]. Mer nylig har en stor mengde av bevis indikerer at kreftcellene gjennomgår metabolisme omprogrammering, som fører til utstrakt bruk av og avhengighet av glukose eller glutamin for deres vekst og overlevelse [3] – [9]. Denne metabolske omprogrammering har vist seg å være et resultat av onkogen aktivering og /eller tap av tumor suppressor-funksjoner, så vel som følge av miljø signaler, som alle regulerer næringssubstrat opptak og metabolisme [10] – [14]. Avhengig av kombinasjoner av disse faktorene og en gitt mobil kontekst, kan kreftceller manifestere en rekke metabolske fenotyper [15], noe som kan påvirke noen av behandlingsvalg eller respons på behandling.
I lys av mange typer genetisk og metabolsk ulike kreftceller, en rask, informativ, relativt enkle å utføre og høyere throughput underlaget flux analyse kan legge til rette for større forståelse av genetiske og epigenetiske veiene som regulerer kreft celle metabolisme, avgjøre om det er et endelig antall metabolske fenotyper . blant alle typer kreftceller, uavhengig av vev opprinnelse, og oppdage agenter som er rettet mot spesifikke metabolske veier for kreftbehandling
celler produsere ATP via to veier store energiproduserende: glykolyse og oksidativ fosforylering. Den glykolysen omdanner glukose til pyruvat. En skjebnen til pyruvat er reduksjon til laktat i cytosol i en oksygen uavhengig biokjemisk reaksjon som resulterer i ATP-produksjon og netto proton produksjon. Protoner pumpes ut av cellen ved hjelp av forskjellige mekanismer for å opprettholde det intracellulære pH [16] og utstrømningen av protoner inn i det ekstracellulære rom eller mediet som omgir cellene som forårsaker ekstracellulær surgjøring [17] – [21]. Den store næringssubstrater glukose, kan glutamin, og fettsyrer være fullstendig oksydert til inn i CO
2 og H
2O via trikarboksylsyre syklusen (TCA-syklus) som krever elektrontransportkjeden (ETC) i mitokondriene ved hjelp oksygen som en terminal elektronakseptor, og som er koblet til ATP-produksjon ved oksydativ fosforylering. CO
2 fremstilt kan bli omdannet til bikarbonat og protoner som katalyseres av fenololje anhydrase [16], en annen kilde for protoner forårsaker medium surgjøring. I mange ikke-transformerte differensierte celler så som neuroner, produserer oksidativ fosforylering mesteparten av det cellulære ATP. I motsetning til cancerceller er svært avhengige av glykolyse i tillegg til oksidativ fosforylering for deres produksjon ATP [22]. I tillegg til å fyre ATP produksjon, glukose og glutamin er essensielle karbonkilder som gir anabole forløpere, hvorav noen (f.eks, citrat og oksaloacetat) blir produsert gjennom en avkortet TCA syklus for biosyntesen av lipider, nukleinsyrer og aminosyrer.
Siden levende celler ikke lagrer ATP, de produserer den kontinuerlig og på forespørsel, og derfor stadig forbruker oksygen og drivstoff underlag. Således er behovet for ATP i celler (dvs ADP tilgjengelighet) styrer hastigheten av oksygenforbruk. Elektroner (energi) som er lagret i nærings underlag er hentet via mitokondrie TCA syklus reaksjoner og båret av reduserte elektronbærere NADH og FADH
2 til ETC. Ettersom elektronene strømme ned ETC, frigjøres energien brukes til å pumpe protoner fra matriksen inn i intramembrane plass, danner en transmembranelektrokjemisk proton gradient over mitokondrie indre membran. Ved slutten av den ETC, elektroner overført til molekylært oksygen, noe som reduserer den til vann via terminalen cytokrom C oksidase. Som protoner tilbake til den mitokondrielle matriks gjennom det ATP-syntase-komplekset, den energi som er lagret i den proton gradient driver da fosforyleringen av ADP til ATP kopling respirasjon (elektrontransport) med ATP produksjon. Oksidativ fosforylering, er imidlertid ufullstendig koblet til åndedrett. Protoner kan også gå inn igjen i matrisen via proton kanaler som uncoupling proteiner (UCP), som er plassert på den indre membranen, utenom ATP syntase og dissipating energien gradient uten å produsere ATP i en prosess som kalles proton lekkasje. Delvis reduserte oksygenarter (ROS) som superoksid anion kan fremstilles på forskjellige steder i den ETC, avhengig av betingelsene [23]; proton lekkasje har vært ansett som en viktig cellulær mekanisme for å beskytte cellene mot oksidativ skade ved å senke ROS fremstilt ved ETC [24].
