Abstract
Bakgrunn
MLL3 er en histon 3- lysin 4 metyltransferase med tumor-suppressor egenskaper som tilhører en familie av kromatin regulator gener potensielt endret på neoplasi. Mutasjoner i MLL3 ble funnet i en hel genom analyse av tykktarmskreft, men har ikke blitt bekreftet av en separat studie.
Metoder og resultater
Vi analyserte mutasjoner av kodende region og formidler metylering i MLL3 hjelp 126 tilfeller av tykktarmskreft. Vi har funnet to isoformer av MLL3 og DNA-sekvensering viste rammeskifte og andre mutasjoner som påvirker begge isoformer av MLL3 i kolorektal kreftceller og 19 av 134 (14%) primær kolorektal prøvene analysert. Videre rammeskifte mutasjoner var mer vanlig i tilfeller med mikro ustabilitet (31%) både i CRC cellelinjer og primære svulster. Den største isoform av MLL3 er transkribert fra et CpG island-forbundet arrangøren som har svært homologi med en pseudo-genet på kromosom 22 (psiTPTE22). Ved hjelp av en analyse som målte både loci samtidig vi fant fremtredende aldersrelatert metylering i normal kolon (fra 21% hos personer under 25 år til 56% hos personer eldre enn 70, R = 0,88, p 0,001) og hyppig hypermethylation (83 %) i begge CRC-cellelinjer og primære svulster. Vi neste studerte de to loci separat og fant at alder og kreftrelaterte metylering var utelukkende en egenskap ved pseudogen CpG island og at MLL3 loci var unmethylated.
Konklusjoner
Vi fant at rammeskifte mutasjoner av MLL3 både CRC celler og primære svulst som var mer vanlig i tilfeller med mikro ustabilitet. Videre har vi vist CpG island-forbundet formidler av MLL3 genet har ingen DNA metylering i CRC celler, men også primærtumor og normal tykktarm, og denne regionen har et sterkt homolog av pseudo-genet (psiTPTE22) som var alder forholde DNA metylering.
Citation: Watanabe Y, Castoro RJ, Kim HS, North B, Oikawa R, Hiraishi T, et al. (2011) Hyppig Endring av MLL3 rammeskifte mutasjoner i mikroMangeltykktarmskreft. PLoS ONE 6 (8): e23320. doi: 10,1371 /journal.pone.0023320
Redaktør: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Spania
mottatt: 10 februar 2011; Godkjent: 15 juli 2011; Publisert: 11 august 2011
Copyright: © 2011 Watanabe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grants # CA098006 og CA105346. J-PJI er en American Cancer Society Clinical Research Professor støttet av en generøs gave fra F. M. Kirby Foundation. DNA-sekvensering i Core Sekvense anlegget på M. D. Anderson Cancer Center er støttet av Core-Grant # CA16672 fra National Institutes of Health. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i tykktarmskreft (CRC), en systematisk analyse av 13,023 godt kommenterte menneske proteinkodende gener avdekket mutasjoner i 69 kandidatgener [1]. Blant disse ble histon metyltransferase genet blandet avstamning leukemi 3 (MLL3) mutert i 6 tilfeller. MLL3 er medlem av TRX /MLL genet familie og kart til kromosom 7q36.1. Det koder for et antatt protein av 4911 aminosyrer som inneholder to plante homeodomains (PhD), en ATPase alpha /beta signatur, en høy mobilitet gruppe, en SET (lyddemper av vekslande, Enhancer av Zeste, Trithorax) og to FY (fenylalanin tyrosin) rik domener. PHD og SET domener proteiner er kromatin regulatorer og flere av dem er endret på kreft [2]. Inaktivering av MLL3 i mus resulterer i epitelial tumordannelse, noe som tyder på at den fungerer som en tumor-suppressor-gen [3]. Også MLL3 har blitt rapportert å være ofte slettet i myeloide leukemier [4], [5]. Videre har andre rapporter indikerer somatiske mutasjoner i genet MLL3 i glioblastom og pankreatisk duktus adenokarsinom [6]. Imidlertid har senere rapporter ennå ikke bekreftet MLL3 mutasjoner i tykktarmskreft [7]. Dermed forblir rolle MLL3 i patogenesen av kolorektal neoplasi ikke fullstendig definert.
