Abstract
Innledning
Nylig, de pleiotrope fordelene med inkretinsystemet basert terapi har blitt rapportert. Vi har tidligere rapportert at Exendin-4, en glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1) reseptor-agonist, demper prostatakreft vekst. Metformin er kjent for sin anti-kreft-effekt. Her undersøkte vi den anti-kreft effekt av Exendin-4 og metformin ved hjelp av en prostatakreft modell.
Metoder
prostata kreft celler ble behandlet med Exendin-4 og /eller metformin. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved vekstkurver og 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) assay. TUNEL analyse og AMP-aktivert protein kinase (AMPK) fosforylering ble undersøkt i LNCaP celler. For
in vivo eksperimenter
, LNCaP-celler ble transplantert subkutant i flanken regionen i atymiske mus, som så ble behandlet med Exendin-4 og /eller metformin. TUNEL assay og immunhistokjemi ble utført på tumorer.
Resultatene
Exendin-4 og metformin additivt redusert vekstkurven, men ikke overføringen av prostata kreftceller. Den BrdU-analysen viste at både Exendin-4 og metformin betydelig redusert prostatacancer celleproliferasjon. Videre er metformin, men ikke Exendin-4, aktivert AMPK og induserte apoptose i LNCaP-celler. Den anti-proliferativ effekt av metformin ble avskaffet ved å hemme eller slå ned av AMPK.
In vivo
, Exendin-4 og metformin betydelig redusert tumorstørrelse, og ytterligere betydelig tumorstørrelse reduksjon ble observert etter kombinasjonsbehandling. Immunhistokjemi på svulster viste at P504S og Ki67 ekspresjon redusert med Exendin-4 og /eller metformin, og at metformin økt fosfor-AMPK uttrykk og apoptotisk celle nummer.
Konklusjon
Disse dataene antyder at Exendin-4 og metformin svekket prostatakreft vekst ved å hemme spredning, og at metformin hemmet spredning ved å indusere apoptose. Kombinert behandling med Exendin-4 og kreft vekst metformin svekket prostata mer enn separate behandlinger
Citation. Tsutsumi Y, Nomiyama T, Kawanami T, Hamaguchi Y, Terawaki Y, Tanaka T, et al. (2015) Kombinert behandling med Exendin-4 og Metformin demper prostatakreft vekst. PLoS ONE 10 (10): e0139709. doi: 10,1371 /journal.pone.0139709
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 28 juni 2015; Godkjent: 16 september 2015; Publisert: 06.10.2015
Copyright: © 2015 Tsutsumi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. MSD begavet en stol i vår avdeling, og gitt støtte i form av lønn for forfatteren, Tomoko Tanaka, PhD. Men Dr. Tanaka ikke en ansatt i MSD. MSD donerer en begavet stol til vår avdeling, og fargen ansette henne ved hjelp av en del av stipend fra MSD. Eli Lilly gitt økonomisk støtte som felles forskning. Men disse selskapene ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Eli Lilly gitt økonomisk støtte som felles forskning. MSD donerer en begavet stol til vår avdeling, og vår avdeling syssels forfatter Tomoko Tanaka, PhD ved hjelp av en del av tilskuddet fra MSD. TN har mottatt forelesningshonorar fra Astrazeneca, Astellas, Boehringer Ingelheim, Eli Lilly, MSD, Novartis Pharma, Ono farmasøytisk Co Ltd, Sanofi, Takeda farmasøytisk Co Ltd, Mitsubishi Tanabe Pharma og Sumitomo Dainippon Pharma, og forskningsmidler fra Astellas og MSD. TY ble støttet økonomisk for sin forskning ved MSD, Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Daiichi Sankyo Company Ltd, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd., Sanwa Chemistry Co., Ltd., Eli Lilly, Novo Nordisk Pharma Ltd ., Novartis Pharma, Kowa Company Ltd, og Fujifilm Pharma Co., Ltd Det er ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Forkortelser. AMPK, AMP-aktivert protein kinase; AR, androgen reseptor; DPP-4, dipeptidylpeptidase-4; Ex-4, Exendin-4; ERK-MAPK, ekstracellulære signalregulerte kinase-mitogen-aktivert protein kinase; GAPDH, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; GLP-1, glukagon-lignende peptid-1; GLP-1R, GLP-1 reseptoren; IGF-1, insulinlignende vekstfaktor-1; mTOR, mammalian target of rapamycin; NFkB, nukleær faktor kappa-lettkjede-enhancer av aktiverte B-celler; PSA, prostata serum antigen