På grunn av forbindelsen mellom oksygenforbruk og ekstracellulær surgjøring med næringssubstrat metabolisme, økt oksygenforbruk er et mål på substrat oksydasjon når et substrat blir tilsatt til cellene. Likeledes er en økning i frekvensen av ekstracellulære forsuring på glukose tillegg et mål på glycolytic forandring.
Ulike tradisjonelle eksperimentelle metoder som analyserer underlaget metabolisme har bidratt til dagens forståelse av cellenes stoffskifte. Disse inkluderer å måle akkumulering av radiomerkede sluttprodukter som H
2o og CO
2 metaboliseres fra substrater som
3H-merket glukose og
14C merket fettsyrer. Andre tidligere anvendte (og mer nylig utviklede) fremgangsmåter for å kvantifisere metabolitter er stabile isotopen tracere kombinert med massespektrometri og NMR-analyse, som begge har gitt detaljert informasjon om substratet metabolisme. Disse teknikkene, men kan likevel være enten arbeidskrevende og tungvint, og /eller relativt utilgjengelig for mange laboratorier.
Denne studien hadde to hovedmål. Det første var å anvende prinsippene beskrevet ovenfor for å etablere en serie av raske og enkle metoder for å analysere glycolytic flux og oksidativt underlaget fluks av kreftceller. Dette ble oppnådd ved å måle cellulær oksygenforbruk rente og ekstracellulære forsuring bruker XF ekstracellulær Flux analysator [22]. Den andre var å utføre proof-of-prinsippet eksperimenter gjennom å bruke disse substrat flux metoder, sammen med analyse av mitokondrie bioenergi i menneskelige glioblastom celler SF188s og SF188f å avhøre deres metabolske nettverk.
Materialer og metoder
Reagenser
Karbonyl cyanid 4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone (FCCP), myxothiazol, antimycin A, rotenon, 2-deoksyglukose, oksamat, aminooxyacetate, glukose, natriumpyruvat og natrium-palmitat ble oppnådd fra Sigma (St. Louis , MO, USA). L-glutamin ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Oligomycin ble hentet fra EMD (San Diego, California, USA). Bovint serumalbumin fraksjon V (fettsyre ultra-fri) ble oppnådd fra Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, USA). Alle forbindelser og medium ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner med mindre annet er angitt.
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig glioblastom SF188 celler ble hentet fra University of California i San Francisco hjernevev Bank . Disse cellene ble opprinnelig opprettholdt, som anbefalt av utstederen, i et MEM-medium inneholdende 5,5 mM glukose og 2 mM L-glutamin. De ble tilpasset trinnvis til DMEM-medium inneholdende 25 mM glukose og 6 mM L-glutamin som et modellsystem for studier av metabolisme glutamin som rapportert [6]. Som en kontroll, ble foreldrecellene også innrettet i parallell med DMEM medium inneholdende 5,5 mM glukose og 2 mM L-glutamin. Den tidligere fått en mye raskere vekst etter 4 uker kultur i medium og ble kåret SF188f (rask). Sistnevnte er imidlertid opprettholdt tilsvarende vekstrater som disse foreldre cellene opprettholdt i MEM, og ble kåret til SF188s (sakte). For å opprettholde deres distinkte vekst fenotype, SF188s og SF188f celler ble alltid dyrket i DMEM inneholdende 5,5 mM glukose og 2 mM L-glutamin og 25 mM glukose og 6 mM L-glutamin, henholdsvis ved 37 ° C i en Forma inkubator med 10% CO
2 og 100% fuktighet ved ~80% samløpet i 175 cm
2 T-kolber (Corning). Menneskelig prostatakreft PC-3 og livmorhalskreft HeLa celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og ble opprettholdt i RMPI1640. Alle cellekulturmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serumalbumin (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA).
