Abstract
TP53 er den hyppigst muterte genet i hode- og halskreft (HNSCC), med mutasjoner som blir forbundet med resistens på konvensjonell terapi. Gjenoppretting av normal p53-funksjon er tidligere blitt undersøkt ved bruk av RITA (reaktivering av p53 og induksjon av tumorcelle-apoptose), et lite molekyl som induserer en konformasjonsendring i p53, som fører til aktivering av nedstrøms mål. I denne studien fant vi at RITA faktisk utøver betydelige virkninger i HNSCC celler. Men i denne modellen, fant vi at en betydelig utfallet av RITA behandlingen ble akselerert senescence. RITA-indusert senescens i en rekke p53 bakgrunner, inkludert p53 null-celler. Også hemming av p53 uttrykk så ikke ut til å hemme RITA-indusert alderdom. Således synes dette fenomenet til å være delvis p53-uavhengig. I tillegg synes RITA-indusert senescens å være delvis mediert av aktivering av DNA-skade respons og SIRT1 (Silent informasjon regulator T1) inhibering, med en synergistisk effekt sees ved å kombinere enten ioniserende bestråling eller SIRT1 inhibering med RITA behandling. Disse data peker mot en ny mekanisme for RITA funksjon samt hint på en mulig terapeutisk gevinst i HNSCC
Citation. Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Osman A, Woo SH, Myers JN, et al . (2014) p53-reaktivere lite molekyl RITA induserer Senescence i hode og nakke kreft celler. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10,1371 /journal.pone.0104821
Redaktør: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, USA
mottatt: 02.04.2014; Godkjent: 16 juli 2014; Publisert: 13 august 2014
Copyright: © 2014 Chuang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av The University of Texas MD Anderson Head and Neck Cancer SPORE Career Development Award (HS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mutasjoner i
TP53
er et felles genetisk forandring finnes i mange typer solid svulst, inkludert hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [1], [2]. Vår gruppe og andre har vist at
er TP53
mutasjoner assosiert med økt motstand mot stråling og kjemoterapi i HNSCC cellelinjer
in vitro Hotell og med dårlige resultater i pasienter med HNSCC [3] – [5 ]. Dessverre er terapeutiske strategier for å re-innføre villtype (wt) p53 inn i tumorer har vært logistikkmessig krevende [6], og således strategier blir undersøkt for terapeutisk re-aktivering av endogen p53 istedenfor [7] – [10]. En forbindelse av interesse, RITA (reaktivering av p53 og induksjon av tumorcelle-apoptose), er et lite molekyl som binder seg til den N-terminale ende av p53-proteinet, og induserer en konformasjonsendring som kan føre til gjenopprettelse av normal p53-funksjon [11] , [12]. RITA kan aktivere p53 nedstrøms mål i begge p53 vekt- [13], [14] og p53 mutant (MT) celler [15] i en rekke forskjellige modeller.
RITA er tenkt å virke primært via induksjon av apoptose , og faktisk RITA, alene eller i kombinasjon med cisplatin, kan indusere apoptose i mange HNSCC cellelinjer [16], [17]. Imidlertid er denne effekten ikke universell. Cellelinjer som uttrykker wt p53, men ikke gjennomgår apoptose i respons til RITA behandling omfatter HNSCC cellelinjen JHU-028 [17], den humane osteosarcoma-cellelinje SJSA og den humane colon carcinoma cellelinje RKO [18].
Apoptose er ikke den eneste celle skjebne etter p53-aktivering. Tallrike studier har funnet at aktivering av p53 som respons på forskjellige stimuli i kreftceller fører til akselerert aldrings [7]. Selv om det endelige utfallet av cellen etter at den går senescence er uklart, har flere studier knyttet til induksjon av senescence med respons til terapeutiske midler. Vi har observert at strålingen [3] og cisplatin [4] hemmet cellevekst ved å indusere senescens i wt p53 HNSCC-celler. I samsvar med denne observasjonen, HNSCC celler som uttrykker mt p53 funnet å være motstandsdyktig mot stråling eller cisplatin, hovedsakelig på grunn av mangel på en senescens respons. Vi har videre observert at mange av de samme cellelinjer er også resistente mot terapi-fremkalt apoptose [3], [4]. Dermed i hvert fall i denne modellen, induksjon av senescence synes å reflektere en gunstig behandlingsresultat.