I denne artikkelen, undersøkte vi MLL3 endringer i tykktarmskreft og fant en to isoform av MLL3 hvorav lengre isoformen har en tidligere ikke CpG øy overlappende promotoren. Videre fant vi nye genetiske endringer i CRC cellelinjer og også primære svulster.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av University of Texas MD Anderson Cancer center og Yonsei-universitetet Wonju Christian Hospital Institutional Review Board, og skriftlig informert samtykke ble innhentet.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og Prøvene
Åtte kolorektal kreft cellelinjer (DLD1, SW48, RKO, HCT116, CaCo2, SW620, SW480 og LoVo) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinjer ble holdt i passende medium inneholdende 10% føtalt bovint serum i kulturskåler av plast. DNA ble ekstrahert ved bruk av standard fenol-kloroform-metoden, og total RNA ble ekstrahert fra de høstede celler ved anvendelse av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) [8]. Vi studerte 72 prøver av primære kolorektal tumorer hentet fra Yonsei-universitetet Wonju Christian Hospital (Wonju, Korea) og 54 prøver av primære kolorektal tumorer og 8 tilstøtende normal- vises vev fra pasienter ved M. D. Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Vi har også studert colonic biopsiprøver fra 21 personer med ingen familiehistorie med tykktarmskreft og ingen colonic lesjoner ved screening total koloskopi.
Mutasjon og DNA Metylering analyse
DNA isolert fra grovt microdissected kreft ble analysert å bestemme somatisk mutasjon av MLL3 bruker direkte sekvensering, og begge metylering status for MLL3 og pseudo-genet psiTPTE22 (pseudo-genet av trans fosfatase med tensin homologi på kromosom 22) med sulfitt pyrosekvensering [9]. Direkte sekvensanalyse ble utført for å identifisere mutasjoner i alle 59 MLL3 eksoner som bruker både genomisk DNA og cDNA av åtte kolorektal kreft-cellelinjer, og bekrefte disse sekvenser av mutasjons regioner ved hjelp av genomisk DNA fra to forskjellige sett av primære CRC (tabell 1). Primersekvenser ble beskrevet i Tabell S1. Alle primere ble syntetisert ved Invitrogen (San Diego, CA). PCR ble utført i 22,5 mL Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, San Diego, CA), 5 mM frem og 5 mikrometer reverse primere og 10 ng genomisk DNA. Reaksjoner ble utført i 96-brønners MJ termocyclere (MJ Research, Waltham, MA) under anvendelse av 30 sykluser med PCR-amplifikasjon protokoll (denaturere 94c i 30 sekunder, annealing 55c i 30 sekunder; forlenge 68c i 60 sekunder). PCR produktene ble direkte sekvensert i MD Anderson Kjerne Sequencing Facility.
Separat DNA metylering analyse mellom MLL3 og psiTPTE22 genet CpG øyer ble bekreftet av bisulfate direkte sekvensering etter TOPO-TA kloning begge kolorektal kreft cellelinjer og primær CRC. Informasjon om mismatch reparasjon (MMR) mangel på cellelinjer ble oppsamlet fra publiserte rapporter [10], [11] og i databasen av Sanger Institute Cancer Genome Project (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI /msi_page.shtml). I den primære kolorektal kreft prøver, bestemt vi mismatch reparasjon mangel av mikro ustabilitet (MSI) analyse, som tidligere rapportert [12]. Alle primersekvenser og PCR-forhold, er beskrevet i tabell S1.
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
Første-tråd cDNA ble fremstilt ved revers transkripsjon av 1 pg prøver av total-RNA ved hjelp av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, California). Real-time kvantitativ revers transkripsjon-PCR ble utført ved bruk av Taqman genuttrykk Analyser [MLL3 ekson grense 1 -2, Hs01005501_m1 (Probe A); MLL3 ekson grensen 38 -39, Hs01005520_m1 (Probe B); MLL3 ekson grense 58 -59, Hs01005539_m1 (Probe C) og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, Hs_00266705_gl (Applied Biosystems)] i kolorektale cancercellelinjer. (Figur 1). Menneskelig kolon cDNA (BioChain, Hayward, CA) ble brukt som normale kontroller; de var forberedt fra normal tykktarm slimhinner samlet fra friske personer.