Innledning
inkretin basert behandling, inkludert dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4-hemmere) og glukagon-lignende peptid-1 reseptor (GLP-1R) agonister, har blitt et populært behandling av type 2 diabetes. Nylig har mye oppmerksomhet vært rettet mot inkretinsystemet, på grunn av sin vev-beskyttende effekter utover å senke blodsukkeret [1]. Vi har vist de vaskulære-beskyttende virkninger av Exendin-4 (Ex-4), en GLP-1R agonist, som det svekkede atheroma dannelse i apoE
– /- mus via hemming av NFkB-aktivering i makrofager [2], og det reduserte intimalfortykning etter vaskulær skade via AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) aktivering i vaskulære glatte muskelceller [3]. I tillegg har vi nylig vist at DPP-4-hemmer, linagliptin, redusert neointima dannelse etter vaskulær skade [4]. Således kan inkretinsystemet basert terapi forbedrer livskvaliteten og dødeligheten av pasienter med diabetes gjennom sin vaskulære beskyttende effekter. Imidlertid er kreft annen hovedårsak til død hos pasienter med diabetes [5], spesielt i Japan, hvor det er den ledende årsak til død hos pasienter med type 2 diabetes [6]. Følgelig Japan Diabetes Society og Japan Cancer Association har utstedt en advarsel om økt risiko for kreft hos diabetespasienter [7]. Imidlertid er antall studier som har undersøkt den anti-kreft effekt av inkretinsystemet begrenset.
Nylig har vi undersøkt anti-prostatakreft effekten av Ex-4 både
in vivo Hotell og
in vitro product: [8]. Vi oppdaget GLP-1R uttrykk i menneskelige prostata kreft vev og prostatakreftcellelinjer, og Ex-fire svekket prostatakreft vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
via hemming av ekstracellulære signalregulerte kinase-mitogen-aktivert protein kinase (ERK-MAPK) aktiveringen, som fører til hemming av celleproliferasjon [8]. Som meta-analyse har foreslått, er forholdet mellom prostatakreft og diabetes eller metabolsk syndrom fortsatt under diskusjon [9-13]. Imidlertid har en nyere studie antydet at eksisterende diabetes er også assosiert med høyere mortalitet i pasienter med prostatakreft, på samme måte som andre krefttyper [14]. Dessuten har en oppfølgingsstudie på 2,546 pasienter med prostatakreft avslørte at både høy kroppsmasseindeks og plasma C-peptid konsentrasjonen økt risiko for dødelighet [15]. Videre har vi tidligere har rapportert at insulin og insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) akselerere prostatacancer celleproliferasjon gjennom androgenreseptoren (AR) aktivering ved å forstyrre den direkte interaksjon med Foxo1 [16]. Disse data favorisere hypotesen om at insulinresistens og hyperinsulinemi i pre-eller tidlig diabetiker stater og metabolsk syndrom er assosiert med dårlig prognose for pasienter med prostatakreft. Imidlertid har metformin vært kjent som et anti-diabetisk middel som også har en anti-kreft effekt [17, 18]. Metformin demper kreft vekst indirekte gjennom reduksjon i serum insulin og IGF-1-konsentrasjonen skyldes forbedring i insulinsensitivitet, og direkte gjennom cellesyklus arrest og hemming av mammalian target of rapamycin (mTOR) etter AMPK aktivering [19]. Videre er en detaljert undersøkelse viste en direkte anti-prostatakreft effekt av metformin
in vivo Hotell og
in vitro product: [20].
