Abstract
Tap av genom-wide metylering er et felles trekk ved kreft, og graden av hypometylering har blitt korrelert med genomisk ustabilitet. Globalt metylering av repeterende elementer muligens oppsto som en forsvarsmekanisme mot parasitt DNA-elementer, inkludert retrotransposons og virale patogener. Gitt de endringer av global metylering i både viral infeksjon og kreft, vi undersøkte genom-wide metylering nivåer i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC), en kreft årsakssammenheng med humant papilloma virus (HPV). Vi analysert globale hypometylering nivåer på 26 HNSCC prøvene, sammenlignet med sine matchet normal tilstøtende vev, ved hjelp av pyrosekvensering-baserte metylering analyser for LINE gjentas. I tillegg undersøkte vi cellelinjer som stammer fra en rekke solide svulster for LINE og SINE (
Alu
) gjentas. Graden av LINE og
Alu
hypometylering varierte mellom ulike kreftcellelinjer. Det var bare moderat sammenheng mellom LINE og
Alu
metylering nivåer, med variasjonsområdet i metylering nivåer blir større for linjen elementer. LINE hypometylering var mer uttalt hos HPV-negative enn i HPV-positive svulster. Videre genomisk instabilitet, som målt ved hjelp av genom-wide tap-av-heterozygositet (LOH) enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) analyse, var større i HNSCC prøver med mer uttalt LINE hypometylering. Globalt hypometylering var variabel i HNSCC. Dens sammenheng med både HPV status og grad av LOH som et surrogat for genomisk ustabilitet kan reflektere alternative onkogene trasé i HPV-positive versus HPV-negative tumorer
Citation. Richards KL, Zhang B, Baggerly KA, Colella S Lang JC, Schuller DE, et al. (2009) Genome-Wide Hypomety-lering i hode- og halskreft er mer uttalt i HPV-negative tumorer og er assosiert med Genomisk ustabilitet. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10,1371 /journal.pone.0004941
Redaktør: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, USA
mottatt: 17 september 2008; Godkjent: 13 februar 2009; Publisert: 18 mars 2009
Copyright: © 2009 Richards et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Kleberg Foundation, State of Texas Tobakk forskningsmidler, en institusjonell forskningsstipend fra Texas Tobakk Settlement Funds (University of Texas MD Anderson Cancer Center), og DoD W81XWH-05-2-0027 til RK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA metylering er en epigenetisk DNA modifikasjon som skjer via virkningen av DNA metyltransferaser på CpG dinukleotider. Metylerte regioner av DNA som er assosiert med kromatin remodellering, vanligvis forekommer i områder med mer kondensert kromatin og redusert transkripsjonen aktivitet [1], [2]. Fornyet interesse for denne prosess oppsto etter at det ble erkjent at to typer av avvikende metylering mønstrene er til stede i kreftceller [1], [3]. Den første er genspesifikke hyper-metylering, hvor CpG øyer i promotorområdene av gener skaffe øket metylering, generelt fører til redusert ekspresjon av nedstrømsgenet. Den andre er genom-wide hypo-metylering, en stor andel av som forekommer i repeterende DNA-elementer. I malignitet, er global metylering ofte avvikende redusert, mens genet spesifikke metylering er ofte avvikende økt. Mens effekten av genspesifikke hypermethylation (
f.eks
, redusert ekspresjon av et gen som er viktig for vekstkontroll) kan lett forstås, effekten av redusert global metylering er mer vag [1], [3].
Det har vært en teori om at DNA metylering opprinnelig utviklet som en forsvarsmekanisme mot virus og andre DNA patogener som en måte å slå utenlandske DNA-sekvenser [4] – [6]. Dette er konsistent med den observasjon at LINE og SINE (
Alu
) elementer, som stammer fra transposable elementer, er tungt metylert i normale celler. Metylering av HPV virusgenomet ved integrering i vertsgenomet er blitt rapportert, og endringer i metylering av HPV DNA har vært forbundet med tumorgenese [7], [8].
