Abstract
Sutherlandia frutescens
(L) R. Br. (Sutherlandia) er en sørafrikansk botanisk som tradisjonelt brukes til å behandle en rekke helsetilstander, infeksjoner og sykdommer, inkludert kreft. Vi antok Sutherlandia kan fungere gjennom Gli /Hedgehog (Hh) -signaling i prostatakreftceller og brukt RNA-Seq transkripsjon profilering for å profilere genekspresjon i TRAMPC2 murine prostata kreft celler med eller uten Sutherlandia ekstrakter. Vi fant 50% av HH-responsive gener kan bli undertrykt av Sutherlandia etanol ekstrakt, inkludert de kanoniske Hh-responsive gener
Gli1 Hotell og
Ptch1
samt nylig preget Hh-responsive gener
Hsd11b1 Hotell og
Penk
Citation. Lu Y, Starkey N, Lei W, Li J, Cheng J, Folk WR, et al. (2015) Hemming av Hedgehog-Melde Driven Gener i prostata kreft celler med
Sutherlandia frutescens
Extract. PLoS ONE 10 (12): e0145507. doi: 10,1371 /journal.pone.0145507
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 09.10.2015; Godkjent: 04.12.2015; Publisert: 28.12.2015
Copyright: © 2015 Lu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Datasettet er lagres i NCBI-GEO, er det sjonsnummer GSE75760
Finansiering:. Denne publikasjonen eller prosjektet ble gjort mulig delvis av Grant Number P50AT006273 fra Nasjonalt Senter for komplementær og Integrative Health (NCCIH), Office of Dietary kosttilskudd (ODS), og National Cancer Institute (NCI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mer enn 200.000 nye tilfeller av prostatakreft (PCA) er diagnostisert og nesten 30 000 mennesker dør av denne sykdommen hvert år i USA [1]. Prostatakreft er tradisjonelt behandles med hormonelle antagonister, androgen ablasjon og /eller kjemoterapi. Imidlertid er gjentakelse av prostatakreft hyppig og ervervet resistens overfor tradisjonelle behandlinger er vanskelig å kontrollere. Nye tilnærminger som effektivt kan målrette og blokkere signalveier som fører til tilbakefall, er legemiddelresistens og kreft progresjon nødvendig [2-4].
unormalt aktivert Hedgehog (Hh) signalveien fører til avansert PCa og metastase, og er viktig også for andre kreftformer som medulloblastoma, basalcellekarsinom, småcellet lungekreft, tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft [2,3,5-7]. Blokkerer aktivert Hh-signalveien i en prostatakreft xenograft modell helt fortrengt vekst av aggressive PCa svulst. Inhibering av Hh-signalveien i andre krefttyper har vist seg å være et effektivt middel for å behandle kreft. Vismodegib, en Hh-signal inhibitor, har nylig blitt godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for basalcellekarsinom behandling [3,8-10].
Lappet (ptch) og glattes (Smo) er to viktige membranproteiner i Hh-signalveien. Ptch undertrykker Smo aktivitet når den ikke er bundet av sin ligand Hh. Når Hh ligand binder seg til ptch, er inhibering frigjøres og Smo er aktivert. Aktivert Smo fører til en signalkaskade som nedstrøms effekter inkluderer trans og aktivering av Gli familie av transkripsjonsfaktorer og transkripsjon av veien målgener, for eksempel
gli1 Hotell og
ptch1
.
Blokkerings Hh-signal bruker anlegget sekundær metabolitt cyclopamine (eller RNA interferens fra Gli) undertrykker spredning av flere menneskelige prostata kreft cellelinjer [11]; imidlertid, er cyclopamine s potent inhiberende virkning ikke er terapeutisk gunstig, på grunn av sin hurtige clearance, ikke-spesifikk toksisitet og ustabilitet, så vel som off-target-effekter ved høye konsentrasjoner [3,12]. Derfor, identifisere nye hemmere av Hh veien kalles for å hemme prostata kreft spredning og tumorigenesis.