Formålet med denne studien var å fastslå effekten av RITA på overlevelse, spredning, og induksjon av alderdom i flere menneskelige HNSCC cellelinjer. Vi videre søkt å forstå de mekanismer som disse effektene oppstår.
Materialer og metoder
Cellelinjer
HNSCC cellelinjer brukt i denne studien var generøse gaver fra Dr. Jeffrey Myers (The University of Texas MD Anderson Cancer Center og har tidligere blitt karakterisert [19]. HN30 og HN31 cellelinjer ble avledet fra en primærtumor og lymfe nodal metastasering av faryngeale squamous cell carcinoma respektivt. hele exome av disse to cellelinjene er blitt sekvensert for en separat prosjekt og, med unntak av TP53, ble det ikke observert andre uharmoniske mutasjoner mellom de to cellelinjene. PCI-13 cellelinjen var avledet fra et munnhulen squamous cell carcinoma. Alle cellelinjer ble opprettholdt i Dulbecco modifisert Eagle medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin /streptomycin, glutamin, natriumpyruvat, ikke-essensielle aminosyrer og vitaminer. Teknikker for stabilt å slå ned p53 i HN30-celler (som har wt p53) og HN31-celler (som har mt p53) er beskrevet andre steder [3]. PCI-13-celler, som ikke har endogent p53, ble konstruert for å uttrykke
TP53
overekspresjon konstrukter (wt p53, A161S, G245D), som ble samlet og satt inn i en pBabe retroviral vektor inneholdende en puromycin-motstand innsetting ( pBaBe-puro; Addgene) ved hjelp av standard kloningsteknikker. HN31-celler ble transfektert med kort-hårnål RNA (shRNA) som er spesifikt for SIRT-1 (Silent informasjon regulator T1) eller kontroll egge shRNA via lentivirale vektorer inneholdende den puromycin-resistensgenet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), i henhold til produsentens instruksjoner. Lentiviral-transfekterte kontrollceller (HN31-C2) og deres shRNA, stabil SIRT-en-knockdown motstykke (HN31-S19) ble isolert ved immunoblotting etter kloner ble screenet. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting.
Antistoffer og immunoblotting
Protein og fosforylerte protein uttrykk nivåer ble vurdert ved immunblotting av hel-cellelysater fra celler behandlet eller ikke behandlet med RITA. De følgende primære antistoffer ble brukt: p53 (DO-1) og fosfo-serin 15 p53 fra Santa Cruz Biotechnology; p21 fra Calbiochem; p-p53 (Ser-15), p53-oppregulert modulator av apoptose (PUMA), murine dobbel minute2 (MDM2), sjekkpunkt kinase 2 (Chk2), fosforylert Chk2 (p-Chk2, Thr68), SIRT1, og β-aktin fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Geit anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer konjugert til pepperrot peroksidase ble kjøpt fra Cell Signaling og Santa Cruz Biotechnology, henholdsvis.
Reagenser
RITA ble kjøpt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI ) og protein kinase inhibitor staurosporin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Den SIRT1 inhibitor Tenovin-6 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas). RITA ble oppløst i 100% dimetylsulfoksid (DMSO) til en lager-konsentrasjon på 50 mM og lagret som alikvoter inntil bruk. Staurosporin og Tenovin-6 ble oppløst i 100% DMSO og henholdsvis vann,, til foto konsentrasjoner på 1 M, og lagres som alikvoter inntil bruk.
veksthemming assays
cellenes levedyktighet analysen har vært tidligere beskrevet [20]. I korthet, 2000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners plater, ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av RITA for opp til 72 timer, og levedyktigheten ble bestemt med et MTT-assay. For den kolonidannelsesbestemmelsen [3], HNSCC cellene sådd ut i 6-brønns plater i 24 timer, behandlet med RITA, og dyrket i 10-14 dager. Celler ble løst i en 3% krystallfiolett /10% formalinløsning og kolonier som inneholder mer enn 50 celler ble telt med ImageJ programvare.