I denne studien har vi undersøkt anti-kreft effekt av Ex-4 og /eller metformin behandling
in vivo Hotell og
in vitro
, ved hjelp av et prostatakreft modell.
Materialer og metoder
Dyr
atymiske CAnN.Cg-
Foxn1nu Twitter /CrlCrlj uten diabetes hannmus ble kjøpt fra Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan) og plassert i bestemte pathogen- gratis barriere fasiliteter på Fukuoka universitetet. Mus ble behandlet med enten saltoppløsning (n = 10) eller Ex-4 (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) ved 300 pmol kg kroppsvekt
-1 dag
1 (n = 10), levert av en mini osmotisk pumpe (ALZEST, modell 1004, DURECT, Cupertino, CA, USA), eller med metformin (Wako ren kjemisk industri, Ltd, Osaka, Japan) 750 mg kg
-1 dag
-1 ved å blande det med mate (n = 10), eller med kombinert Ex-4 og metformin (n = 10). I en alder av 6 uker, 1 × 10
6 (passasje 4-8) LNCaP celler ble blandet med 250 mL av Matrigel (Becton Dickinson laboratorie-utstyr, Bedford, MA, USA) og transplantert subkutant i flanken regionen, og osmotisk pumpe ble transplantert under huden på ryggen av hver mus under bedøvelse med 2% isofluran inhalering. I en alder av 12 uker blodprøver ble oppsamlet, og musene ble avlivet. En mus behandlet med Ex-fire døde i en alder av 10 uker, 4 dager etter transplantasjon av en ny infusjonspumpe av Ex-4, på grunn av kampene. Tumorvolumet ble beregnet med en modifisert ellipsoide formel: lengde x bredde
2 x 0,52. Parafininnstøpte formalin-fikserte tumorer ble kuttet i 5-um seksjoner og forberedt for immunofluorescerende farging, som beskrevet tidligere [8]. Prostata serum antigen (PSA) proteinkonsentrasjoner i museserum ble målt ved anvendelse av et EIA ved SRL Inc. (Tokyo, Japan). Serum insulin konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en EIA kit kjøpt fra Morinaga Institute of Biological Science Inc. (Yokohama, Japan). Alle prosedyrer for dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care underutvalg i Fukuoka universitetssykehus.
cellekultur og celleproliferasjon analyser
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer, LNCaP, PC3 og DU145 cellene, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). LNCaP-celler og DU145-celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, PC3-celler ble dyrket i Hams F-12. Alle media ble supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Celleproliferasjon analyser ble utført som beskrevet tidligere [8] med mindre modifikasjoner. I korthet ble celler (3 x 10
4 celler /skål) ble sådd ut på 3,8 cm-
2 plater og opprettholdt i media inneholdende 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, med eller uten 0,1 til 10 mM metformin, 10 nM Ex-4, en kombinasjon av 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin, eller 0,1 uM forbindelse C, et AMPK-inhibitor (Sigma-Aldrich). Celleformering ble analysert etter 0-4 dager etter celletelling ved hjelp av et hemocytometer. For alle forsøk, på samme måte passaged (passasje 4-8) celler ble anvendt. Forsøk ble utført i tre paralleller ved å bruke tre forskjellige preparater av celler.
siRNA Slå ned av AMPK Expression og celleproliferasjonsanalyse
siRNA slå ned og celleproliferasjon-analyse ble utført som tidligere beskrevet [8] . For å knockdown AMPK, et mulig mål av metformin, brukte vi AMPKɑ1 /2 siRNA (h) (sc-45312, Santa Cruz, Santa Cruz, USA) og kontroll siRNA (sc-36869, Santa Cruz). For transfeksjon, ble LNCaP-celler sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater og transfektert med 10 nM AMPKɑ1 /2 siRNA (h) eller kontroll siRNA ved hjelp MISSION
® siRNA Transfeksjon reagens (Sigma-Aldrich). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene underkastet celleproliferasjonsanalyse. I korthet ble cellene frittliggende og på nytt utplatet i 12-brønns vevskulturplater i fullstendig media med eller uten 0,1 mM metformin. Tre dager etter behandlingen ble cellene samles og telles ved hjelp av en hemocytometer.
