Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) mangfold er i hovedsak relatert til polypose og ikke-polypose arvelige syndromer. I sporadisk CRC, har avvikende genet promoter metylering vist seg å spille en nøkkelrolle i kreftutvikling, men lite er kjent om sitt engasjement i mangfold. For å vurdere effekten av metylering i tumor mangfaldet i sporadisk CRC, hypermethylation av nøkkel tumorsuppressorgener ble undersøkt hos pasienter med både flere og ensomme svulster, som et proof-of-concept på en underliggende epigenetisk defekt.
Methodology /hovedfunnene
Vi undersøkte totalt 47 synkron /metachronous primære CRC fra 41 pasienter og 41 kjønn, alder (5 års mellomrom) og kreftsteds paret pasienter med solitære svulster. Eksklusjonskriterier var polypose syndromer, Lynch syndrom og inflammatorisk tarmsykdom. DNA metylering ved promoter-regionen i
MGMT
,
CDKN2A
, S
FRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A Hotell og
GATA4
gener ble undersøkt ved kvantitativ metylering spesifikk PCR i både svulsten og tilsvarende normalt utseende kolorektal slimhinne prøver. Total, pasienter med multiple lesjoner utviste en større grad av metylering i tumorprøver enn de med enslig tumorer av alle evaluerte gener. Etter å ha justert for alder og kjønn, binomial logistisk regresjonsanalyse identifisert metylering av
MGMT2 plakater (OR 1,48; 95% KI, 1,10 til 1,97; p = 0,008) og
RASSF1A plakater (OR, 2.04 ; 95% CI, 01.01 til 04.13, p = 0,047) som variabler uavhengig assosiert med tumor mangfold, er risikoen knyttet til metylering av noen av disse to genene 4,57 (95% KI, 1,53 til 13,61, p = 0,006). Videre, i seks pasienter der både svulster var tilgjengelig, fant vi en sammenheng i metylering nivåer av
MGMT2 plakater (r = 0,64, p = 0,17),
SFRP1 plakater (r = 0,83, 0,06),
HPP1 plakater (r = 0,64, p = 0,17),
3OST2 plakater (r = 0,83, p = 0,06) og
GATA4 plakater (r = 0,6, p = 0,24). Metylering i normal vises kolorektal slimhinne fra pasienter med multippel og ensom CRC viste ingen relevant forskjell i noen evaluert genet.
Konklusjoner
Disse resultatene gir en proof-of-concept at genet promoter metylering er assosiert med svulst mangfold. Denne underliggende epigenetisk feilen kan ha nevneverdig betydning i forebygging av pasienter med sporadisk CRC
Citation. Gonzalo V, Lozano JJ, Muñoz J, Balaguer F, Pellisé M, de Miguel CR, et al. (2010) Aberrant Gene Arrangøren Metylering Associated med Sporadisk Multiple tykktarmskreft. PLoS ONE 5 (1): e8777. doi: 10,1371 /journal.pone.0008777
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 20 september 2009; Godkjent: 23 desember 2009; Publisert: 19 januar 2010
Copyright: © 2010 Gonzalo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 07-64873), Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PI061384 og PI080024), Asociación Española Contra el Cancer (Fundación Científica og Junta de Barcelona), Fundación INVESTIGACION Médica Mutua Madrileña (PI040296) , Fundación Olga Torres (PI040212), og Acción no Cancer (Instituto de Salud Carlos III). Victoria Gonzalo ble støttet av en bevilgning fra Hospital Clinic, Cristina Rodriguez av et stipend fra Olympus Medical Systems-Europa, Mireya Jimeno av en bevilgning fra Instituto de Salud Carlos III (PI016017), Francesc Balaguer av et stipend fra Fundación Alfonso Martín Escudero , og Sergi Castellvi-Bel av en kontrakt fra Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (CP 03-0070). Centro de INVESTIGACION BIOMEDICA en rød en el Área Tematica de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) er finansiert av Instituto de Salud Carlos III. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Cristina Rodriguez var et forskningsprosjekt sykepleier finansiert av et stipend fra Olympus Medical Systems-Europa. Den Funder, men ble ikke involvert i studien design; innsamling, analyse og tolkning av data; skriving av papir; heller ikke beslutningen om å sende inn for publisering.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en relevant offentlig helseproblem fordi den representerer den nest vanligste ondartet svulst, og også den nest største årsaken til kreftdød i Vestlige land. Arv er bakenforliggende årsak i opptil en tredel av alle CRC tilfeller med svært penetrant og veldefinerte arvelige lidelser, dvs. adenomatøs og hamartomatous polypose og Lynch syndrom, som representerer 3-5% av den totale CRC byrden [1]. I slike forhold, tilstedeværelse av en germline mutasjon i den utløsende genet (dvs.