Senescence-associated- β-galaktosidase flekker
Senescence-forbundet p-galaktosidase (SA-β-gal) farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Cell Signaling Technology). I korthet HNSCC cellene sådd ut i 6-brønns plater og behandlet med RITA i forskjellige konsentrasjoner i forskjellige tidsrom (vanligvis 5 dager), hvoretter cellene ble fiksert i 10 minutter og farget for SA-β-gal-aktivitet over natten ved 37 ° C. Flat og blå-flekker celler ble scoret som senescent og rapportert som en prosentandel av alle celler observert per høy effekt felt.
Statistiske analyser
Data ble samlet for analyse fra flere uavhengige forsøk, og celle-baserte analyser ble utført i tre eksemplarer. Tosidige Student
t
tester ble brukt for å vurdere forskjeller i alderdom og for andre uparede gruppesammenligninger. For alle sammenligninger,
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekter av RITA på p53 og p53-assosierte proteiner
Vi brukte. et par av isogene HNSCC-cellelinjer, en med wt p53 (HN30) og den andre med mt p53 (HN31), for å teste effekten av RITA på ekspresjon og fosforylering av p53 og andre relaterte proteiner. RITA sterkt indusert fosforylering av p53 og p21 etter 12 timer i celler HN30 og etter 24 timer i HN31 celler (Fig. 1A). Puma proteinnivåer ble også forhøyet etter 24 timers eksponering til RITA i begge cellelinjer. Økningen i p53 uttrykk, p53 fosforylering, og PUMA uttrykk på 24 timer var alle doseavhengig (Fig. 1B). Disse resultatene indikerer at RITA kan aktivere nedstrøms mål for p53-signalering i disse isogene cellelinjer med vekt- eller mt p53.
(A og B) HN30 (villtype p53) og HN31 (mutert p53) hode og hals kreftceller ble behandlet med RITA i de angitte tidsrom (A) og doser (B) og ekspresjon av p53 og dets mål ble evaluert ved immunblotting. (C) Cellene ble behandlet med RITA (0,1 uM-20 uM) i 72 timer og vurdert gjennom MTT-analyse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± bred singlett fra tre eksperimenter. (D) HN30 og HN31 celler ble behandlet med RITA på de angitte doser i 10-14 dager, hvoretter kolonier ble løst, farget, og kvantifisert. Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± bred singlett fra tre eksperimenter. * – Indikerer p 0,05 versus ubehandlet kontroll
RITA hemmer vekst av hode og nakke kreft cellelinjer
Flere studier har som RITA kan indusere tumor celledød [15], [. ,,,0],18]. I første omgang har vi testet om RITA kan undertrykke veksten av HN30 og HN31 celler. Ved hjelp av en kortsiktig celleproliferasjon analysen, fant vi at RITA, ved konsentrasjoner i løpet av fem mikrometer, indusert beskjeden vekst undertrykkelse både HN30 og HN31 celler etter 72 timer med kontinuerlig behandling (Fig. 1C). På lengre sikt kolonidannelse analysen ble RITA funnet å vesentlig redusere antall kolonier dannet ved begge cellelinjer ved alle testede doser (p 0,05). (Fig. 1D)
RITA induserer senescens i hodet og hals-kreft-cellelinjer
Vi har tidligere vist at den dominerende modusen for respons på enten fysiologisk relevante konsentrasjoner av cisplatin [4] eller standard doser av stråling [3] i p53 villtype HNSCC cellelinjer er ikke apoptose. Tilsvarende, i dagens modell, var minimal caspase og PARP cleavage observert etter eksponering for RITA (Fig. 2A). Derfor, for å teste hypotesen om at den observerte anti-proliferative respons av HN30 HN31 og celler til RITA var i det minste delvis på grunn av induksjon av senescens, analyserte vi SA-β-gal-aktivitet, en markør for celle senescens. Vi fant at RITA påvirkes cellemorfologi og betydelig økt SA-β-gal-farging på en doseavhengig måte i begge cellelinjer (p 0,05, Fig. 2B), som indikerer at RITA behandling førte til akselerert aldrings i disse isogene cellelinjer.