MLL3 er transkribert fra to separate arrangører (piler), og arrangøren for større transkripsjon inneholder en CpG øya mens det er ingen i den avkortede form. Lokaliseringen av mutasjoner som finnes i denne og tidligere rapporter er indikert med piler. Hver pil svarer til et enkelt tilfelle med en mutasjon, med unntak av en region med flere piler, som tilsvarer den polyA-tarmkanalen. MLL3 genet koder for en antatt protein av 4911 aminosyrer som inneholder to plante homeodomains (PhD), en ATPase alpha /beta signatur, en høy mobilitet gruppe, en SET (lyddemper av vekslande, Enhancer av Zeste, Trithorax) og to FY (fenylalanin tyrosin) rike domener. Hver av mutasjoner i primærprøver ble vist under genomstruktur skjemaet i figur 1.
Western blotting
Kanin polyklonale anti-MLL3 antistoff (SAB1300328 Sigma-Aldrich, St. Louis , MO)) ble anvendt for immunblotting. Helcellelysater ble fremstilt ved skraping av cellemonolagene i analysebuffer uten SDS [inneholdende 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l Tris-HCl (pH 7,2), 1% deoksykolsyre, 1% Triton X-100, 0,25 mmol /l EDTA (pH 8,0), protease og fosfatase-inhibitorer, 5 ug /ml leupeptin, 5 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml pepstatin A, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, 5 mmol /l NaF, og 100 umol /l natriumortovanadat ], og proteinkonsentrasjoner ble bestemt (Lowry-reagens, Bio-Rad, Hercules, CA). Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Statistical Analysis
metylering nivåer som oppnås ved pyrosekvensering (%) ble analysert som en kontinuerlig variabel for sammenligning av MLL3 genet metylering med clinicopathologic funksjoner; mener og 95% konfidensielle intervaller (CIS) ble beregnet. Tosidig
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av PRISM 4 programvare (GraphPad Prism, Inc., San Diego, California).
Resultater
I denne studien fant vi hyppig inaktivering av MLL3 av en rammeskifte mutasjoner i mikromangel CRC og ingen DNA metylering ved MLL3 loci i noen kolon prøver.
for mutasjonsanalyse, vist vi 8 CRC cellelinjer ved hjelp av PCR og sekvensering av alle 59 koding eksoner. Vi fant mutasjoner i 5 av de 8 cellelinjer (63,0%). MLL3 har en poly-A (A)
9 veiene innenfor den kodende sekvensen til ekson 38 som er inkludert i det behandlede transkripsjon; homozygot rammeskifte mutasjoner ble funnet i RKO og HCT116, mens heterozygote mutasjoner ble funnet i mikro ustabile cellelinjer SW48 og LoVo. Disse er alle mikro ustabile cellelinjer. I tillegg fant vi at SW48 og DLD1 har egne somatiske mutasjoner i andre kodende områder MLL3 (figur 1, 2A). Resultatene av mutasjonsanalyse kunne bekrefte ved hjelp av cDNA (data ikke vist). Deretter analyserte vi de 3 somatiske mutasjoner regioner (c.8382delA (rammeskifte), c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W)) i et første sett av 72 primær CRC og fant rammeskifte mutasjoner innenfor (A)
9 kanalen i 10 prøver (MSI-H, 22,9% (8/35), MSS, 5,4% (2/37)) (tabell 1). Vi deretter analysert 9 somatiske mutasjoner regioner, inkludert de 3 områder vi funnet og 6 sider funnet av Sjøblom et al. [1] i et separat sett av 54 primær CRC og 21 friske pasientprøver (tabell 1). Vi fant hyppige mutasjoner i (A)
9 veiene i mikro ustabile CRC (28,6%, 4/14, se eksempler i figur 2B), men ingen andre mutasjoner i disse prøvene. Dermed samlet, har vi funnet mutasjoner i 19/134 tilfeller analysert (14%). Disse mutasjonene kan påvises i et bredt spekter av den kodende sekvensen, med clustering i poly (A) tarmkanalen, bekreftet ved vår analyse av mikro ustabile tumorer.