Global metylering er også klinisk relevant, så demonstrert av assosiasjoner mellom klinisk utfall og globale metylering nivåer i en rekke krefttyper [9] – [11]. Fra et mekanistisk synspunkt synes global metylering for å være relatert til kreft progresjon, ettersom tap av global metylering en tendens til å bli mer uttalt som forstadier til kreft avanserer [12], [13]. Videre i tykktarm kreft celler, tap av LINE metylering er omvendt korrelert med mikro ustabilitet og er direkte korrelert med kromosom ustabilitet [14], [15].
Vi antok at globale metylering nivåer i kreft, representert ved nivåer av LINE og SINE (
Alu
) metylering, kan være korrelert med virusinfeksjon. Vi har derfor undersøkt LINE metylering i forhold til HPV-status i hode og nakke kreft. I motsetning til livmorhalskreft, som nesten alle assosiert med HPV-infeksjon, er HNSCC viralt formidlet i bare en undergruppe av tilfellene (25-30%) [16]. For å fastslå effekten av virusinfeksjon på globale metylering nivåer i HNSCC, utviklet vi pyrosekvensering baserte metylering analyser for repeterende DNA-elementer og sammenlignet HPV-positive med HPV-negative kreft. Tidligere publikasjoner har antydet at LINE metylering er variabel i HNSCC, men fant ikke en sammenheng mellom HPV DNA status og LINE metylering nivåer [17], [18]. Her viser vi at global hypometylering er variabel i HNSCC og korrelerer med både HPV status og genomisk ustabilitet.
Resultater
LINE /SINE (
Alu
) analysene er presise og reproduserbare , men viser bare moderat sammenheng mellom LINE-en og
Alu
metylering nivåer
for å analysere globale metylering nivåer, vi tilpasset vår pyrosekvensering-baserte metylering Analyse (PMA) analyse [19] for å vurdere metylering repeterende LINE og SINE (
Alu
) elementer, som ligner på genom-wide metylering analyser rapportert tidligere [20]. For å validere analyser, utførte vi en rekke tester: (1) å blande eksperimenter med kjente mengder av denaturert /unmethylated DNA; (2) metylering studier på en rekke kreftcellelinjer for å sammenligne LINE til SINE metylering og for å kartlegge globale metylering over et bredt spekter av kreftformer; og (3) metylering av prøver fra ulike aldre og kjønn for å eliminere disse faktorene som mulige confounders av globale metylering målinger.
Trinnvis trinn på metylert DNA ble fremstilt ved å blande universelt unmethylated (U2M.L) DNA med universelt metylert (UM.L) DNA i ulike proporsjoner. De blandede prøvene ble deretter Bisulfite behandlet og utsatt for vår PMA LINE-1 (LINE) og
Alu plakater (SINE) analyser. Lineær regresjonsanalyse viste at LINE-en og
Alu
metylering nivåer ble veldig nært knyttet til nivåer spådd av innspill brøkdel av metylert DNA (
r
= 0,995,
p Anmeldelser – verdi 0,0005 for LINE-en, og
r
= 0,980,
p
-verdi 0,0005 for
Alu
Figur S1). Det skal bemerkes at selv når inngangs DNA ble fullstendig denaturert, er den maksimale globale metylering prosentandel målt ved PMA-analysen er i overkant av 50%, ikke 100%. Dette er fordi de enkelte repetitive elementer har skilt i rekkefølge over tid; og CpG dinukleotider, hvis mutert til TPG dinukleotider, er umulig å skille fra unmethylated CPGs etter bisulfit behandling. Dette nivået av bakgrunnsstøy er tatt hensyn til ved å normal hvert resultat til universelt metylert kontroll (
dvs.
, rapportering prosent denaturert referanse, eller PMR).
Fire bassenger av normale DNA-prøver ( fra perifert blod leukocytter) ble generert for å vurdere påvirkning av alder og kjønn på LINE-en og
Alu
metylering nivåer. Hver pool (kvinner ≤40 år gamle, hanner ≤40 år gamle, kvinner 40 år gamle, menn 40 år) inneholdt DNA fra minst fem personer. Det var ingen sex-eller aldersavhengige forskjeller mellom bassengene i LINE-en eller
Alu
metylering nivåer (data ikke vist).