(A) PARP og caspase 3 cleavage ble undersøkt via western blotting etter eksponering av celler til RITA på 1fiM for de angitte periodene. P, staurosporin (1 uM i 8 timer) ble benyttet som en positiv kontroll. (B) HN30 HN31 og cellene sådd ut i 6-brønns vevskulturplater ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av RITA i 5 dager, hvoretter cellene ble fiksert og farget for begynnende alderdom-assosiert -β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet . Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. I hver behandlet eller ubehandlet brønn, ble fem tilfeldige feltvalg gjort, og antall celler med senescent morfologi og med blåfarging ble tellet under 20X forstørrelse (Olympus IX71). * – Indikerer p 0,05 versus ubehandlet kontroll
p53 status og RITA-mediert veksthemming i HNSCC cellelinjer
Neste, for å undersøke om RITA-induced senescence avhenger av p53 status. , behandlet vi stabil-p53-knockdown cellelinjer HN30-shp53 og HN31-shp53 med Rita og funnet ut at knockdown av p53 protein uttrykk kraftig redusert både uttrykket og fosforylering av p53 (fig. 3). Imidlertid baseline p21 ekspresjon var uforandret i HN30 (wt p53) celler (fig. 3A). Vi har videre funnet at p53-hemming hadde bare en delvis rednings effekt på RITA-indusert veksthemming og kolonidannelse i HN30-celler, og det hadde ingen signifikant effekt på rednings HN31-celler (fig. 3B). Videre gjorde p53 knockdown ikke påvirke RITA-indusert senescence i enten type p53-knockdown-celler (fig. 3C).
(A) Nivåene av total og fosforylert p53 og p21 ble målt i HN30 og HN31 lentiviral- transfekterte kontrollceller og deres korte hårnål RNA, p53-stabil-knockdown motstykker etter behandling med en RITA uM i 72 timer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (B) HN30 og HN31 lentiviral-transfektert kontrollceller og deres p53-stabil-knockdown kolleger ble behandlet med RITA på de angitte doser i 10-14 dager, hvoretter kolonier ble løst, farget, og kvantifisert. Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± bred singlett fra tre eksperimenter. I alle cellelinjer (kontroll og sh53), RITA behandling førte til signifikant (p 0,05) reduserte kolonidannelse ved alle doser som ble testet. (C) HN30 HN31 og lentivirale-transfekterte kontrollceller og deres p53-stabil-knockdown motstykker ble utsådd i 6-brønners vevskulturplater og behandlet med de angitte konsentrasjoner av RITA i 5 dager, hvoretter cellene ble fiksert og farget for senescence- forbundet -β-galaktosidase (SA-β-gal). Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. Med unntak av 0,1 pM i HN30-shp53, alle doser av RITA i alle cellelinjer førte til signifikant (p 0,05) øket SA-β-gal sammenlignet med ubehandlet kontroll. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom kontroll og shp53 i begge cellelinje.
Neste, vi testet om tilberedning av vekt p53 og mt p53 i p53-null PCI-13 celler vil gi mottakelighet for RITA. For disse eksperimentene, pBabe (vektor kontroll), wt p53, og A161S og G245D mutante p53 konstruksjonene ble re-introdusert i PCI-13 celler til å produsere PCI-13-pBABE, PCI-13-WT, PCI-13-A161S og PCI-13-G245D cellelinjer. I motsetning til p53-positive celler, p53 og p53, fosforylert ble ikke påvist i de PCI-13 pBabe kontrollceller (Fig. 4A). Også, p21 ble uttrykt bare av vekt- uttrykkende celler, og ved en av de MT p53-uttrykkende celler (PCI-13-A161S).