APC
,
MYH
,
LKB1
,
SMAD4
,
BMPR1A
,
PTEN
,
MLH1
,
MSH2
,
MSH6 Hotell og
PMS2
) [1], [ ,,,0],2], predisponerer disse personene til utviklingen av flere colorectal svulster. Faktisk, mens familiær adenomatøs polypose representerer paradigme for tumor multiplisitet, tilstedeværelse av enten synkron eller metachronous CRC er også en av de mest vanlige kliniske kriterier til å mistenke Lynch syndrom [3].
I tillegg til de ovennevnte arvede tilstander , er tumor multiplisitet også en hyppig overvåkning av pasienter med CRC som ikke er tilsynelatende disponert for disse svulster på grunnlag av deres genetiske bakgrunn. Faktisk er synkrone og metachronous kolorektal adenom rapportert hos opp til 30% og 48% av pasienter med sporadisk CRC, henholdsvis, mens tilsvarende tall for carcinoma er 4% og 9% henholdsvis [4], [5]. I denne innstillingen, tydelig familiær kreft aggregering eller særegne personlige egenskaper er ikke åpent skilles, og selv om en generell mobilnettet eller molekylær uorden i hele tykktarmsslimhinnen kan mistenkes, forblir den underliggende sykdomsfremkallende mekanisme unnvikende.
Et felt effekt liggende kolorektal kreftutvikling er en vel anerkjent situasjon hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom, en premalign tilstand med økt kumulativ risiko for utvikling av CRC forbundet med tidlig alder av utbruddet, sykdomsvarighet, og omfang og graden av inflammasjon [6], [7]. Den nøyaktige mekanismen som kronisk tarmslimhinnebetennelse forårsaker kreft i denne sammenheng er dårlig forstått, selv om det er ment å være relatert til en svikt i reguleringsmekanismer i løpet av celledeling. Kronisk betennelse fører til frigjøring av frie radikaler fra leukocytter og makrofager, og disse reaktive oksygenforbindelser kan kjøre kreftutvikling ved å forårsake DNA-skade [8]. Siden i de fleste tilfeller DNA-skade som fører til inaktivering av tumorsuppressorgener, kan begrepet «felt-effekt» bli bedre betegnes som «-feltet defekten». Antatte involvering av et slikt felt defekt i sporadisk CRC har imidlertid ikke vært tilfredsstillende lagt hittil.
Sporadisk CRC oppstår som følge av opphopning av genetiske og epigenetiske forandringer som forvandler colonic epitelceller i kolon adenokarsinomceller [9]. Tapet av genomisk stabilitet og følge genet endringer er viktige molekylære sykdomsfremkallende skritt som oppstår tidlig i tumorigenesis: de tillater kjøp av et tilstrekkelig antall endringer i tumorsuppressorgener og onkogener som forvandler celler og fremmer tumorprogresjon. Analogt til genomisk instabilitet, epigenetiske ustabilitet resulterer i avvikende metylering av tumorsuppressorgener [9]. Faktisk har epigenetisk tumor suppressor genet Slå ofte vært involvert i alle typer humane tumorer, inkludert CRC [10]. Avvikende cytosin metylering spiller en fremtredende rolle i celle transformasjon når den påvirker gener som ivaretar genom instabilitet. Dette epigenetisk endring kan også påvises i forstadier til kreft og tilsynelatende normale peritumor vev [11], [12], [13], [14], [15], og dermed tyder sitt potensial engasjement i den innledende kreftfremkallende prosessen. Denne antatte feltdefekt forbundet med genpromoteren hypermethylation i normal vises tykktarmsslimhinne har blitt foreslått med hensyn til
MGMT
-genet [12], så vel som
ERα
,
myod
,
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3 Hotell og
DAPK product: [13].