XF analysemedium
Et basismedium ble benyttet i analysene beskrevet i denne studien direkte eller suppleres med substrater og kofaktorer som angitt i hver av de spesifikke analyser (se nedenfor) og for hvert eksperiment. Basen analysemedium ble fremstilt som følger. Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) pulver (Sigma, katalognummer D5030) ble benyttet som utgangsmateriale. Den inneholder ingen glukose, L-glutamin, natriumpyruvat, natriumbikarbonat, eller fenol rød, og har en lav fosfat (se Materialer S1 i File S1for detaljene i forberedelse). I tillegg kan en modifisert Krebs-Henseleit- bikarbonatbuffer (KHB) som ikke inneholder bikarbonat og lavere fosfat også anvendes (Materialer S2 i File S1) som et alternativ analysemedium for fettsyreoksidasjon. Anvendelsen av aminosyre-fri buffer, i motsetning til basismediet for andre assays er mulig, men kan resultere i forskjellige eksperimentelle resultater som kan kreve forskjellige data tolkninger. Alle analysene beskrevet her ble utført utelukkende i basismediet med angitte tilskudd, med unntak av fettsyreoksidasjon som ble utført i både basismedium og KHB, hvilket ga lignende resultater.
Fremstilling av palmitat-BSA-konjugat
natrium-palmitat ble oppløst ved å varme den til 68 ° C i 150 mM natriumkloridløsning. Den ble deretter bundet til BSA i oppløsning ved molforhold på 06:01. Den fullstendige protokollen er beskrevet i Material S3 i File S1.
Måling av oksygenforbruk rente og ekstracellulære forsuring priser
OCR og ECAR målinger ble utført ved hjelp av XF24 eller XF96 ekstracellulær Flux analysator (Seahorse Biovitenskap , North Billerica, MA) som beskrevet [22]. I korthet ble cellene sådd ut i XF24 (V7) eller XF96 (V3) isopor cellekulturplater (Seahorse Bioscience, North Billerica). SF188s celler ble sådd på 30 000 /brønn (XF24 plate) eller 20 000 /brønn (XF96 plate) og SF188f celler på 20 000 /brønn (XF24 plate) eller 15 000 /brønn (XF96 plate), henholdsvis. PC-3 og HeLa-celler ble sådd ut på 25.000 og 30.000 celler per henholdsvis også, i XF24 cellekulturplater. Cellene ble inkubert i 24 til 28 timer i en fuktet 37 ° C inkubator med 10% CO
2 (DMEM-medium) eller 5% CO
2 (RMPI1640 medium og MEM), respektivt. Fordi de to cellelinjene spre seg med forskjellige hastigheter i løpet av 24-28 timers inkubasjonsperiode ble SF188s og SF188f celler behandlet med trypsin og deretter tellet for å bestemme celletallet i hver brønn etter en analyse. Disse celletall ble brukt til å normalisere enten OCR eller ECAR. Deres viabilities, som bestemt etter analyser, var nesten utvisket uavhengig av tilstedeværelse eller fravær av eksogene substrater eller metabolske inhibitorer i analysemedium. Forut for utførelse av en analyse, ble vekstmedium i brønnene av en XF celleplaten utvekslet med den passende analysemedium for å oppnå et minimum av 1:1000 fortynning av vekstmedium. 600 ul (XF24) eller 150 ul (XF96) av analysemedium ble tilsatt til cellene i en XF-analyse. Mens sensor patroner ble kalibrert, ble celle platene inkubert i et 37 ° C /ikke-CO
2 inkubator i 60 minutter før starten av en analyse. Alle forsøkene ble utført ved 37 ° C. Hver målesyklus besto av en blandetid på 3 minutter og en datainnsamlingsperiode på 3 minutter (13 datapunkter) for XF24, og 2 minutter og 4 minutter for XF96. OCR og ECAR datapunkter refererer til den gjennomsnittlige priser i løpet av målesykluser. Alle forbindelser ble fremstilt i passende konsentrasjoner i ønsket analysemedium og justert til pH 7,4. Et volum på 75 ul for XF24 (25 ul for XF96) av forbindelse ble tilsatt til hver injeksjonsport. I et typisk eksperiment ble 3 grunnlinjemålinger tatt før tilsetningen av hvilken som helst forbindelse, og 3 responsmålinger ble tatt etter tilsetningen av hver forbindelse. OCR og ECAR ble rapportert som absolutte satser (pmol /min for OCR og mph /min for ECAR) eller normalisert mot celler, eller uttrykt som en prosentandel av grunnlinjen oksygenforbruk. I denne studien baseline OCR eller ECAR (teknisk term) refererer til startpriser før tillegg av en agent, som kan brukes til sammenligninger med disse tallene etter tillegg. I motsetning til dette, basal OCR eller ECAR (en biologisk sikt) refererer til OCR eller ECAR som forekommer i celler i ro for å opprettholde grunnleggende cellefunksjonen. Med mindre annet er angitt, ble den tredje måling av grunnlinje eller etter tilsetning av hvert substrat eller forbindelse som anvendes for å generere absolutt OCR eller ECAR verdier. I tillegg, i prosent av utgangs OCR-verdier ble beregnet som OCR ved den tredje målingen etter et middel injeksjon, delt på OCR umiddelbart før injeksjonen. Hver datum ble bestemt minimalt i tre eksemplarer.