Sutherlandia frucescens
(
S
.
frucescens
eller Sutherlandia) er en medisinsk plante fra Sør-Afrika som det er allment kjent som «kreft bush» på grunn av sin søknad i behandling av kreft [13-15]. Ekstrakter av Sutherlandia har vist anti-spredning og apoptotisk effekt på brystkreftceller, livmorhalskreftceller og kinesiske hamsterceller [16-19]. Imidlertid har målene og mekanismer for disse effektene ikke er identifisert. Tidligere studier i vårt laboratorium avdekket flere botaniske forbindelser som potensielt hindrer prostatakreft via Hh-signalveien hemming [20,21], og vi antatt at det anti-kreft effekt av Sutherlandia er på grunn av hemming av Hh-signalveien. Ved hjelp av neste generasjons sekvensering, undersøkte vi de Hh-signal nedstrøms genuttrykk endringer, samt Sutherlandia trekke responsive gener i murine prostatakreft cellelinje TRAMPC2. Når Sutherlandia ekstrakt ble påført på TRAMPC2 celler med aktiverte Hh-signalering, observerte vi undertrykkelse av et stort antall av Hh-signale målgener, noe som indikerer
S
.
frutescens
inneholder sterke anti-Hh signaliserer forbindelsen (e). Derfor
S
.
frutescens
kanskje et potensielt nyttig komplementær behandling for avansert PCa og andre Hh-signal drevet kreft.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av etanol ekstrakt av
S
.
frutescens
Første
S
.
frutescens
pulver ble kjøpt fra Big Tree nutraceutical (Fish Hoek, Sør-Afrika), og karakteriseres som beskrevet tidligere [22]. For utarbeidelse av etanol ekstrakt av
S
.
frutescens
, 10g av bakken
S
.
frutescens
blad ble blandet med 250 ml 95% etanol over natten. Supernatanten ble deretter høstet, sentrifugert, sterilisert og lagret ved -80 ° C. Før bruk,
S
.
frutescens
etanol ekstrakt [23] ble tørket ned med speed-vakuum, og re-suspendert i én tyvendedel volum av DMSO med en endelig ekstrakt konsentrasjon på 84 mg /ml.
Cellekultur og reagenser
mus TRAMPC2 prostata kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i komplett RPMI 1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS), insulin, og DHT.
Hh peptid Kondisjonert medium (Hh-CM) ble generert fra HEK293 cellelinje overekspresjon Hysj-N-terminal peptid (HEK293-ShhN, en slags gave fra Dr. Phillip Beachy, Stanford University) [24]. HEK293-ShhN-celler ble dyrket til 80-90% konfluens i DMEM-medium inneholdende 10% FBS, 1% Pen /Strep og 40 mg /ml G418. Mediet ble deretter byttet til DMEM inneholdende 2% FBS, 1% Pen /Strep. Etter 24-30 timer ble Hh-kondisjonert medium samlet og filtrert gjennom 0.22μm filtre og lagret ved -80 ° C.
Reverse Transcription og Real time PCR
Total RNA ble isolert og renset fra TRAMPC2 celler ved anvendelse av RNeasy-sett (Qiagen). 1000ng av total RNA ble benyttet for å lage cDNA-bibliotek ved hjelp av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen) med tilfeldige primere og oligodT. Real time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn qPCR (iQ Supermix, BioRad) på ABI7500 system. qPCR betingelse: 95 grader, 30 sekunder; 60 grader, 40 sekunder; 72 grader, 40 sekunder. Primer sekvenser er oppført i S4 tabell. Hver qPCR-analyse ble gjentatt 3 ganger på to biologiske replikater. T-test ble utført på Hh-CM vs. kontroll og Hh-CM + SFE vs. Hh-CM sammenligninger, er p-verdi cut-off 0,05.