BrdU analyser
For å evaluere LNCaP celleproliferasjon, den bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering Analysen ble utført ved hjelp av celleproliferasjon ELISA kits ( 1647229; Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) som beskrevet tidligere [8]. Kort sagt ble LNCaP-celler med eller uten siRNA transfeksjon platet med 5000 celler /brønn i 96-brønners kulturplater i komplett medium. Etter å oppnå 60-70% konfluens, ble LNCaP-celler ble behandlet med eller uten 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, en kombinasjon av 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin, eller forbindelse C i medium med 10% FBS i 24 timer . BrdU-løsning (10 pM) ble tilsatt i løpet av de siste 2 timer for stimulering. Deretter ble cellene fiksert og tørket, og det cellulære DNA ble denaturert med FixDenat-løsning (Roche Applied Science) i 30 minutter ved romtemperatur (RT). En peroksydase-konjugert mus-anti-BrdU monoklonalt antistoff (Roche Applied Science) ble tilsatt til kulturplater og inkuberes i 90 min ved RT. Til slutt ble tetrametylbenzidin substrat tilsatt i 5 minutter ved romtemperatur og absorbansen av prøvene ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japan) ved 450-620 nm. Midlere data er uttrykt som et forhold mellom kontrollen (ubehandlet) celleproliferasjon.
apoptose assays
For merking av kjerner av apoptotiske celler, 1,5 x 10
5 LNCaP-celler ble sådd ut på glass Dekk i Lab-Tek Chamber Slides (177380, Nunc, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og fiksert i 4% paraformaldehyde i 25 min. Å forbehandle parafin-innleiret vev ble snittene deparaffinized, vasket med xylen og etanol og fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 min. Hver seksjon ble inkubert med 20 ug /ml proteinase K-løsning i 10 minutter, vasket og gjen fiksert i 4% paraformaldehyd i 5 min. TUNEL-farging ble utført ved hjelp av blind fluorometriske TUNEL-systemet (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoll. I løpet av den siste 24 timer ble LNCaP-celler inkubert med 0,1 eller 10 mM metformin. LNCaP-celler ble behandlet med 1 enhet /100 ul RQ1 RNase-fri DNase (M6101; Promega) i 10 minutter ble anvendt som en positiv kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Immunohistochemistry
En parafin delen ble gjort fra sentrum av en svulst. Parafinsnitt ble inkubert med anti-GLP-1R antistoff (NBP1-97308, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), anti-P504S antistoff (sc-81710, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-Ki67 antistoff (ab66144; Abcam , Cambridge, UK), anti-AR-antistoff (sc-816, Santa Cruz Biotechnology Inc.) eller anti-fosfor-AMPKα antistoff (Thr172) (# 2535; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Seksjoner analysert for GLP-1Rand fosfor-AMPKα (Thr172) ble deretter inkubert med Alexa Fluor 488 geit anti-kanin IgG (A-11008, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og seksjoner analysert for P504S, AR og Ki67 var senere inkubert med Alexa Fluor 546 geit anti-kanin IgG (A-11010, Life Technologies). Seksjoner ble kontra med DAPI og visualisert ved en LSM710-ZEN 2008 konfokal mikroskop (Carl Zeiss Japan MicroImaging Co., Ltd., Tokyo, Japan). Fire felt av en seksjon ble observert, og positive celler ble talt opp ved hjelp av en hemocytometer. Dataene er gjennomsnittet av fire uavhengige teller i en seksjon.