XF Substrat Flux Analyse betingelser
glycolytic flux og glycolytic kapasitet.
Analysen medium består av basen medium supplert med 2 mM L -glutamine. Glutamin er nødvendig for å oppnå den maksimale glykolyse hastighet for noen, men ikke alle cellelinjer. Det samme medium ble brukt til å bestemme glykolytisk kapasitet. Konsentrasjonen av glukose tilsatt for å initiere glykolyse og måle glykolytisk kapasitet var 10 mM, er større enn metningspunktet under begge betingelser.
glukoseoksidasjon.
analysemedium var det basemedium uten eksogent drivstoff underlaget tilskudd. Konsentrasjonen av glukose tilsettes for å starte glukoseoksidasjon var 10 mm, noe som ble bestemt i preliminære forsøk å være over metnings.
Glutamin oksydasjon.
analysemedium var det basemedium uten eksogent drivstoff substrat. Konsentrasjonen av glutamin tilsatt til cellene for å initiere oksydasjon glutamin var 4 mm, noe som også var forutbestemt til å være over metnings.
fettsyreoksidasjon.
analysemedium var det basemedium (eller KHB) supplert med 5,5 mM glukose og 50 mM karnitin (nødvendig for å transportere langkjedet fettsyre inn i mitokondriene). Fettsyrer testet inkluderer langkjedet fettsyre palmitat, mellomkjedet fettsyre oktanoat, og kortkjedet fettsyre butyrat. De ble titrert for konsentrasjoner stimulerende maksimal OCR respons. Arbeids konsentrasjon av palmitate konjugert med BSA var 150 mikrometer, og octanoate 1 mm, som også var over metning.
Det er viktig at de ovennevnte analysebetingelsene er strengt overholdt. Enhver variasjon i analysemedium preparatet kan resultere i forskjellige tolkninger og innsikt i cellulær metabolsk nettverk. Mette underlaget konsentrasjoner og optimale forbindelseskonsentrasjonene ble bestemt ved å utføre titrering eksperimenter som beskrevet i Materialer S4 og S5 i File S1. Effekten av analysebetingelsene på tolkning av eksperimentelle resultatene vil bli beskrevet andre steder.
legemer
SF188s og SF188f celler ble frittliggende med trypsin-EDTA og høstet umiddelbart etter en XF analyse. Antall celler i hver brønn ble bestemt ved hjelp av en ViCell automatisert trypanblått teller (Beckman-Coulter, Fullerton, CA), og ble brukt til å normalisere OCR og ECAR som vist i figuren legender.
Statistisk analyse
dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik, med minst tre replikater ble benyttet for hver datapunkt. Med mindre annet er angitt, en paret Students
t
testen ble utført for hver forsøksgruppe for å vurdere statistisk signifikans mot respektive kontroller.