RNA-Seq, differensielt uttrykte gener, og Bio-analyse
TRAMPC2-celler ble behandlet med 8ug /ml og 80ug /ml SFE med eller uten Hh-CM i 24 timer, med hvert forsøk gjentatt to ganger. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen), og RNA-konsentrasjonen ble kvantifisert. Kvaliteten av total RNA ble analysert ved hjelp Bioanalyzer (RIN poengsum 7,0). 2500ng total RNA fra hver av de to biologiske replikater av hvert eksperiment ble brukt til å generere sekvensbiblioteker ved hjelp av TruSeq Stranded mRNA Prøvepreparering kits (Illumina, CA). 50bp lang single-end dypt sekvensering ble utført ved University of Missouri DNA Kjerne hjelp Illumina HiSeq 2000-systemet. Rå sekvense filer, samt metadata, sendes til NCBI GEO. GEO sjonsnummer: GSE75760. FASTX-Toolkit ble brukt til å fjerne adapter sekvenser, trim og filtrere lav kvalitet basen samtale og lav kvalitet leser (https://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Filtrert kort sekvensering leser ble kartlagt til muse-genomet (UCSC MM9) med TopHat2 og genekspresjon verdier ble kvantifisert ved hjelp Subreads pakke FeatureCounts funksjon [25-27]. Genuttrykk verdier ble videre brukt til å beregne for bibliotek størrelse og datasett spredning for forskjellig uttrykt gen analyse [28,29]. I korthet, leser rå sekvensen til hvert gen ble normalisert til biblioteket størrelsen av hver prøve og ble omdannet til telle per million (cpm). Gene differensial uttrykk ble testet ved hjelp av R /Bioconductor pakke EDGER [30]. Differensielt uttrykte gener bestemmes av Logg
2 ganger endring (Log
2FC) og False funnrate. (FDR, Logg
2FC ≥1 eller ≤-1; FDR≤0.05)
Gene satt funksjonell og sti analyse ble analysert ved hjelp av Gene ontologi (GO) og KEGG veien. Genet IDer av interesse ble konvertert til EntrezID og lastet til David bioinformatikk [31]. GO analyse og KEGG sti analyse ble så utført ved å sette alle GO vilkår og KEGG pathway gener som bakgrunns gener. Overrepresentert GO vilkår eller trasé bestemmes av berikelse score (EASE≤0.1, genet count≥2).
Resultater
Sutherlandia endret genuttrykk
Sutherlandia etanol ekstrakt ( «SFE «) brukt på celler ved 8ug /ml resulterte ikke i noen forskjellig uttrykt gen som møtte vår statistisk cutoff (data ikke vist). Men bruk av 80ug /ml SFE endret mRNA uttrykk av 204 gener, med 66 gener nedregulert, og 138 gener oppregulert (fig 1A, S1 tabell). Gene ontologi (GO) analyse og KEGG sti analyse av disse endrede gener pekt på mulige mål av SFE. Den oppregulering av
IL6
,
Il15
,
Il18bp
,
cxcl9
,
cxcl10
,
CXCL13
og
TLR3
foreslå mål å være immune og inflammatoriske beslektet (fig 1B) og sti analyse understreket NF-kB signalveien og JAK-STAT signalveien:
IL6 Hotell og
cxcl10
være transkripsjons mål av NF-kB og cytokiner
Ifnb1
,
IL6
,
Il15
sammen med cytokiner reseptor
Il12rb1
,
Il15ra
være nedstrøms JAK-STAT signalering (figur 1C og 1D).
(A) differensielt uttrykte gener i respons til Sutherlandia ekstrakt behandling. Gener som er relatert til (B, C, D), er merket. (B) Gene ontologi analyse av Sutherlandia responsive gener. (C, D) KEGG pathway analyse av Sutherlandia responsive gener.
Sutherlandia undertrykker Hedgehog-signalveien
Hh ligand-beriket kondisjonert medium (Hh-CM) behandling av TRAMPC2 celler for 24 timer førte til 110 differensielt uttrykte gener, med 80 gener oppregulert og 30 gener nedregulert (S2 Table). Klassiske Hh-signal målgener
gli1 Hotell og
ptch1
var oppregulert (figur 2; S1 figur) og indikerer at TRAMPC2 celler er Hh-responsive
TRAMPC2 celle. ble behandlet med enten Hh-CM eller ko-behandlet med Hh-CM og 80 ug /ml SFE. Over 50% av Hh-responsive gener ble undertrykt av SFE behandling. Genuttrykk verdier ble representert av log2 forvandlet normalisert RNA-seq leser (log2 teller per million-leser) og fargekodet.