(A) MLL3 har en poly-A (A)
9 veiene innenfor den kodende sekvensen til ekson 38. Homozygote rammeskiftmutasjoner ble funnet i RKO og HCT116, mens heterozygote mutasjoner ble funnet i mikro ustabile cellelinjer SW48 og LoVo. Separate somatiske mutasjoner ble funnet i SW48 og DLD1 c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W). (B) Heterozygote mutasjoner ble funnet i samme poly-A (A)
9 veiene innenfor den kodende sekvensen av ekson 38.
For å studere DNA metylering, vi først bemerket at MLL3 er transkribert fra to atskilte promotorer, hvorav den ene som resulterer i en forkortet versjon av proteinet (figur 1). Arrangøren for større transkripsjon inneholder en tidligere ikke CpG island, men man er ikke tilstede i den avkortede form. Vi analyserte metylering av denne CpG island bruker kvantitativ bisulfittkatalysert pyrosekvensering (eksempler i figur 3A). Men vi fant at CpG øya MLL3 området er svært homolog (~92%) til en CpG island som overlapper arrangøren av en pseudo-genet på kromosom 22 (psiTPTE22, pseudo-genet av trans fosfatase med tensin homologi på kromosom 22 : NR_001591). Faktisk bisulfitt pyrosekvensering analysen var i stand til å forsterke denne regionen, så vel som indikerer muligheten for falske positiver. Vi fant tett metylering i alle åtte cellelinjer undersøkt ved pyrosekvensering (HCT116, 74%: RKO, 66%: LoVo, 77%: SW48, 50%: CaCo2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%), og en høy grad av metylering i primær CRC (45 av 54 undersøkte eller 83,3%, figur 3A). Metylering av dette CpG øy i kreft var ikke assosiert med vanlige clinicopathologic funksjoner, inkludert alder, kjønn, sted og klinisk stadium. En målbar grad av metylering var til stede i den tilstøtende normalt vises slimhinnen hos de fleste pasienter som ble analysert, noe som tyder på at dette locus kan være et mål for aldersrelatert metylering [13]. Faktisk, i sunn vises normale tykktarmsslimhinnen prøver, fant vi en sterk aldersrelatert metylering av dette CpG island (
r
= 0,88,
p
= 0,0001).
(A) Eksempel på pyrogram resultater ved hjelp av CpG øy (primer region for pyrosekvensering ble vist i figur 1), med polymorf posisjon C /T-merket. Sequence leser TC /TGTC /TGGAGGAGGATAAGAG, pyrogram i venstre side shows.normal tykktarm og primær CRC (høyre side). (B) Resultat av relativ ekspresjon i normale tykktarm og koloncancer cellelinjer analysert ved qPCR for den fulle lengde transkript (probe A: Hs01005501_m1) og en blanding av full-lengde og avkortede transkripter (probe B og C: Hs01005520_m1, Hs01005539_m1) . Relativ ekspresjon i probe A var nedregulert i 5 av 6 cellelinjer undersøkt. Og de to andre prober (probe B og C) viser minimal nedreguleringen (eller til og med opp-regulering) i disse cellelinjene.
ved søkt å bedre forstå den DNA-metylering av de to homologe loci ved å utføre bisulfitt direktesekvenseringsanalyser som kan diskriminere mot de to loci. På grunn av den psiTPTE22 genet er 10 basepar mindre enn MLL3-genet i den regionen (figur 4A). Interessant, metylering av den MLL3 genet varierte fra 0-5% i normale slimhinner og CRC-cellelinjer med unntak av RKO (14,7%). Men, psiTPTE22 genet var svært metylert i tykktarm prøver, både i CRC cellelinjer og primære svulster. I tillegg, metylering av den psiTPTE22 loci var assosiert med aldersrelatert metylering i normal tykktarmsslimhinne (figur 4J).