Resultater
glykolyse og glycolytic kapasitet
Vi har tidligere vist at glykolyse står for ~80% av total ECAR i en rekke kreftceller som bestemt ved to metoder: a) fjerning av glukose fra analysemedium og b) tilsetning av glykolysen inhibitorer slik som heksokinaseløsning inhibitor 2- DG og laktat dehydrogenase (LDH) hemmer oksamat [22]. De resterende 20% av den ECAR kan tilskrives andre metabolske prosesser, for eksempel den TCA-syklusen CO
2 evolusjon. For å måle glykolyse hjelp ECAR mer nøyaktig og enkelt, tok vi følgende tilnærming. Glukose ble tilsatt til celler som er inkubert i et glukosefritt medium, men supplert med glutamin (se Materialer og Metoder). Den ECAR-økning etter tilsetning av glukose etablerer glykolyse hastighet. En etterfølgende tilsetning av en inhibitor glykolyse eliminerer glukose-indusert økning ECAR. Enhver forsuring på grunn av andre metabolske prosesser som TCA syklus CO
2 frigjøring (fra alle underlag, men glukose) blir gjenkjent som ECAR før glukose tillegg. OCR-respons overfor glukose, overvåkes samtidig med ECAR, tjener som en indikator på om glukose er også catabolized gjennom mitokondriell respirasjon (figur 1A).
A. Skjematisk illustrasjon av glykolysen. NADH fremstilt i cytosol som glukose omdannes til pyruvat og regenereres ved LDH i cytosol. B. Kinetisk ECAR reaksjon av SF188s celler til glukose (10 mM) og 2-DG (100 mM) eller oksamat (100 mM), respektivt. SF188s celler ble sådd ut i 30.000 celler /brønn i XF24 V7 cellekulturplater 24-28 timer før analysene. Den analysemedium ble substrat-fri base medium (som beskrevet i Materialer og Metoder) supplert med 2 mM glutamin. Den ECAR verdien var ikke normalisert. En representant eksperiment av minst tre er vist her. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD, n = 4. C. ECAR reaksjon av HeLa-celler til glukose (10 mM), 2-DG (100 mM) og antimycin (1 uM). Sett: OCR respons i de samme forsøk som viser den Crabtree virkning, og at glukose ikke øke OCR. HeLa-celler ble sådd ut på 30 000 /brønn i XF24 cellekulturplater 24-28 timer før analysene. ECAR eller OCR-verdiene var ikke normalisert. Den analysemedium ble substrat-fri base medium (som beskrevet i Materialer og Metoder) supplert med 2 mM glutamin. En representant eksperiment av minst tre er vist her. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD, n = 5.
Vi utførte forsøket ved hjelp SF188s og HeLa-celler. Som vist i figur 1B, glukose tillegg til SF188s celler utløst en umiddelbar ECAR økning, 38 ± 4 mph /min (ECAR måle 6 mindre enn måle 3), som deretter ble opphevet ved tilsetning av glykolyse inhibitorer, enten 2-DG eller -oksamat. Dette eksperimentet indikerte at eksogent tilsatt glukose ble brutt ned til laktat (fordi LDH hemming av oksamat reduserer ECAR på samme måte som 2-DG), forårsaker en ECAR økning og dermed validere vår eksperimentell design. Lignende resultater ble oppnådd i HeLa-celler (figur 1C.) Som var i overensstemmelse med vår tidligere studie [22], så vel som med et antall nylige rapporter som viser at den ECAR responsen er en parallell til den for laktatproduksjon [25] – [27]. Før tilsetting av glukose til cellene så vel som etter tilsetning av 2-DG eller oksamat, vi igjen observert en liten ECAR, 6 ± 1 km /h /min og 10 ± 2 mph /min (ved måling 3), henholdsvis i SF188s og HeLa-celler (figur 1B og C). Vi viser til denne lille, men målbare ECAR som ikke-glycolytic forsuring. OCR-reaksjon indikerte at injeksjon av glukose ikke bare unnlot å utløse en økning, men i virkeligheten forårsaket en liten reduksjon i OCR (figur 1C), som er lik den Crabtree Effect, først observert i tumorceller ved Crabtree i 1920 [ ,,,0],28].