Samtidig behandling av SFE trykt 42 Hh-CM oppregulert gener og stimulert 10 Hh-CM nedregulert gener (fig 2). Den Hh-signalnettverk endrede gener som kan bli undertrykt av SFE inkluderer de klassiske Hh-signal målgener
gli1 Hotell og
ptch1
, samt nylig preget gener
hsd11b1 Hotell og
Penk plakater (figur 3; S1 fig). Andre differensielt uttrykte gener var immune og betennelsesrelaterte, inkludert
IL6
,
Il15
,
cxcl9
,
cxcl10
,
cxcl11
ccl12
,
CXCL13
,
TLR3
,
tlr12
,
ifnb1 Hotell og
il12rb1 plakater (S3 Tabell).
Kvantitativ PCR for (A)
gli1
, (B)
ptch1
, og (C)
hsd11b1
ble utført på Hh ligand behandlet og Hedgehog ligand og SFE co-behandlet TRAMPC2 celler. Avskrifter konsentrasjoner ble normalisert å kontrollere. * Indikerer p 0,05. I den nederste figuren, transkripsjoner konsentrasjoner av (A)
gli1
, (B)
ptch1
, og (C)
hsd11b1
er representert ved kvantifisert sekvense leser i form av tellinger per million-leser.
Diskusjoner
Sutherlandia, også kjent som kreft bush, er en fremtredende og mye brukt urtemedisin i Sør-Afrika [32]. Dens mål og virkningsmekanismer mot kreftceller er i stor grad ukjent. I studier knyttet til dette, har vi observert Sutherlandia ekstrakt å være veksthemmende i flere PCA cellelinjer og fant administrasjonen av Sutherlandia å trampe mus reduserer forekomsten av dårlig differensiert karsinom [21].
Med en hypotese om at den celleproliferasjon inhibering av SFE er på grunn av dens potensielle Hh-signalveien inhibering har vi identifisert en gruppe av Hh-signale responsive gener i TRAMPC2 celler, og fant SFE var i stand til å undertrykke 50% av dem. Dette tyder SFE har sterke Hh-signal hemmende effekter.
Interessant, foster binyrene etter mors inntak av
Veratrum californicum
, som inneholder Hh-signal hemmer cyclopamine, syntetisert mye mindre kortisol, kortison og corticosterone enn mors binyrene, som indikerer kortikosteroid biosyntese er også sterkt knyttet til Hh-signal aktivitet [33]. HH-endrede gener som finnes i TRAMPC2 celler samt Hh-endrede gener i embryonale fibroblast celler og prostataceller, inkludert kortisol-kortison konvertering enzym koding genet hydroksysteroiddehydrogenase 11 Beta 1 (
hsd11b1
).
Hsd11b1
svart på Hh-signale aktivering, mens Sutherlandia trekke behandling, eller Smo hemmer behandling, kan undertrykke Hh-signalveien effekt på dette genet [34]. Vi konkluderer med at
hsd11b1
er en Hh-signale responsive genet, og vi foreslår at redusert kortisol og kortison konsentrasjoner i adrenal av Cyclops fosteret kan resultere fra
Veratrum californicum
beiting av mor sau forbruker Cyclopamine og hemme Hh-signalveien.
Hsd11b1
er til stede i PC3 og LNCaP menneskelige prostata kreft celler, og HSD11B1 11-dehydrogenase aktivitet er bevart, mens 11-reduktase aktivitet er ikke [ ,,,0],35,36], noe som indikerer HSD11B1 er viktig for å opprettholde konsentrasjonen av glukokortikoid i prostata og prostatakreftceller. Dette resultat sterkt angår prostata kortisol /kortison-konsentrasjon til den Hh-signalveien, noe som tyder på at kortisol /kortison-konsentrasjonen endring kanskje en viktig faktor for prostata kreftutvikling, og at anti-Hh behandling kan reversere disse skadelig endringer.