med tanke på at hypermethylation av promoter-regionene i tumorsuppressorgener kunne iakttas i normalt vises tykktarmsslimhinne, hypotese vi at dette fenomenet vil være spesielt relevant for pasienter som utviklet flere CRC. Derfor er målet med denne studien var å evaluere metylering mønstre av gener involvert i kolorektal kreftutvikling gjennom denne mekanismen i både svulstvev og normalt utseende kolorektal slimhinne prøver av pasienter med multippel og ensom CRC, som et proof-of-concept av en antatt underliggende epigenetisk feil forbundet med svulst mangfold.
Materialer og metoder
pasienter
Vi undersøkte totalt 47 synkron /metachronous primære CRC fra 41 pasienter (36 synkron, 4 metachronous og ett begge) og 41 kjønn, alder (5 års mellomrom) og tumor location-paret pasienter med solitære svulster. Kontroll pasienter med solitære svulster ble rekruttert i EPICOLON prosjekt, en prospektiv, multisenter, landsdekkende, populasjonsbasert kohort (n = 1222) [16] og tilfeldig valgt blant de med ingen tidligere CRC og med et minimum oppfølging av 5 år etter diagnose av kreft hvor vanlig koloskopi overvåking ikke identifisere noen ekstra lesjon. Når det gjelder pasienter med multippel CRC, ble 31 også rekruttert i EPICOLON prosjektet og ytterligere 10 pasienter ved Endoskopi Unit av Hospital Clinic i Barcelona mellom juni 2007 og mai 2008. Det var ingen forskjell med hensyn til clinicopathological egenskapene til begge sett med pasienter med flere lesjoner (data ikke vist). Eksklusjonskriteriene for studien var kolorektal polypose syndromer, Lynch syndrom og personlige historie av inflammatorisk tarmsykdom. Demografiske, kliniske og kreftrelaterte karakteristika for pasienter inkludert i studien er oppsummert i tabell 1. Studien ble godkjent av den institusjonelle etiske komité for hver deltakende sykehus, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Medlemmer av EPICOLON prosjektet er oppført i note S1.
Frozen svulst og tilsvarende normal-vises, peritumor tykktarmsslimhinnen vev ble oppnådd enten ved kirurgi eller endoskopi fra alle pasienter, og umiddelbart lagret ved -80 ° C inntil bruk. Hos pasienter med multiple lesjoner, ble vevsprøve oppnådd fra minst en tumor (den mest avanserte ene eller den største når flere tumorer hadde den samme tumorstadium).
DNA Isolering og Bisulfite behandling
frosne prøver ble tint og genomisk DNA ble isolert ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Bisulfite behandlingen ble utført på genomisk DNA ved hjelp av EZ DNA Metylering-gull Kit® (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til produsentens protokoll med mindre modifikasjoner beskrevet nedenfor [17]. Denne prosedyren integrert DNA denaturering og bisulfite konvertering til ett-trinns, ved hjelp av temperatur denaturering å erstatte kjemisk denaturering med natriumhydroksid, og det var basert på en tre-trinns reaksjon prosess mellom cytosin og natriumbisulfitt som konverterer unmethylated cytosines inn uraciler. En mengde på 250 ng genomisk DNA isolert fra hver tumor eller normal vevsprøve ble anvendt per reaksjon, og et volum på 15 ul ble anvendt for hver bisulfited DNA som skal elueres. Det resulterende DNA ble anvendt for PCR-amplifikasjon eller lagret ved -80 ° C.