(A-I) Bisulfite direkte sekvensering ble utført ved anvendelse av primere som dekker promoter-regionen i begge MLL3 ( større form) og psiTPTE22 ved hjelp av ulike alder av normale kolon epitheliums (alder: 24, 31, 38 41, 48, 52, 68 og 82 år gamle). (J) Dots plotte viser sammenhengen mellom DNA metylering i psiTPTE22 og hver prøve alder. Resultatene viser at psiTPTE22 metylering var korrelert med aldring, men ikke MLL3 (
r
= 0,830,
p
= 0,015).
For å undersøke uttrykket profilen til MLL3 brukte vi qPCR (kvantitativt polymerase chain reaction) og tre forskjellige TaqMan prober for å dekke den fulle lengde transkript (NM 170606), og den avkortede transkripsjon (NM 021230) (figur 1). Som vist i figur 3B, er den fulle lengde transkript (probe A) i det vesentlige nedregulert i 5 av 6 cellelinjer som ble undersøkt, noe som tyder på en genetisk etiologi for lyddemping (figur 3B). I motsetning til de to andre prober (probe B og C), som detekterer både avkortet og full-lengde-transkripter, viser minimal nedregulering (eller til og med opp-regulering) i disse cellelinjene. Samlet viser dataene at somatiske mutasjoner spesielt rammeskifte mutasjoner i kreft demper full lengde transkripsjon samtidig la den avkortede transkripsjon intakt.
Vi neste analysert to forskjellig størrelse på protein av MLL3 i celler (både villtype /ramme skift mutasjon). Proteinanalyse ble utført ved western blot for å fastslå om disse cellene kan produsere de passende MLL3 proteinet (figur 3C). MLL3 har en avkortet form i 3′-enden. Dermed har vi analysert MLL3 proteinnivå ved hjelp av antistoffer (dette antistoff er designet fra sentrum grensen MLL3 (Sigma-Aldrich, Cat. # SAB1300328 (St. Louis, MO)). Det vil oppdage bare lang isoform av MLL3 proteinprodukt.
Vi fant det egnede bånd i CaCo2 og SW480, villtype MLL3, og LoVo og SW48, heterozygote for det rammeskift-mutasjon, ved MLL3 antistoffet. i motsetning til dette var det ingen påvisbar bandet i RKO og HCT116, begge homozygot for rammeskifte mutasjon. Disse resultatene korrelerte med genuttrykk nivåer og protein analyse av MLL3 (figur 3B, C).
Diskusjoner
i denne studien fant vi hyppig inaktivering av MLL3 av rammeskifte mutasjoner som ikke hadde vært tidligere rapportert.
Vi har vist at (A)
9 veiene i MLL3 er mutert i mismatch reparasjon mangelfulle svulster. En tidligere studie [1] utelukkes mismatch reparasjon mangel svulster og still funnet mutasjoner i 2,2% av tilfellene (6/37). i primærsvulster, men vi skjermet for mutasjoner i de tidligere rapporterte berørte regionene og fant bare polyA veis mutasjoner. Vi har dermed undervurdert den nøyaktige mutasjonsraten av genet gitt at vi ikke sekvensere alle 59 eksoner i alle svulster. Likevel er det klart at MLL3 mutasjoner likne de av andre viktige tumor-suppressor genet i CRC – TGFBRII. For begge genene, de fleste mutasjoner sett i CRC er polyA veis mutasjoner i mismatch reparasjon mangel tilfeller [14], men noen av mutasjonene er også funnet utenfor polyA kanalen, blant annet i tilfeller uten mismatch reparasjon mangel. Forbedringer i sekvense teknologier og kostnader bør tillate nøyaktig estimering av MLL3 mutasjoner i primær CRC i nær fremtid.