En annen ny Hh-signale responsive genet vi fant er Proenkephalin (
Penk
), et hormon ligand for opioid vekstfaktor reseptor (Ogfr) og en negativ regulator av celledeling og vev organisasjon. Når Penk syntetiseres og binder seg til atom ligger Ogfr, er en intracellulær signalveien nedstrøms Ogfr initiert og til slutt fører til at cellen for å angi G0 fase. Penk er en prostata stroma markør og genuttrykk analyse viste at Penk konsentrasjonen er lavere i prostatakreft enn i normal prostata [37]. Det er overraskende å finne at Penk er uttrykt i TRAMPC2, mens DU145 er
Penk
null fra en annen genekspresjon profil fra vår lab, indikerer TRAMPC2 celler har stromal funksjoner, potensielt fra epithelial Mesenchymale Transition (EMT). Mer overraskende, har vi funnet
Penk
er Hh-responsive genet og Sutherlandia ekstrakt behandling reduseres enten basalnivået eller Hh-stimulert Penk transkripsjon konsentrasjon.
Selv om Sutherlandia etanol ekstrakt viste undertrykkelse av et stort antall av Hh-responsgener, tror vi ikke at SFE inneholder Smo inhibitor (er) som cyclopamine, GDC0449 eller DY131, ellers ville det undertrykke alle HH responsive gener. Vi foreslår SFE inneholde en eller flere aktive komponenter som endrer aktiviteten av nedstrøms Hh-signalveien, som interagerer med andre signalveier, eller alternativt de virker på nivået av Gli transkripsjonsfaktor nivå i en promoter spesifikk måte.
i tillegg til oppdagelsen av Hh-signale inhibering effekt, har vi også funnet gener som er opp-regulert ved Sutherlandia behandling med eller uten Hh-signaleringsaktivering. GO analyse viste at flertallet av disse genene er immunrespons relatert, inkludert CFB, CFH, GBP2, Gbp4, GBP5, 10 GBP, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11, CXCL13, IL6, IL18bp, Oasl1, Rsad2, Sp110, Tgtp1, Tgtp2, TLR3 , Tnfsf10 og Vnn1 (S1 og S3 Tables). Mens de fleste av oppregulert gener er vist å være Hh-signalering uavhengig, avslørt av ganger endring likheten med eller uten Hh behandling, finner vi 5 gener, Agap2, Aw112010, Gda, Cxcl11 og Npsr1, som er stimulert mye mer som svar på Sutherlandia når Hh-signal er aktivert, noe som indikerer at Hh-signal forenkler disse genene respons på Sutherlandia.
i sammendraget, vår genekspresjon undersøkelse av Hh-signale responsive gener og Sutherlandia responsive gener i mus prostata kreft TRAMPC2 celler viste Sutherlandia ekstrakt har sterke Hh-signale hemming effekter som bedømmes av antallet og andelen av Hh responsive gener som kan bli undertrykt av Sutherlandia behandling. Våre RNA-seq resultater tyder på at Sutherlandia er en sterk anti-Hh narkotika kandidat med sterk immunsystem forsterke aktiviteter.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. RNA-seq leser av Hsd11b1 og Penk
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s001 product: (PDF)
S1 Table. 80ug /ml SFE responsive gener
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s002 product: (PDF)
S2 Table. Hh responsive gener
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s003 product: (PDF)
S3 Table. Differensielt uttrykte gener mellom co-behandling av Hh og SFE, og Hh-CM behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s004 product: (PDF)
S4 Table. Primer sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s005 product: (PDF)
Takk
Denne publikasjonen eller prosjektet ble gjort mulig delvis av Grant Number P50AT006273 fra Nasjonalt Senter for komplementær og Integrative Health (NCCIH), Office of Kosttilskudd (ODS), og National Cancer Institute (NCI). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle utsikt over NCCAM, ODS, NCI, eller National Institutes of Health.