Hver LINE-en og
Alu
metylering assay ble testet på et panel av 23 cancercellelinjer. Ulike CpG områder ble sammenlignet ved hjelp av tre forskjellige line-1 analyser og tre forskjellige
Alu
analyser, hver utledet fra ulike regioner av linjen-en og
Alu
konsensussekvenser (Tabell 1). Som en kontroll, vi også testet sju normale lymfoblastoide cellelinjer, som viste normale nivåer av metylering (alle 80% i vår linje-1-analyser). I kontrast, som forventet fra tidligere rapporter [12] – [14], [21], mange av tumorcellelinjer viste global hypometylering, som ble størst i de LINE-1-analyser (figur 1). For å kontrollere konsistensen mellom LINE og SINE metylering nivåer (representert ved vår linje-en og
Alu
analyser, henholdsvis), vi sammenlignet graden av samsvar mellom resultatene fra de tre LINE-1-analyser, mellom resultatene fra tre
Alu
analyser, og mellom de ulike LINE-en og
Alu
analyser. Lineær regresjonsanalyse viste at de enkelte LINE-1 analyseresultatene ble høyt korrelert med hverandre, for eksempel
r
= 0,93 for sammenhengen mellom L1-2 og L1-3 analyseresultatene (figur S2A). Den samme høye grad av korrelasjon var til stede mellom resultatene fra
Alu
analyser, for eksempel
r
= 0,82 for sammenhengen mellom Alu-en og Alu-3 analyseresultatene (figur S2B) . Men LINE-1 analyseresultatene ble bare moderat korrelert med
Alu
analyseresultatene, for eksempel
r
= 0.33 sammenligne L1-1 og Alu-1; Figur S2C). En tilsvarende nivå av moderat sammenheng mellom LINE-en og
Alu
analyser ble rapportert tidligere i nevroendokrine svulster [22].
A.
Alu
metylering med Alu-tre analysen. B. LINE-en metylering med L1-3 analysen. Resultatene er rapportert som den PMR (prosent metylert referanse) normalisert til den universelt denaturert DNA referanse. Universelt unmethylated (U2M), universelt denaturert (UM) kontroller, og normal kontroll DNA fra PBL er også vist.
LINE-en hypometylering av HNSCC pasientprøver
Matching normal, primærtumor, og der det er tilgjengelig, lymfeknutemetastaser i hode og nakke pasientprøver (tabell S1) ble testet ved hjelp av våre PMA LINE-1-analyser (figur 2). På grunn av større dynamisk omfang av LINE-1-analysen og begrensede prøvemengder, ble bare LINE-1-analyser utført for resten av denne studien. Generelt HNSCC primære svulster og metastatiske lymfeknuter hypomethylated forhold til sine matchende normale tilstøtende vev. Med LINE1-1 analysen er den gjennomsnittlige primær tumor PMR var 65,5%, mens den midlere normale PMR var 90,0% (
p
verdi = 6,7 x 10
-8 ved hjelp av et sammenkoblet
t
-test). Men det var litt av en bit av variasjon i de primære svulster, fra 31,2% (alvorlig hypometylering) til 90,8% (normal). Den midlere PMR i lymfeknutemetastaser (73,8%; 31,8% utvalg -93,8%) var også svært variabel, selv med hensyn til den tilsvarende primærtumor, noen ganger mindre og noen ganger høyere enn den PMR av den primære tumor med hvilken den er tilknyttet.
Paret tumor og normale prøver og, der det er tilgjengelig, lymfeknutemetastaser ble analysert for LINE-en metylering. PMR-verdier er plottet ved bruk av den normale prøven PMR som x-verdien og primærtumor (sirkler) eller metastase (trekant) PMR som y-verdi. Horisontale linjer representerer PMR verdier for universelt metylering (UM) og unmethylated (U2M) kontroller, normale lymfocytter (grønn) og for fire HNSCC cellelinjer (gule). Boksplott til høyre viser gjennomsnittet og fordelingen av primære svulster og metastaser i undergruppe av prøvene hvor matchet metastaser og primære svulster var tilgjengelig.