Quantitative Metylering Spesifikke PCR
Etter bisulfitt omdannelse, duplikater av 0,5 ul av hver bisulfited-DNA ble amplifisert ved MethyLight teknikken , en tidligere beskrevet fluorescens-basert kvantitativ real-time PCR, svært spesifikk, sensitiv og reproduserbar analyse [18]. Locus spesifikke PCR primere og prober for sju tumorsuppressorgener –
MGMT1 plakater (minimal promoter),
MGMT2 plakater (Enhancer region),
CDKN2A
,
SFRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A Hotell og
GATA4 Anmeldelser – ble spesielt utviklet for bisulfited-konvertert DNA-sekvenser og ligger på hver genet promoter-regionen. Disse genene ble valgt for deres engasjement i kolorektal kreftutvikling gjennom metylering drevet taushet bevis for en viss grad av hypermethylation i normal-vises, peritumor tykktarmsslimhinnen motstykke (tabell 2). I så måte er det viktig å understreke at gener foreslått som markører av CpG island methylator fenotype som per definisjon er nesten utelukkende metylert i kreftvev ble unngått. Primer og prober som brukes for bisulfited DNA-sekvenser er notert på Tabell S1. Fullt unmethylated og fullt
Sss
l-metylerte DNA ble anvendt som opprinnelig 0 og 100% metylerte referanser for å teste forsterknings resultater, og metylert DNA ble videre anvendt som kalibrator for alle testede prøver.
ALUC4
-genet ble anvendt som endogene referanse for å normalisere for mengden av inngangs DNA [19]. De MethyLight reaksjoner ble utført på en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) med et sluttvolum på 12,5 ul inneholdende 900 nM av hver primer og 250 nM av den tilsvarende sonde. PCR-betingelsene var: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 92 ° C i 15 sekunder og 58 ° C i 1 minutt, slik det ble tidligere beskrevet [18]
Hver. måling i en gitt prøve er utført i duplikat for begge testet og endogene gener, og terskelsyklusen (C
t) -den brutt tall ved hvilken mengden av amplifisert mål nådd en fast terskel ble bestemt. Standardavviket i prøve duplikater var alltid under 0,2. Relative mengder av både gener ble også normalisert til kommersiell 100% denaturert DNA (Zymo Research, Orange, CA) opptrer som kalibrator for å tillate sammenligning på tvers av alle testede prøver. Den komparative C
t metoden [20], også kjent som 2
-ΔΔCt metoden, ble beregnet fromwhere
A C
t, prøven ble testet gener C
t-verdi for enhver prøve normalisert til
ALUC4
, og
A C
t, kalibrator var testet gener C
t-verdien for den kalibratoren også normalisert til
ALUC4
. Resultatet kommer fra
ΔΔC
t × 100 tilsvarer andelen metylert referanse (PMR), som angir hvor stor prosentandel av fullt denaturert molekyler på et bestemt locus [21].
Etterforskerne utfører metylering spesifikke PCR sanntids eksperimenter ble blindet for de kliniske kjennetegn ved pasientene (dvs. svulst mangfold).
Evaluering av tumor mismatch reparasjon mangel
tumor mismatch reparasjon mangel ble evaluert av både farging og mikro ustabilitet testing. Immunhistokjemisk analyse inkludert evaluering av MSH2 (anti-MSH2, onkogen Forskning Produkter, Boston, MA), MLH1 (anti-MLH1, PharMingen, San Diego, California) og MSH6 (anti-MSH6, BD Transduction Laboratories, San José, California), som beskrevet andre steder [16]. Tumorceller ble bedømt til å være negative for protein ekspresjon bare hvis de manglet farging i en prøve hvor normale colonocytes og stromaceller ble farget. Hvis ingen immunofarging av normalt vev kan bli demonstrert, ble resultatene betraktes som upålitelig. Mikro ustabilitet ble vurdert ved hjelp av 5-markør panel foreslått av National Cancer Institute og /eller Pentaplex av mononukleotid gjentar, som beskrevet andre steder [22].