Western blot analyse
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [8]. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-mTOR (# 2983; Cell Signaling), anti-fosfor-mTOR (Ser2448) (# 2971; Cell Signaling), anti-fosfor-AMPKɑ (Thr172) (# 2535; Cell Signaling), anti-AMPKɑ (# 2532; Cell Signaling) og anti-GAPDH (sc-20375, Santa Cruz). Ekspresjonen av disse proteiner ble undersøkt i LNCaP-celler som ble inkubert i medium med 10% FBS, og deretter stimulert med eller uten 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, eller en kombinasjon av 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin for 24 t
Cell migrasjon analysen
Cell migrasjon analysen ble utført ved hjelp av CytoSelect 24-brønns cellemigrasjon Colorimetric Format analyse (CBA-100-C, Cell Biolabs)., etter produsentens produkthåndboken. Hver brønn inneholdt en Boyden kammer med en 8-um pore polykarbonatmembran og medium inneholdende 10% FBS med eller uten 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, eller en kombinasjon av 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin. Chambers ble valset med 1,5 × 10
5 LNCaP celler eller PC3 celler i serum frie medier og inkuberes ved 37 ° C over natten. Celler i brønnene ble vasket bort, og trekkende cellene ble farget og telles ved hjelp av en mikroplateleser ved OD 570 nm.
Statistisk analyse
Uparet
t-
tester og en- veis analyse av varians (ANOVA) ble utført for statistisk analyse etter behov.
P
verdier under 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Resultater
Exendin-4 og Metformin Nedgang prostatakreft Vekst additivt
in vivo
Vi behandlet atymiske mus, som ble transplantert med LNCaP celler, med subkutant administrert Ex-4, muntlig matet metformin eller kombinert behandling. Etter 6 ukers behandling, tumor mounding var fraværende i en mus av Ex-4-behandlede gruppen, to mus av metformin-behandlede gruppen og tre mus av den kombinerte behandlingsgruppen. Beregning av tumorstørrelse ved bruk av det modifiserte ellipsoide formel avslørte at tumorvolumet betydelig redusert etter behandling med både Ex-4 og metformin sammenlignet med kontrollgruppen, men ytterligere reduksjon i tumorstørrelse ble observert i de kombinerte behandlings mus (figur 1A og 1B). Måling av vekten av de dannede tumorer viste at den kombinerte behandling med Ex-4 og metformin betydelig redusert tumorvekt sammenlignet med den til kontrollgruppen og i den separate behandling med Ex-4 eller metformin (figur 1C). Disse data tyder på at Ex-4 og metformin dempes prostatakreft vekst
in vivo
, og den kombinerte behandling med begge ytterligere redusert tumorvekst additivt.
(A) atymiske CAnN.Cg-
Foxn1nu Twitter /CrlCrlj mus (i alderen 6 uker) ble transplantert med 1 × 10
6 LNCaP celler (passasje 4-8) og behandlet med kjøretøy (n = 10), Ex-4 (300 pmol kg kroppsvekt
-1 dag
1; n = 9), metformin (oppfylt; 750 mg kg
-1 dag
1; n = 10), eller en kombinert behandling av Ex- 4 og metformin (n = 10). Svulster ble fotografert ved 12 ukers alder. (B) Tumorvolumet ble beregnet med den modifiserte ellipsoide formel. Uparet
t-
tester ble utført for å beregne statistisk signifikans (**
P
0,01 vs. kontroll). I mus uten en mounding tumor, ble tumorvolumet beregnet som «null». (C) Tumorvekt ble målt på skalaer. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (**
P
0,01 vs. kontroll;
#
P
0,05 vs. Ex -4). I mus uten mounding tumor, ble tumorvekten beregnet som «null».
i disse musene, den endelige kroppsvekt og plasmaglukosenivå var signifikant lavere i metformin-behandlede gruppe sammenliknet med den kontroll og Ex-4-behandlede grupper (tabell 1). Plasma PSA-nivå litt redusert etter Ex-4 eller metformin behandling alene sammenlignet med kontrollgruppen, og en ytterligere og betydelig reduksjon ble observert etter den kombinerte behandling sammenlignet med kontrollgruppen (tabell 1). Ex-4 økte seruminsulinnivå vesentlig; imidlertid redusert den samlede Ex-4 og metformin behandling det til styrenivå (tabell 1).