(A) PCI-13 (p53) null-celler som uttrykker vektoren kontroll eller de angitte p53 konstruksjonene ble behandlet med RITA 2,5 mikrometer i 72 timer etter hvilken proteinlysatene ble utarbeidet og nivåer av total og fosforylert p53 og p21 ble vurdert av western blotting. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (B) PCI-13-celler som uttrykker de angitte konstruksjoner ble utsådd på 6-brønners plater, ble behandlet med RITA ved de angitte konsentrasjoner, og tellet i en klonogene assay. Med unntak av pBabe celler behandlet ved 0,25 uM på alle cellelinjene ved alle de testede konsentrasjoner av RITA oppviste betydelig redusert kolonidannelse sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (p 0,05). (C) PCI-13-celler som uttrykker de angitte konstruksjonene ble utsådd i 6-brønners vevskulturplater og behandlet med 0,25 uM av RITA, hvoretter cellene ble fiksert og farget for begynnende alderdom-assosiert -β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet . Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. Alle cellelinjer viste signifikant øket SA-β-gal-farging sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (p 0,05).
A langvarig kolonidannelse analyse (Fig. 4B) og SA-β-gal-farging (fig. 4C) viste at RITA signifikant inhiberte cellevekst og begynnende alderdom indusert i alle de PCI-13 cellelinjene, uavhengig av p53 status, inkludert p53-null foreldrelinje (p 0,05). Dermed gjør tilstedeværelsen av p53 protein ikke ut til å være nødvendig for RITA å utøve sin effekt.
RITA-indusert DNA skade respons i HNSCC cellelinjer er forbundet med SIRT1 downregulation
RITA er også kjent for å indusere DNA-skade reaksjon [21], [22]. Checkpoint kinase 2 (Chk2) er en viktig nedstrøms mål på DNA-skade reaksjon og fører til cellesyklusstans, apoptose, eller begynnende alderdom. Spesielt, kan aktiveres Chk2 indusere p53-uavhengig alderdom i kreftceller [23], [24]. Disse resultatene, med det resultatet at RITA hemmer HNSCC cellevekst og kan indusere senescence selv i fravær av p53, ledet oss til å undersøke effekten av RITA på Chk2 uttrykk og fosforylering status. Vi fant at Chk2 protein ble fosforylert på sitt aktivering stedet, Thr68, etter eksponering for RITA i HN30, HN31 og PCI-13 celler, uavhengig av p53 status (Fig. 5A).
(A) HN30 eller HN31 celler transfektert med lentiviral kontroll eller kort-hårnål RNA, p53-stabil-knockdown konstruksjoner ble behandlet med 1 pM RITA 1 i 72 timer, hvoretter protein lysater ble fremstilt og nivåer av total og fosforylert Chk2 vurdert ved immunblotting. Høyre: PCI-13 celler transfektert med de angitte konstruksjoner ble behandlet med 2,5 mikrometer RITA for ulike perioder, etter som proteinlysatene ble utarbeidet og nivåer av total og fosforylert Chk2 ble vurdert. (B) HN30, HN31, og PCI-13 celler med de angitte p53 konstruksjonene ble behandlet med RITA for de angitte periodene, og lysatene ble vurdert for SIRT1 protein uttrykk ved Western blotting. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (C) HN31 celler som stabilt transdusert med lentivirale vektorer kontroll (C) eller SIRT1 shRNA (S) ble innledningsvis analysert for inhibisjon av SIRT-1-ekspresjon. Representative kloner ble deretter behandlet med 2,5 uM RITA i 72 timer, hvoretter de angitte proteiner ble ekstrahert og analysert ved western blotting. (D) HN31 celler som stabilt transdusert med lentiviral kontroll vektorer (K2) eller SIRT1 shRNA (S19) ble utsådd i 6-brønners vevskulturplater og behandlet med de angitte konsentrasjoner av RITA i 5 dager, hvoretter cellene ble fiksert og farget for begynnende alderdom -associated -β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet. Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. * – Indikerer signifikant økt sammenlignet med kontroll vektor ved den angitte dose (p 0,05). (E) HN31 celler ble sådd på 6-brønners plater og behandlet med RITA (0,25 M), med eller uten Tenovin 6 (0,125 eller 0,25 uM) i 10 dager, hvoretter kolonier ble fiksert, farget, og kvantifisert. * – Indikerer betydelig redusert sammenlignet med Tenovin 6 alene gruppen på den angitte dose. Dataene er normalisert til enten kjøretøy-bare eller RITA behandlingsforhold. Representative bilder fra tre forsøk med lignende resultater er vist. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SE fra tre forsøk.