Statistical Analysis
Sammenligning av metylering grad mellom flere og ensomme CRC pasienter ble utført kvalitativt hvor metylering positivitet ble satt som PMR ≥4, som tidligere validert [23]. Siden informasjon om metylering i normal vises kolorektal slimhinne var begrenset, ble analysen i denne innstillingen utført i henhold til både en ≥4 PMR cut-off og en ekstra, vilkårlig valgt ≥1 PMR cut-off for å konstatere eventuelle mindre effekt. Analysen ble utført ved hjelp av Fishers eksakte test. Sammenheng mellom metylering nivåer av kreft parene ble analysert ved Spearman korrelasjonsanalyse.
Sammenligning mellom pasienter med flere og ensomme svulster om metylering grad i både tumor og normalt utseende kolorektal slimhinne prøvene ble også utført ved hjelp av binomisk logistisk regresjon, både ujustert og justert for alder og kjønn. Videre testet vi den uavhengige effekten av genet metylering på tumor mangfold ved å inkludere alle evaluerte gener i binomial logistisk regresjonsmodell, sammen med alder og kjønn. Disse variablene ble «luket» ved hjelp av en automatisk trinnvis prosedyre for å optimalisere Akaike informasjon kriteriet [24]. Multiplikative interaksjoner ble testet for hvert par av gener uavhengig assosiert med tumor mangfold ved å inkludere både hovedeffekter og et interaksjonsledd (et produkt av to hovedeffekter) i den logistiske regresjonsmodellen. Til slutt testet vi de kumulative effekter av metylert gener på tumor multiplisitet ved å telle antallet av utvalgte gener uavhengig av hverandre forbundet med dette fenomenet i hvert fag. Sannsynlighetsforholdet for tumor multiplisitet for pasienter som bærer en hvilken som helst kombinasjon av de valgte metylert genene ble beregnet ved å sammenligne dem med pasienter bærende ingen av disse gener ved bruk av logistisk regresjonsanalyse. Statistiske analyser ble utført med «R» (R Kjerne Development team, https://www.R-project.org).
Kontinuerlige variabler ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Alle p-verdiene var tosidig. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere en statistisk signifikant forskjell.
Resultater
Førti-en pasienter med enten synkron eller metachronous CRC, og 41 kjønn, alder og tumor plassering-paret pasienter med enslig tumorer var grunnlaget for denne studien. Som det er vist i tabell 1, begge grupper av pasienter som var like med hensyn til eventuelle demografiske, kliniske og tumor-relaterte egenskaper, bortsett fra nærværet av synkrone kolorektale adenomer.