Exendin-4 og Metformin Reduser celleproliferasjon og øke GLP-1R Expression
immunhistokjemisk analyse av parafin-embedded deler av subkutane prostata kreft svulster viste at Ki67 uttrykk, som var tydelig lokalisert i kjernen, ble betydelig undertrykt av Ex-4, metformin og den kombinerte behandlingen (fig 2A og 2B). Men en ytterligere reduksjon i Ki67-positive celler ble ikke observert i den kombinerte behandlingsgruppen sammenlignet med de separate behandlinger. Uttrykket av P504S, en prostatakreft markør, dramatisk redusert med Ex-4, metformin og den kombinerte behandlingen (Fig 2C). Kvantifisering av P504S uttrykk basert på det gjennomsnittlige antall P504S-positive celler dividert med det totale antall kjerner bekreftet at det var en signifikant reduksjon i kreftceller etter Ex-4, metformin og den kombinerte behandlingen (figur 2D). Interessant, antallet prostata kreftceller som uttrykker GLP-1R øket etter Ex-4 og /eller metformin behandling (figur 2C). Kvantifisering av den andelen GLP-1R-positive celler viste at den kombinerte behandling betydelig økt antall av GLP-1R-positive celler sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2E). Videre har vi oppdaget at AR-positive celler i prostata cancer tumor (figur 2F). Ingen forandring ble observert i AR uttrykk etter Ex-4 og metformin behandling i prostata cancer tumor (figur 2G).
parafininnstøpte tumorseksjoner (5 mikrometer) ble utsatt for immunhistokjemi for (A) Ki67, ( C) P504S og GLP-1R, og (F) AR, og kontra med DAPI. Forstørrelse, × 400. (B) Ki67, (D) P504S, (E) GLP-1R, og (G) AR-positive celler ble kvantifisert ved å analysere brøkdel av fargede celler i tumoren i forhold til det totale antall kjerner. Verdier er uttrykt som en prosentandel av positive celler. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll).
Exendin-4 og metformin dempe prostate Cancer Cell Proliferation, men ikke cellemigrasjon
Vi undersøkte neste effekten av Ex-4 og metformin på prostatakreft celler
in vitro
. I vår tidligere studie [8], observerte vi at Ex-4 signifikant reduksjon i celletallet av de menneskelige androgen-avhengige celler, LNCaP-celler, og av de humane androgen-uavhengige celler, PC3-celler og DU145 celler i vekstkurver i en dose-avhengig måte. I likhet med den Ex-4-behandling, metformin reduserte celletall på LNCaP-celler (figur 3A), PC3-celler (figur 3B) og DU-145-celler (figur 3C) på en doseavhengig måte. Videre er den kombinerte behandling av 0,1 mM metformin og 10 nM Ex-4 additivt svekkede vekstkurven progresjonen av LNCaP-celler (figur 3D) og PC3-celler (figur 3E), men ikke av DU145 celler (figur 3F). Vi neste undersøkte mekanismen som Ex-4 og metformin inhiberer prostatacancer-cellevekst. Først, utførte vi en BrdU-inkorporering analyse for å vurdere DNA-syntesen. Ex-4 og metformin behandling alene i 24 timer signifikant redusert DNA-syntese i LNCaP-celler (figur 3G). Selv om behandling med metformin alene ikke føre til en statistisk signifikant reduksjon i BrdU-inkorporering i PC3-celler (figur 3 H), Ex-4 og metformin redusert BrdU-inkorporering i både PC3-celler og DU145 celler (figur 3i), på samme måte som LNCaP-celler. Den kombinerte behandlingen av metformin og Ex-fire ytterligere redusert BrdU innlemmelse, noe som tyder på at metformin og Ex-4 additivt redusert DNA-syntese i prostatakreftceller (Fig 3G-3i). Videre utførte vi en migrasjonsanalyse på LNCaP celler og PC3 celler. Men gjorde Ex-4, metformin og den kombinerte behandlingen ikke dempe cellemigrasjon i LNCaP celler (figur 3J). I PC3-celler, ble en liten reduksjon av behandlinger observert, men det var ikke statistisk signifikant (figur 3K). Disse data tyder på at Ex-4 og metformin demper prostatacancer celleproliferasjon, men ikke cellemigrasjon.