Kombinasjon av epigenetisk og genetisk lyddemping karakteriserer flere tumor-suppressor og kreftfrem disponerende gener som P16, MLH1, VHL og andre. MLL3 viste utrolig DNA hypermethylation i CRC celler, men også i primærsvulster ved kvantitativ bisulfit pyrosekvensering analyse. For denne analysen analysert DNA metylering av CpG nettsteder 224 bp fra TSS som indikerte metylering i CRC cellelinjer, primære svulster og normal kolon. Imidlertid har vi funnet at rundt TSS på MLL3 det er en meget homolog (~92.0%) som en pseudo-genet på kromosom 22 som er oppkalt psiTPTE22 (pseudo-genet av transmembrane fosfatase med tensin homologi på kromosom 22). TPTE (trans fosfatase med tensin homologi) ligger på menneskelig kromosom 21 og har mange homologe kopier /pseudo på kromosom 13, 15, 21, 22 og Y [15].
Vi neste analysert disse CpG nettsted med bisulfate direkte sekvensering etter TOPO-TA-klonings i CRC-cellelinjer (figur S1A-i)) og primær normal tykktarm prøvene (figur 4A-J)). Bisulfitt direkte sekvensering analysen var i stand til å skjelne den fra psiTPTE22 MLL3 etter sekvensering fordi promotorområdet av psiTPTE genet er 10 bp mindre enn MLL3-genet (figur 4A). Vi fant at MLL3 viste bare 0-5% metylering med unntak av RKO som ble metylert ved 13,0%. På den annen side ble psiTPTE22 metylert mellom 65-90% i alle CRC-cellelinjer (figur 4B-I). Addtionally, psiTPTE22 hadde metylering nivå i normale kolon vev som ligner på det vi tidligere observert i flere gener [16].
pseudo er nedlagte slektninger av kjente gener som har mistet sin proteinkodende evne eller på annen måte ikke lenger er uttrykt i cellen [17]. Selv om noen ikke har introner eller arrangører, de fleste har noen gen-lignende funksjoner (for eksempel promotere, CpG øyer, og spleiseseter), er de likevel anses formålsløse, på grunn av deres mangel på proteinkodende evne som følge av ulike genetiske utkoblinger ( stoppkodonene, frameshifts, eller en mangel på transkripsjon) eller deres manglende evne til å kode RNA. Pseudogener er kjennetegnet ved en kombinasjon av homologi med et kjent gen og nonfunctionality. Det vil si, selv om hver pseudogen har en DNA-sekvens som ligner noe funksjonelt gen, er de likevel ikke i stand til å produsere funksjonelle sluttproduktet [18].
Interessant, Liang et al beskrev at psiTPTE22-Herv er stilnet av DNA metylering i ikke bare GI kreft, men også nyre-, lever- og lungekreft [19]. Og Herv-beslektede sekvenser i psiTPTE22-Herv er stort sett spleiset ut som intronene fra de transkriptene, og aminosyresekvensen av 15 kDa-proteinet er ikke en homolog til alle retrovirale proteiner. Disse gjør Herv relaterte psiTPTE22-Herv genet en vanlig somatisk genet.
I sammendraget, rapporterer vi at MLL3 inaktiveres i CRC ved genetisk forandring. Spesielt har vi funnet at mikro ustabil CRC celle løperens ha hyppige rammeskifte mutasjoner innen en (A)
9 kanalen kodende område av MLL3 forårsaker tap av protein funksjon, og en tidligere studie rapporterte om mutasjoner utenfor denne traktaten i mikro stabile kreft . Dessuten er det MLL3 promoteren CpG øy sterkt homolog til et CpG øy i promoterregionen av et pseudogen psiTPTE22. psiTPTE22 var tett metylering i både primær- CRC og korrelert med aldring i normal epitel, men ikke MLL3 (figur 4A-J). MLL3 tap av funksjon kan være en viktig funksjon i tidlig CRC tumorigenesis.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Bisulfite direkte sekvensering analyse av både MLL3 og psiTPTE22 metylering status på 6 CRC cellelinjer. (A-I) Vi fant 0-5% metylering av MLL3 i alle cellelinjer. Derimot ble den pseudo-genet (psiTPTE22) metylert mellom 65-90% i alle cellelinjer
doi:. 10.1371 /journal.pone.0023320.s001
(EPS)
Tabell S1.
Grunning sekvenser for sulfitt-pyrosekvensering og direkte sekvensering analyse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0023320.s002 plakater (DOC)