genpromoteren Metylering i tumorprøver
Sammenligning av genpromoteren metylering i tumorprøver fra pasienter med multiple og enslig CRC er vist i tabell 3. Generell, pasienter med multiple lesjoner utviste en større grad av metylering i tumorprøver enn de med enslig tumorer av alle evaluerte gener. Andelen av svulster stiller genet promoter hypermethylation var signifikant høyere hos pasienter med flere lesjoner enn i de med enslig CRC med hensyn til
MGMT2 plakater (40,4%
vs
henholdsvis 14,6%,;. P = . 0,009) og
RASSF1A plakater (17,0%
vs
0%, henholdsvis; p = 0,006) (tabell 3)
Evaluering av risiko for svulst. mangfold forbundet med genet promoter metylering i tumorprøver er vist i Tabell 4. etter å ha justert for alder og kjønn, indikerte binomial logistisk regresjonsanalyse som metylering av promoter regioner av
MGMT1
locus (odds ratio (OR), 1,57 95% konfidensintervall (CI), 1,01 til 2,43; p = 0,04),
MGMT2
locus (OR, 1.50; 95% CI, 1,14 til 1,96; p = 0,003), og
RASSF1A
genet (OR, 2.02; 95% CI, 1,03 til 3,93; p = 0,03) var assosiert med økt risiko for å utvikle multippel CRC (tabell 4)
Den justerte multivariate logistisk regresjonsanalyse. identifisert metylering av
MGMT2
locus (OR, 1.48; 95% KI, 1,10 til 1,97; p = 0,008) og
RASSF1A
genet (OR, 2.04; 95% CI, 01.01 til 04.13, p = 0,047) som variabler uavhengig assosiert med tumor mangfold. I tillegg, når produktet av disse to variabler ble tilsatt til regresjonsmodellen, dette kryssledd ikke ble valgt (OR, 0,88; 95% CI, 0,67 til 1,16; p = 0,37). Til slutt, når den kumulative effekten av denaturert gener ble evaluert, er risikoen for tumor mangfold forbundet med metylering av en hvilken som helst av disse to utvalgte gener var 4,57 (95% CI, 1,53 til 13,61; p = 0,006), uten noen vesentlig økning når begge genene ble samtidig metylert (OR, 2.31; 95% CI, 0.00 til ubestemt; p = 0,99).
til slutt analyserte vi sammenhengen i metylering nivåer i undergruppe av seks pasienter med flere svulster i hvem både svulster var tilgjengelig for analyse (figur 1). Denne analysen viste en ikke-signifikant korrelasjon i metylering nivåer av
MGMT2 plakater (r = 64, p = 0,17),
SFRP1 plakater (r = 0,83, 0,06),
HPP1
(r = 0,64, p = 0,17),
3OST2 plakater (r = 0,83, p = 0,06), og
GATA4 plakater (r = 0,6, p = 0,24).
MGMT1 Hotell og
CDKN2A
viste ikke tegn på samsvar mellom svulster i samme pasient (r = -0,05, p = 0,91; r = -0,09, p = 0,91, henholdsvis), og
RASSF1A
sjelden ble metylert i disse svulstene, som utelukket en skikkelig korrelasjonsanalyse.
Resultatene er uttrykt som prosentandel av metylering basert på PMR.
Gene Arrangøren metylering i normalt utseende tykktarmsslimhinnen Prøver
Metylering i normal vises kolorektal slimhinne fra pasienter med multippel og ensom CRC viste ingen relevant forskjell i noen evaluert gen (tabell 5). For å fastslå eventuelle mindre effekt, ble analysen gjentatt ved bruk av en ≥1 PMR cut-off (tabell 5). I denne andre analysen, ble det ikke observert konsekvent metylering mønster, med noen gener som viser hypermethylation (dvs.
MGMT1
,
MGMT2 Hotell og
RASSF1A
) og andre hypometylering (dvs.
SFRP1
,
TMEFF2 Hotell og
GATA4
) hos pasienter med flere lesjoner. Ingen av disse forskjellene var statistisk signifikante (Tabell 5).
Diskusjoner
Resultatene av denne studien viser at svulster fra pasienter med synkron og metachronous CRC utstillings en høyere grad av metylering enn de fra pasienter med solitære lesjoner. Tumor hypermethylation av
MGMT
genet enhancer regionen og
RASSF1A
genet promoter-regionen ble identifisert som variabler uavhengig assosiert med en fem ganger økt risiko for å utvikle flere lesjoner. Videre fant vi tilsvar metylering mønstre i svulst par fra samme pasient. Samlet er disse observasjonene gir et proof-of-concept of en epigenetisk defekt formidlet av genet promoter hypermethylation som favoriserer svulst mangfaldet i sporadisk CRC.