(A) LNCaP-celler, (B) PC-3-celler og (C) DU145-celler ble opprettholdt i media supplert med 10% FBS med eller uten metformin (0.1-10mM). Etter 0, 24, 48, 72 og 96 timer, ble cellene høstet, og celleproliferasjon ble analysert ved celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll). (D) LNCaP-celler, (E) PC3-celler og (F) DU145-celler ble opprettholdt som beskrevet i A-C, men med de angitte behandlinger. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll). (G) LNCaP-celler, (H) PC3-celler og (I) DU145-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater i medium supplementert med 10% FBS og inkubert med saltvann (kontroll), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM), eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM) i 24 timer. BrdU-løsning ble tilsatt i løpet av de siste 2 timer, og cellene ble høstet for måling av DNA-syntese ved anvendelse av en mikroplateavleser ved 450-620 nm. Midlere data er uttrykt som et forhold av styre celleproliferasjon. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll,
#
P
0,05 vs. Ex-4,
††
P
0,01 vs. metformin). (J) LNCaP-celler og (K) PC3-celler ble sådd ut som 1,5 x 10
5 i hvert kammer for migreringen analysen. Etter chemo tiltrekning med 10% FBS med eller med saltvann (kontroll), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM) eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM), ble cellene farget og undersøkt hos OD 570 nm. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans.
Metformin induserer apoptose og demper celleproliferasjon i prostatakreftceller via AMPK aktivering
Vi neste undersøkt apoptose bruker tunel analysen. Selv om det ikke apoptotiske celler ble observert i Ex-4-behandlede LNCaP-celler i våre tidligere studie [8], ble en liten, men signifikant antall av apoptotiske celler detektert i 0,1 eller 10 mM av metformin-behandlede LNCaP-celler (figur 4A). Fordi AMPK aktivering er en av de viktigste molekylære mekanismer som metformin virker som et metabolsk og anti-proliferativ middel [21], undersøkte vi AMPK fosforylering i LNCaP-celler ble behandlet med metformin. Som vist i figur 4B, ble AMPK fosforylert etter metformin behandling. Kvantifisering av oppdaget bandet densitometry viste en signifikant induksjon av AMPK fosforylering i metformin-behandlede LNCaP cellene når normalisert mot total AMPK (fig 4C) og vaktmester-genet, GAPDH (Fig 4D). For å avklare om AMPK er det viktigste målet for metformin for demping av LNCaP celleproliferasjon, brukte vi AMPK inhibitor, Compound C, eller slått ned AMPK av siRNA. Som vist i figur 4E og 4F, både Forbindelse C og siAMPK tydelig avbrutt anti-proliferativ effekt av metformin på LNCaP-celler. I tillegg behandlinger med forbindelse C eller siAMPK betydelig økt celletall på metformin behandlet LNCaP celler. Videre er reduksjonen i BrdU-inkorporering indusert av metformin var tydelig opphevet ved både Forbindelse C og siAMPK (figur 4G og 4H), og disse behandlingene økt BrdU-inkorporering i metformin-behandlede LNCaP-celler i overensstemmelse med vekstkurven analyse. Fordi det viktigste målet for den anti-proliferativ effekt av AMPK er inaktivering av mTOR, vi neste undersøkt mTOR aktivering ved hjelp av western blotting. Som vist i figur 4I, ble mTOR fosforylering undertrykt av metformin behandling. Imidlertid densitometry analyse viste at produktet var ikke statistisk signifikant. Disse dataene tyder på at metformin induserer apoptose og demper LNCaP celleproliferasjon via AMPK aktivering.