HPV-positive svulster beholde mer LINE-en metylering enn HPV -negative tumorer
Fordi det var så mye variasjon i HNSCC svulst PMR, hypotese vi at nivået av global hypometylering kan variere i ulike undergrupper av HNSCC. For å utforske forholdet mellom tap av LINE-en hypermethylation og HPV status, sammenlignet vi den gjennomsnittlige LINE-en metylering nivå på tre grupper som varierte på bakgrunn av deres HPV status. Den første gruppe (n = 8) ble HPV-negative (- /-); den andre gruppe (n = 8) inneholdt HPV-DNA, men likevel var transkripsjonelt stille i forhold til E6 virale oncogen, noe som indikerer mangel på ekspresjon av dette oncoprotein (+/-). Den tredje gruppe av tumorer (n = 8) var positive for HPV-DNA og E6 ekspresjon (+ /+). Gjennomsnittlig metylering nivå av de tre grupper av svulster er statistisk forskjellig, med en
p
verdi = 0,011 for trend (figur 3).
Boksplott av metylering nivåer (PMR) av HNSCC primære svulster (til høyre i hvert par) og normal tilstøtende vev (til venstre i hvert par) er vist i henhold til HPV-status. + /+, HPV-positive og uttrykke E6 viral mRNA; +/-, HPV-positive, men transcriptionally stille; og – /-, HPV negative
Vi har også sammenlignet globale metylering nivåer i passet normale tilstøtende vev fra de samme tre gruppene.. I motsetning til resultatene for de primære svulster, var det ingen forskjeller i de globale metylering nivåer i matchende normalt vev og derfor ingen sammenheng med HPV-status (figur 3). Basert på en tidligere rapportert sammenheng mellom LINE-en metylering og TNM stadium [18], så vi for en slik forening i vår prøvesett, men fant ingen (
p
verdi = 0,31).
Nivåer av LINE-en hypometylering og LOH i HNSCC svulster er korrelert
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP cellelinjer med mer uttalt LINE hypometylering ble tidligere rapportert å ha en høyere grad av LOH [14], [15]. For å undersøke om denne sammenhengen holdt sant i våre HNSCC pasientprøver, utførte vi en global LOH analyse ved hjelp av 10K SNPChip data. Genotypene ble sammenlignet mellom normal tilstøtende vev og matchet tumorprøver; informative loci var de som var heterozygote i normalt vev. Figur 4 viser en kurve av prosentandelen av informative loci for hver primærtumor med LOH i forhold til graden av LINE-en metylering i den samme prøven. Vi passer en lineær trend til dataene, som viste et Pearson korrelasjon på -0,494, med en
p
verdi = 0,017. Som en sjekk av robusthet, vi også beregnet Spearman (rang-basert) korrelasjon, som også var betydelig. Den Spearman korrelasjonskoeffisient for dette forholdet var -0,428 (
p
verdi = 0,042), som fastslår at LOH ble faktisk signifikant korrelert med graden av LINE hypometylering.
LINE-en metylering er plottet som PMR, og LOH er den fraksjon av 10K SNP loci som viser LOH i forhold til alle informative loci. Pearson korrelasjonskoeffisient er -0,494 (
p
verdi = 0,01) for sammenhengen mellom de to verdiene.