de to mest signifikante protonkilder som kan bidra til ikke-glykolytisk forsuring TCA syklus og nedbryting av intracellulær glykogen, dvs. glykogenolyse [20]. For å bestemme bidraget fra den TCA-syklusen CO
2-utviklingen, ble det benyttet en sammensatt III-inhibitor antimycin for å stoppe elektronstrømmen og dermed den TCA-syklusen fluksen i HeLa-celler. Glukose ble lagt første til å initiere glykolyse, etterfulgt av to-DG å avskaffe den, etterlater ikke-glycolytic ECAR. Den endelige tillegg av antimycin stoppet TCA syklus fra å produsere CO
2. Selv om en rest forble, 4 ± 1,4 km /h /min, antimycin elimineres omtrent halvparten av den ikke-glykolytiske ECAR (figur 1C), som bekrefter at bidraget av TCA-syklus CO
2-avledede proton til ikke-glykolytisk surgjøring. Vi testet om antimycin-resistent ECAR skyldtes glykogenolyse ved hjelp CP91149, en hemmer av glykogen fosforylase (den første enzymet av glykogen sammenbrudd), men vi har ikke observere noen signifikant effekt av CP91149 på ikke-glycolytic forsuring (data ikke vist) , som fører oss til å konkludere med at den gjenværende ikke-glycolytic ECAR måtte gjøres rede for av andre metabolske prosesser, for eksempel dekarboksylering reaksjoner katalysert av glukose-6-fosfat dehydrogenase og /eller pyruvat dehydrogenase. Sammen er disse resultatene igjen bekreftet at glykolyse står for majoriteten av ECAR observert i kreftceller, og fastslo at TCA-avledet CO
2 er en primær bidragsyter av ikke-glycolytic forsuring.
glycolytic flux bestemmes
in vitro
ved normale oksygennivået reflekterer basal glykolyse rate. Når cellene opplever tap av mitokondriell ATP produksjon på grunn av hemming av oksidativ fosforylering, enten ved lavt oksygentrykk, eller ved å oligomycin, de utvider deres glykolytisk fluks og gjøre mer ATP fra glykolytiske trasé for å opprettholde cellulær homeostase ATP [22]. Vi viser til denne økte glycolytic flux som svar på mangel i mitokondriell ATP produksjon som glycolytic kapasitet. Eksperimentelt, definerer vi glycolytic kapasitet som glukose-indusert ECAR av mitokondriell ATP syntasehemmer oligomycin.
For å bestemme både glycolytic flux og glycolytic kapasiteten på samme celle befolkningen i ett eksperiment, målte vi ECAR mens fortløpende sprøyte glukose, oligomycin, og to-DG. Som vist i figur 2A, tilsetning av glukose til HeLa-celler, som forventet, utløste en glykolytisk fluks av 19 ± 0,9 km /h /min (EACR ved måling 6 mindre enn ved måling 3) i HeLa-celler. Den etterfølgende tilsetning av oligomycin førte til en ytterligere økning i ECAR til 44 ± 3,8 km /h /min (ECAR ved måle 9 mindre enn ved måling 3), noe som indikerer en forhøyet glukose fluks mot laktat og avslører den glykolytiske kapasitet på HeLa-celler. Den endelige tillegg av glykolyse inhibitor 2-DG avskaffet den samlede glykolyse (figur 2A). Den beregnede glykolytisk fluks og glykolytisk kapasitet fra glykolysen eksperimentet er vist i figur 2B.