Sterke av denne studien stole på det faktum at det ble utført på en generell befolkningen gjennom en prospektiv, multisenter, landsomfattende studie der uselekterte og påfølgende pasienter med CRC ble inkludert uavhengig av deres personlige og familiære kjennetegn; foregående genetisk karakterisering utført i sammenheng med EPICOLON prosjekt tillates en tilstrekkelig identifikasjon og påfølgende utstøting av pasienter med arvet lidelser (dvs. kolorektal polypose, Lynch syndrom og MYH-assosiert CRC) [16], [22], [25], [26 ], [27], [28], i hvem en bestemt og veldefinert molekylære mekanismen rettferdiggjør svulst mangfold; den representerer den største serie av pasienter med multiple lesjoner vurderes så langt for tumor metylering, så vel som den første studie hvor en kontrollgruppe av pasienter med en enslig lesjon ble inkludert i tilstrekkelig lagdeling til kjønn, alder og tumor plassering; og til slutt, kvantitativ metylering spesifikk PCR ble utført i både tumorprøve og paret normal vises tykktarmsslimhinnen, og data analysert i blindt.
Vi er klar over, men for noen begrensninger i denne studien. Først RNA prøver var ikke tilgjengelig til å utføre parallelle uttrykk analyser og verifisere den biologiske betydningen av genet promoter metylering. Ikke desto mindre er det en stor mengde bevis som MethyLight analysene gir en utmerket korrelasjon mellom promotoren metylering og genet Slå på lignende tumor innstillinger [11], [29]. Mer uklart, men med hensyn til verdien av disse resulterer i ikke-neoplastiske vev. Selv om det har blitt foreslått at epigenetisk signaturen til kreftformer kan ha tidlig stadium, normal-vev motstykker potensielt er involvert i initieringen av kreftfremkallende prosess [14], er det fremdeles uklart om den samme cut-off av metylering anvendt for tumorprøver ( dvs. PMR ≥4) kan anvendes i ikke-neoplastiske vev. For å overvinne denne begrensningen, resultater oppnådd i normal vises tykktarmsslimhinne ble analysert ved bruk av to forskjellige cut-off-nivået. For det andre, denne studien representerer en kandidat-gen, hypotesedrevet undersøkelse der et redusert antall gener ble valgt på bakgrunn av tidligere informasjon demonstrere deres engasjement i kolorektal kreftutvikling gjennom metylering-mediert genet Slå, og bevis for en avtagende grad av hypermethylation blant tumor, peritumor normal vises tykktarmsslimhinne, og normal tykktarmsslimhinne fra ikke-tumor individer. Hovedformålet med denne tilnærmingen var å tilveiebringe en proof-of-concept av potensialet involvering av genpromoteren hypermethylation i tumor multiplisitet snarere enn å identifisere den epigenetisk signatur bak denne prosessen. For å nå dette siste målet er high-throughput teknikker med genome wide evne nødvendig, en tilnærming for tiden pågår i vårt laboratorium. For det tredje evaluering av normal-vises tykktarmsslimhinne var begrenset til peritumor område i de aller fleste tilfeller, da de fleste prøver ble oppnådd fra kirurgiske prøver. Dette aspektet utelukker generalisere resultatene oppnådd i tilsynelatende normal slimhinne til hele tykktarmen. Faktisk, slående kolon segmentspesifikke forskjeller i forekomsten av metylering av noen gener (dvs.
MLH1 Hotell og
MGMT
) har blitt observert [14]. Hvordan dette scatter mønsteret vil påvirke mulig bruk av metylering analyse i CRC risikovurdering og dermed mulige metylering drevet screening og overvåking strategier, blir nå vurdert.