(A) LNCaP celler ble sådd ut på dekkglass i Lab-Tek to godt Chamber lysbilder. Etter inkubasjon med 0,1 eller 10 mM metformin i 24 timer, eller en enhet /100 ul RQ1 DNase (positiv kontroll) i 10 minutter, ble apoptotiske celler detektert med TUNEL-farging. Bilder vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) LNCaP-celler opprettholdt i medium med 10% FBS ble stimulert med saltvann (kontroll), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM) eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM) i 24 h. Cellelysater ble høstet og utsatt for western blotting å vurdere fosforylert AMPK og AMPK uttrykk. Fosforylert AMPK /AMPK protein nivåer (C) og fosforylerte AMPK /GAPDH protein nivåer (D) ble kvantifisert ved densitometri. Data ble beregnet ut fra tre uavhengige forsøk og er vist som et forhold mellom kontrollen (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll,
#
P
0,05,
##
P
0,05 vs. Ex-4). (E) LNCaP-celler ble opprettholdt i media supplert med 10% FBS med Forbindelse C (0,1 gM; CC) eller kontroll kjøretøy (NT), og med eller uten Met (0,1 mM). Etter 0, 24, 48 og 72 timer, ble cellene høstet, og celleproliferasjon ble analysert ved celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. NT-kontroll,
#
P
0,05 vs. NT-Met 0,1 mm). (F) LNCaP-celler ble opprettholdt i media supplert med 10% FBS etter transfeksjon av 10 nM kontroll siRNA (SICT) eller siRNA for AMPKα1 /2 (siAMPK) med eller uten Met (0,1 mM). Etter 0, 24, 48 og 72 timer, ble cellene høstet, og celleproliferasjon ble analysert ved celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (**
P
0,01 vs. SICT-kontroll,
##
P
0,01 vs. SICT-Met 0,1 mm). (G) LNCaP-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater i media supplert med 10% FBS og inkubert med Forbindelse C (0,1 gM) (CC) eller kontroll kjøretøy (NT), og med eller uten Met (0,1 mM) i 24 timer. BrdU-løsning ble tilsatt i løpet av de siste 2 timer, og cellene ble høstet for måling av DNA-syntese ved anvendelse av en mikroplateavleser ved 450-620 nm. Midlere data er uttrykt som et forhold av styre celleproliferasjon. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (**
P
0,01 vs. Met (-) og Compound C (-),
#
P
0,05 vs. Met (+) og forbindelse C (-)). (H) LNCaP-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater i media supplementert med 10% FBS etter transfeksjon av 10 nM kontroll siRNA (SICT) eller siRNA for AMPKɑ1 /2 (siAMPK) med eller uten Met ( 0,1 mM) i 24 timer. BrdU-løsning ble tilsatt i løpet av de siste 2 timer, og cellene ble høstet for måling av DNA-syntese ved anvendelse av en mikroplateavleser ved 450-620 nm. Midlere data er uttrykt som et forhold av styre celleproliferasjon. Uparet
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å beregne statistisk signifikans (**
P
0,01 vs. Met (-) og siControl,
##
P
0,01 vs. Met (+) og siControl)
Metformin induserer AMPK aktivering og apoptose i prostatakreft
in Vivo
til slutt, for å bekrefte.