Diskusjoner
Vi har utviklet flere LINE (linje- 1) og SINE (
Alu
) metylering analyser med PCR primere i bevarte deler av disse repetitive elementer. Disse analysene benytte flere CpG sider (3-6) for å bestemme metylering nivåer og muliggjør samtidig forsterkning av mange individuelle LINE og SINE elementer i hele det menneskelige genom som representative genomiske landemerker for global metylering analyse. Som forventet resultat av individuell LINE-1-analyser ble svært godt korrelert med resultater fra andre LINE-1-analyser, til tross for måling metylering i ulike regioner av LINE-en sekvens. Det samme gjelder for
Alu
analyser, med høy korrelasjon mellom resultatene fra tre forskjellige analyser. Når imidlertid LINE-1 og
Alu
metylering nivåene ble sammenlignet med hverandre, korrelasjonen var mer beskjeden, bare omtrent 40%. Årsakene til dette lavere korrelasjonen kan være relatert bare til forskjeller i analyse følsomhet: LINE-1-analyser varierte fra 0-50% denaturert i blande studier, mens
Alu
analysene hadde mindre amplitude, alt fra 0-30% denaturert, muligens sekundært til høyere inter-individuelle bakgrunnsstøy på grunn av sekvensvariasjonen mellom individ
Alu
elementer (Figur S1). En annen mulighet er at det er en funksjonell eller biologisk forskjell mellom de to typer av repeterende DNA i deres metylering vedlikehold. LINE gjentakelser er hyppigere i genet fattige regioner i genomet, mens
Alu
elementene er mer vanlig i gen-rike regioner [23]. Siden global metylering kan måles ved en rekke metoder, bør disse inter-assay forskjeller tas i betraktning når man sammenligner resultatene ved bruk av forskjellige typer analyser og undersøkelser.
Våre resultater viser reduksjoner i global metylering i cellelinjer fra en rekke typer cancerceller (figur 1), på samme måte som tidligere publiserte resultater for en rekke forskjellige tumortyper [12] – [14], [21]. Det er verdt å merke seg at kreftcellelinjer generelt hadde lavere nivåer av metylering enn HNSCC prøver, kanskje gjenspeiler en lengre tid til å akkumulere metylering tap eller klonal naturen av disse cellelinjene. Men noen cellelinjer (f.eks RKO) hadde liten eller ingen tap av metylering. Dette innebærer, som for de primære HNSCC tumorer, at det er variasjon i den underliggende biologi. Videre forskning på hva som forårsaker denne variasjonen kan gi viktig informasjon om veier av og rollen til epigenetiske forandringer i kreft progresjon.
Våre resultater viser en positiv sammenheng mellom vedlikehold av normal LINE metylering og HPV-positivitet. I tillegg ble opprettholdelsen av normal LINE metylering også korrelert med mindre LOH eller genom ustabilitet. Hvis LOH er sett på som et surrogat for kromosom ustabilitet (CIN), er dette resultatet i samsvar med tidligere rapportert resultat at tykktarm kreft har også en sammenheng mellom CIN og tap av LINE hypermethylation [14], [15]. Dermed er det fristende å spekulere i at LINE metylering og CIN er årsakssammenheng, kanskje via metylering er kjent tilknytning til tettere kromatin emballasje, noe som kan føre til mer troskap under kromosom segregering og derfor mindre LOH. Men våre resultater og tidligere rapporterte resultater er rent samsvarende; funksjonelle studier vil være nødvendig før denne årsaksforhold kan etableres.
Det nye funn i våre resultater er at HPV-positivitet er korrelert med vedlikehold av LINE metylering. En fersk epidemiologisk studie identifisere risikofaktorer for LINE-en hypometylering rapporterte ingen signifikant sammenheng mellom HPV DNA status og LINE-1 metylering nivåer [17]. Imidlertid var det metodiske forskjeller mellom dette og vår studie, herunder bruk av både HPV E6 DNA og RNA status i tildelingen av HPV-status, bruk av en annen metylering analyse, og bruken av metylering nivå som en kontinuerlig variabel i analyse. Selv Furniss og kolleger ikke viser en direkte sammenheng, viste de at resultatene varierte fra LINE-1 metylering nivåer for HPV-negative tumorer [23]. Videre studier er nødvendig for å avklare sammenhengen mellom HPV status og LINE metylering. En mulig hypotese er at i et forsøk på å slå av HPV-viruset, infiserte celler induserer en mer frodig metylering respons, harkening tilbake til opprinnelsen til metylering som en viral forsvarsmekanisme. Selv om dette vil igjen kreve mekanistiske studier eller kanskje studier i andre typer viralt medierte kreft (for eksempel hepatitt B og C mediert HCC sammenlignet med ikke-viralt indusert HCC, eller EBV + lymfom vs. EBV- lymfom) for å etablere kausalitet, våre resultater sammen med de av Furniss og kolleger [17] sikkert gi mer støtte for hypotesen om at HPV-positive HNSCC og HPV-negative HNSCC representerer forskjellige biologiske enheter som oppstår via separate onkogene veier.