A. Kinetisk ECAR reaksjon av HeLa-celler til glukose (10 mM), oligomycin (2 uM), og 2-DG (100 mM). Sett viser OCR respons som respons på glukose og oligomycin. HeLa-celler ble sådd ut på 30 000 /brønn i XF24 V7 cellekulturplater 24-28 timer før analysene. Den analysemedium var underlaget-frie base medium supplert med 2 mM glutamin. ECAR eller OCR-verdiene var ikke normalisert. Et representativt eksperiment ut på 5 er vist her. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD, n = 4. B. Beregnet glycolytic flux, glycolytic kapasitet. Glykolytisk fluks er forskjellen mellom de ECARs måle 6 og måling 3. Likeledes beskriver glykolytisk kapasitet differansen mellom ECAR måle 9, og at måle 3. * p. 0,05
to eksperimentelle vilkår må være oppfylt i ovennevnte eksperiment. Først bør oligomycin konsentrasjonen maksimalt hemme respirasjonen. Dette ble oppnådd ved å velge den oligomycin konsentrasjonen som resulterte i en maksimal OCR inhibering i en titrering eksperiment. For eksempel ble 0,5 uM oligomycin funnet å være tilstrekkelig til å oppnå maksimal hemming av OCR i HeLa-celler (data ikke vist). For det andre er det viktig å sikre at tilførselen av eksogent glukose er metning, slik at den glykolytiske maskineri for å være den begrensende faktor. Den mettende konsentrasjon av glukose for å oppnå maksimal ECAR respons ble bestemt i en glukosekonsentrasjon titrering eksperiment, hvori økende konsentrasjoner av glukose ble tilsatt til cellene, etterfulgt av tilsetning av kontroll eller oligomycin ved den konsentrasjon som maksimalt hemmer respirasjon. I HeLa-celler, for eksempel, har vi funnet at ECAR øket kontinuerlig til glukosekonsentrasjonen nådde 5 mM, etter som det ikke var noen ytterligere økning ECAR (figur S1). Lignende resultater ble oppnådd med et dusin transformerte og ikke- transformerte cellelinjer (data ikke vist). Vi valgte en høyere enn mette konsentrasjon på 10 mM som standard konsentrasjon for å bestemme både glycolytic flux og glycolytic kapasitet.
Glukose oksidasjon
Glukose-avledet pyruvat kan også gå inn i mitokondriene, hvor det omdannes til acetyl CoA av pyruvat dehydrogenase og går inn i TCA-syklusen via citrat syntase (eller som oksaloacetat via pyruvat-carboxylase [29]. den acetyl-gruppen er eventuelt oksyderes til CO
2 og H
2O (figur 3A) . Den oksygenkrevende prosess med glukoseoksidasjon første til pyruvat og deretter til CO
2 og H
2o er referert til her som glukoseoksidasjon.
A. Skjematisk illustrasjon av biokjemiske veien for glukoseoksidasjon . den NADH produsert i cytosol som glukose omdannes til pyruvat er importert inn i mitokondriene via malat-aspartat shuttle og regenerert via ETC å opprettholde kontinuerlig glukoseoksidasjon. B. Kinetic OCR respons av PC-3 celler til glukose (10 mM ); C. OCR respons overfor glukose (10 mM), oligomycin (1 uM) og FCCP (0,3 uM). PC-3-celler ble sådd ut på 25 000 /brønn i XF24 V7 kulturplater. Den analysemedium var underlaget-fri base medium. OCR-verdiene ble ikke normalisert. En representant eksperiment av tre er vist her. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD, n = 4.
Eksperimentelt, brukte vi glukose-indusert OCR å måle glukose oksidasjon. For å etablere den glukoseoksidasjon analysen, valgte PC-3-celler som aktivt oksidere glukose. For å bestemme glukoseoksidasjon, ble 10 mM glukose tilsatt til cellene i analysemedium som ikke inneholder noe glukose eller glutamin (se Materialer og Metoder). Som vist i figur 3B, tilsetning av glukose til PC-3-celler forårsaket en umiddelbar økning i OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR ved måling 6 mindre enn ved måling 3), noe som indikerer glukose fluks inn i den TCA-syklus, og i siste instans , ETC for fullstendig oksidasjon. Denne eksperimentelle design gir en kvantitativ måling av glukoseoksidasjon under denne eksperimentelle betingelse. I en variant design, ble PC-3 celler eksponert til glukose, oligomycin, og FCCP fortløpende, med 3 målinger før hver forbindelse tillegg og etter hver forbindelse tillegg. FCCP frakobler åndedrett fra oksidativ fosforylering, slik at oksydasjon av noe oksyderbart substrat til stede i analysemedium for å forekomme. Som vist i figur 3C, FCCP stimulert en topp i OCR følgende glukose tillegg, men ikke kontrollen, noe som ytterligere bekrefter at de biokjemiske mekanismer for glukoseoksidasjon var aktive i PC-3-celler. OCR respons på FCCP bekrefter og gir en semi-kvantitativ vurdering av cellenes evne til å oksidere glukose. I denne eksperimentell design, cellene ble pre-inkubert i substrat-fri base medium i 60 min før et assay, slik at det er en mulighet for at de kan ha blitt understreket og endret sin respons overfor glukose tilsetningen.