Et felt defekt formidlet av
MGMT
genpromoteren metylering er tidligere blitt foreslått [12]. I den banebrytende studie, hypermethylation av
MGMT
genet ble observert hos 46% av svulster så vel som i 50% av normal vises kolorektal slimhinne prøver av pasientene som
MGMT
promoter metylering ble funnet i det tilsvarende tumor. I en annen studie, deltakelse av DNA metylering i fem CIMP-spesifikke genet arrangører, inkludert
MGMT
, ble også vurdert i seks synkrone karsinom par [30]. I denne studien ble det observert at mens noen kreft parene viste uharmoniske metylering mønstre, andre viste lignende, men ikke helt identiske, profiler av arrangøren metylering, noe som tyder på at epigenetiske forandringer i synkron CRC sannsynlig har både tilfeldige og nonrandom komponenter [30]. . Nylig Konishi
et al
funnet signifikante forskjeller i metylering mellom flere svulster i forhold til ensomme lesjoner for
MGMT product: (. 26,5%
vs
17,3%, p 0,05) og
P14 plakater (16,1%
vs
9,3%, p. 0,05) [31]. Interessant, disse forfatterne fant en signifikant sammenheng for metylering av ulike gener, inkludert
MGMT
, mellom svulst par av samme sted (proksimale
vs.
Distal). Dessverre er denne interessant problem kan bare delvis løst i vår undersøkelse siden, på grunn av utformingen av EPICOLON prosjekt, var bare en tumorprøve oppsamlet fra de fleste pasienter med synkron CRC, og dermed begrense denne parvis sammenligning med 6 pasienter. Selv om de positive korrelasjoner for
MGMT2
nådde ikke statistisk signifikans (sannsynligvis på grunn av lavt antall sammenkoblede svulster tilgjengelig), våre resultater er konsistente med data innhentet av Konishi
et al.
[31 ], støtter hypotesen om at pasienter med flere svulster viser konkordant metylering i sine tumorvev. Ganske nylig, i et banebrytende publikasjon, LINE-1 metylering nivåene var signifikant korrelert i 10 synkrone CRC par, og dermed forsterke hypotesen om et felt effekt [32].
Metylering-forbundet inaktivering av
RASSF1A
har blitt hyppig observert i flere menneskerettighets maligniteter inkludert sporadisk CRC [33], [34], [35], [36], [37]. Faktisk svulst promoter hypermethylation av
RASSF1A
forekommer hos ca. 20% av CRC, og det ser ut til å eksistere en gjensidig utelukkende forhold med tilstedeværelse av
KRAS
mutasjoner [34], [35]. Interessant, i svulster med mismatch reparasjon mangel, ble det ikke observert noen signifikante forskjeller i hyppigheten av
RASSF1A
metylering mellom ustabil sporadisk CRC og svulster assosiert med Lynch syndrom [37]. De ovennevnte resultater [32], sammen med demonstrasjon av
RASSF1A
metylering i tumorprøver fra pasienter med flere lesjoner, og mangelen på forskjeller i andre faktorer som disponerer for svulst mangfold (dvs. familiens historie) favorisere hypotesen av en underliggende epigenetisk defekt. Men om dette metylering-drevet genet Stillemekanismen representerer en potensiell felt effekt på grunn av en uidentifisert molekyl endring i normal slimhinne eller ekspresjon av pre-eksisterende flere hyperplastiske polypper fra hvilken CRC oppstår gjennom den taggete veien [38], slik det har vært nylig foreslått [32], er ukjent.
Som det ble nevnt, avvikende metylering av noen CpG øyer har blitt sett i normal vises tykktarmsslimhinnen. I en studie [13], var dette fenomenet demonstrert for
ERα Hotell og
myod
gener, samt for
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3 Hotell og
DAPK
gener på et lavere nivå. Interessant nok ble enkelte genet polymorfismer assosiert med en lavere metylering av CPG øyer som ble undersøkt, og dermed tyder på at genetiske faktorer kan påvirke dette epigenetisk endring i normal tykktarmsslimhinne [13]. De fysiologiske tilstander forbundet med avvikende promoter metylering i tilsynelatende normale tykktarmsslimhinnen har også nylig blitt evaluert med hensyn til to DNA-reparasjonsgener,
MLH1 Hotell og
MGMT product: [14]. I den studien prøver fra menn, viste ingen konsistente mønstre for enten promoter, men forekomsten av
MLH1
og
MGMT
metylering økte signifikant med alderen, særlig i rett tykktarmen, og var i overensstemmelse med gjeldende epigenetiske profiler av CRC undergrupper.