i sammendraget, vi utviklet flere nye LINE (LINE-1) og SINE (
Alu
) hel-genom metylering analyser, som vi har anvendt for å bestemme status metylering av en rekke forskjellige kreftcellelinjer og HNSCC primær tumorprøver. Vi finner at kreftcellelinjer generelt har gått ned metylering nivåer av repeterende elementer. Enda mer variasjon i LINE-en metylering ble notert innen HNSCC prøver. Viktigere, oppdaget vi en sammenheng mellom HPV-negativitet, økt genom ustabilitet og tap av genomet metylering. Denne sammenhengen forsterker ideen om at HPV-positive og HPV-negative kreft er biologisk distinkte og gir grunnlag for fremtidige studier for å definere den biologiske mekanismen bak disse funnene.
Materialer og metoder
Pasient prøver og cellelinjer
Matchet svulst /normale prøver tilstøtende vev, og når det er tilgjengelige livmorhalslymfeknutemetastaser fra HNSCC pasienter ble samlet ved Ohio State University, som beskrevet tidligere (tabell S1) [24]. Genomisk DNA ble ekstrahert fra de DNA-proteinfasen av TRIzol-ekstraherte vev i henhold til produsentens forslag (Invitrogen). DNA ble ekstrahert med PureGene kit (Gentra) på celle pellets fra fire HNSCC cellelinjer (SCC-4, SCC-9, SCC-15 og SCC-25), fem lunge kreft cellelinjer (H1395, H520, H2170, SK- MES-1 og SW-900), en brystcancer cellelinje (MCF7), en livmorhalskreft cellelinje (HeLa), tre hjernekreft cellelinjer (U251, SK-N-AS og M059K), en livmorkreft cellelinje ( AN3CA), en sarkom cellelinje (HT1080), en nyrekreft cellelinje (HEK293), og seks tykktarmskreft cellelinjer (LoVo, SW48, HCT-15, DLD-en, COLO 320DM og RKO) i henhold til produsentens forslag. I tillegg ble DNA fra en lymfoblastoid cellelinje BL1395 anvendt som en samsvarende kontroll for å H1395. Alle cellelinjer er tilgjengelige fra ATCC (Manassas, Virginia).
Normal bassenger og denaturert kontroller
Fire bassenger av normale prøver ble generert representerer ulike kjønn og aldersgrupper. DNA-prøver ble innhentet fra anonyme blodgivere og var en gave fra Dr. Michael J. Siciliano (University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). Tre av bassenger (kvinner eldre enn 40 år, kvinner i alderen 40 eller yngre, og Menn i alderen 40 eller yngre) ble hver består av fem personer per basseng. Den fjerde basseng (menn eldre enn 40 år) besto av seks personer. Kommersielt fremstilt universelt metylert og universelt unmethylated DNA (UM.C og U2M.C, henholdsvis) ble oppnådd fra Chemicon. UM.L (universelt metylert DNA) ble generert som en positiv kontroll ved å behandle normal perifert blod leukocytter (PBL) DNA med CpG metylase
M.Sss
jeg (New England Biolabs) [25]. U2M.L (universelt unmethylated DNA) ble generert som en negativ kontroll ved å forsterke den samme DNA som anvendes til å generere den positive kontroll-DNA ved hjelp av GenomiPhi kit (GE Healthcare) som beskrevet av fabrikanten.
primere og PCR-forhold
PCR primere og sekvense primere ble utformet ved hjelp PSQ analyse design programvare (Biotage) [26]. Tre analyser for SINE (
Alu
) elementer og tre analyser for LINE-1 elementer ble utviklet (tabell 1). PCR ble utført i en 25 pl reaksjon inneholdende Qiagen varmstart Taq-konsentrat-blanding (Qiagen) ved anvendelse av 1 ul bisulfitt behandlet DNA (10 ng av DNA-ekvivalenter). For å redusere kostnadene per analysen ble amplifikasjonsprotokoll utviklet ved hjelp av en biotinylert universal primer tilnærming. Endelige primer konsentrasjoner var 10 nM av primeren tailed med universal primer, 100 nM av untailed primer, og 90 nM av den universelle biotinylert primer i hver reaksjon [19]. Amplifikasjonen ble utført ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 45 sykluser ved 95 ° C i 30 sek, 45 ° C (sinus) eller 53 ° C (linjer) i 1 min, 72 ° C i 45 sek, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min [19].
PyroMethA (PMA) og metylering vurderings
Bisulfite omdannelse av genomisk DNA ble utført som tidligere rapportert [ ,,,0],19]. I korthet, 0,5-1,0 ug genomisk DNA ble behandlet ved hjelp av CpGenome DNA modifikasjon kit (Chemicon), inkludert DNA-sulfonering, deaminering, avsalting, desulfonation og utvinning. Bisulfitt-behandlede DNA ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. PMA er en pyrosekvensering-basert teknologi som kan analysere CpG metylering på flere steder i en enkelt analyse. Etter en PCR forsterkning ved hjelp bisulfite behandlet DNA, ble pyrosekvensering utført ved hjelp av PSQ96HS system (Biotage) i henhold til produsentens protokoll inkludert enkelt strand bindende protein (PyroGold reagenser). Resultatene ble analysert ved hjelp av Q-CpG-programvare (Biotage), som beregner metylering prosent (
mC /(
mC + C)) for hvert CpG stedet, slik at kvantitative sammenligninger. Metyleringen indeks (kalt MI) ble beregnet som den gjennomsnittlige verdien av
mC /(
mC + C) for alle undersøkte CpG områder i analysen. Generelt var det veldig god avtale metylering nivåer mellom individuelle CpG steder i samme analyse. Bisulfite behandlet UM.L ble brukt som universelt denaturert referanse. PMA data for disse globale metylering analysene er rapportert som en prosent av metylert referanse (PMR) verdi, normalisere MI av hver prøve til den MI av den universelt metylert referanse (UM.L) DNA [25].
kommersiell universelt metylert DNA (UM.C) og universelt unmethylated DNA (U2M.C) (Chemicon) ble også brukt til å utføre denne analysen, og resultatet var lineær (
r
= 0,983,
p
-verdi 0,0005 for LINE-1, figur S1). Imidlertid kommersielt tilgjengelig U2M var ikke helt unmethylated, ettersom en ren U2M.C prøve hadde rest metylering av ca. 26%, forskjellig fra U2M.L fremstilt i vårt laboratorium, som hadde den forventede 0% metylering. Vi brukte derfor vår egen universelt unmethylated DNA (U2M.L) for alle videre studier.
Påvisning av HPV16 E6 DNA og E6 RNA å bestemme HPV status
kvantitativ real-time PCR ble utført for å detektere enten HPV16 E6 E6 DNA eller cDNA ved anvendelse av den samme primer /probe satt for begge. Primerne ble utformet med HPV16 serotype, som står for ≥90% av alle HPV-positive HNSCC tilfeller [27]. For å kontrollere for mulig genomisk DNA-forurensning i cDNA, ble amplifikasjoner av cDNA fra DNAse behandlet med RNA som var blitt fremstilt ved hjelp av Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen) både med og uten tilsetning av revers transkriptase sammenlignet. PCR ble utført i en 25 pl reaksjon inneholdende iQ SuperMix masterblanding (Biorad) ved anvendelse av 25 ng genomisk DNA eller 5 pl av cDNA. Forover primer (5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 «) og revers primer (5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3′) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 200 nM hver. The Texas Rødt-merket sanntids-sonde (5»-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 «) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 320 nM. Fluorescein ble tilsatt til hver reaksjon ved en sluttkonsentrasjon på 10 pm. Hver reaksjon ble utført i tre eksemplarer. Amplifikasjonen ble utført ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 8,5 minutter, fulgt av 50 sykluser ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 minutt og analysert i sanntid ved hjelp av en iCycler PCR maskin og programvare ( Biorad). Prøver som ikke forsterker ble scoret som negative, og alle prøvene ble gruppert i 3 kategorier basert på disse resultatene: (+ /+), positive for både E6 DNA og E6 RNA; (+/-), Positiv for E6 DNA, men transkripsjonelt stille; og (- /-), negativ for E6 DNA og RNA. HPV status ble vellykket bestemt for 24 av de 26 HNSCC prøver, og disse ble brukt for senere analyser benytter HPV status.
10K SNPChip LOH analyse
HNSCC genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av standard TriZol- utvinning protokollen; de ble ytterligere renset ved hjelp av etanolutfelling før og etter hele genom-amplifikasjon ved bruk av GenomiPhi kit (GE Healthcare). Den Affymetrix 10K
Xba
131 matrisen inneholder ca 11 500 SNPs med en gjennomsnittlig avstand på 210 kb. Standard Affymetrix protokoller ble fulgt i disse analysene. Kort fortalt ble ca 250 ng genomisk DNA fordøyd med
Xba
I og deretter ligert til adaptere. Deretter ble en-primer forsterkning som drives av å bruke GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Etter rensing med Qiagen MinElute 96 UF, totalt ca 20 ug av PCR-produktet ble fragmentert og merket med biotin. Hybridiseringen ble utført i Affymetrix Genechip hybridisering ovn ved 48 ° C i 16-18 timer. Arrays ble vasket og farget med Affymetrix Genechip Fludics Station 400 og ble skannet med Affymetrix GeneArray 2500 Scanner. Bildebehandling ble utført med GCOS 1.0 software og genotyper ble generert med GTYPE 2.0 eller høyere programvare.
Statistisk analyse
For å kunne vurdere sammenhengen mellom nivåer av metylering og nivåer av HPV belastning (en tilsvarende analyse ble også brukt til å vurdere sammenhengen mellom nivåer av metylering og TNM stadium), vi gikk videre som følger. Alle prøve metylering verdier ble konvertert til rekkene. En manglende verdi for LINE1-1 analyse, for prøve P2, ble regnet med P2 verdien fra LINE1-3 (korrelasjon mellom LINE1-1 og LINE1-3 analysene er 0,98). Disse verdiene ble så skalert (veid) av HPV last, med vekter på 0, 1 og 2 for – /-, +/-, og + /+, henholdsvis. Den endelige foreningen «poengsum» var summen av disse vektede rekkene. Den null distribusjon for denne poengsummen ble vurdert av simuleringer der vi gjentatte ganger tildelt prøver å HPV-grupper tilfeldig. Vi kjørte en million simuleringer, og definert vår
p
-verdi som to ganger andelen av saker der simuleringen poengsum var like stor eller større enn den vi faktisk så. Vår simulert
p
-verdi var 0,011.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Kliniske og molekylære funksjoner i HNSCC prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004941.s001 plakater (0,12 MB DOC)
Figur S1.
Dynamisk spekter av PMA LINE-en og Alu analyser. Blanding eksperimenter ble utført for å bestemme PMA metylering nivåer målt med varierende andeler av universelt metylert og unmethylated DNA. UM.C og U2M.C representerer kommersielt tilgjengelige (Chemicon) universelt denaturert og unmethylated DNA, henholdsvis. UM.L og U2M.L ble generert fra samme DNA ved in vitro modifikasjon i vårt laboratorium
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004941.s002 plakater (0,10 MB TIF)
Figur S2.
korrelasjonsanalyse av sinus og LINE global metylering analyser.