Deretter fordi Chk2 synes å aktivere cellulære senescens ved inhibering SIRT1 [25], og fordi knockdown eller inhibering av SIRT1 aktivitet også kan indusere senescens lignende vekstarrest i fravær av funksjonell p53 [26] – [28], evaluerte vi SIRT1 uttrykk og fant at RITA førte til redusert SIRT1 ekspresjon i alle cellelinjer undersøkt, uavhengig av p53 status (figur 5B).
for å teste denne effekten ytterligere, vurderes vi om uttømming av SIRT1 av shRNA ville forbedre den biologiske effekten av RITA. Vi fant ut at shRNA-mediert hemming av SIRT1 redusert SIRT1 protein nivåer og økt fosforylerte Chk2 nivåer etter eksponering for RITA (Fig. 5C). Videre RITA behandling vesentlig forbedret SA-β-gal farging i HN31-S19 (SIRT1-knockdown) celler sammenlignet med HN31-C2 (kontroll-transfektert) celler (fig. 5D). Til slutt, kombinasjonen av RITA og SIRT1 inhibitor Tenovin 6 produsert en synergistisk hemming av cellevekst effekt (fig. 5E). Sammen er disse resultatene tyder på at RITA kan hemme SIRT1 uttrykk og at denne effekten bidrar til RITA-indusert alderdom.
RITA øker Radiosensitivity av mutant p53-uttrykk HNSCC
På bakgrunn av våre tidligere funn at Radiosensitivity i HNSCC celler er sterkt knyttet til deres evne til å gjennomgå senescence etter bestråling, spesielt at HN31 mt p53-celler er radioresistant og har lave nivåer av stråling-indusert senescence, og våre nåværende funn som RITA redusert levedyktighet og økt senescence i HN31 celler, vi undersøkt om RITA kunne fungere som en radiosensitizer. Vi fant at forhåndsbehandling av HN31 celler med RITA i 24 timer, etterfulgt av bestråling resulterte i synergistisk inhibering av cellevekst, når man sammenligner den IC80 (Fig. 6A). Nærmere bestemt ble det gjensidig ikke-eksklusive kombinatorisk indeks (CI) beregnet ved hjelp av metoden til Chou heller, våre funn tyder på at RITA kan føre til begynnende alderdom i HNSCC-celler blant andre effekter, og er ikke helt avhengig av p53-ekspresjon.
Selv om mange av de som er involvert i senescens veier er mediert av p53, spesielt i sammenheng med p53 fosforylering, kan begynnende alderdom også forekomme i fravær av dette protein, noe som tyder på at p53-uavhengige mekanismer kan også mediere terapi-fremkalt senescens av tumorceller [30] – [34]. For eksempel, ble doksorubicin vist å indusere en senescent fenotype i de p53-null Saos-2-celler, i SW480 og U251-celler som uttrykker mutante p53, og i HeLa og Hep-2 cellelinjer, hvori p53-funksjon er blitt hemmet [35 ].
Andre grupper har rapportert at RITA kan ikke bare indusere p53 men også indusere en samtidig DNA skade respons [21], [22]. DNA skade respons innebærer to viktige signalveier, sensoren kinaser ataksi telangiectasia mutert (ATM) og ataksi telangiectasia og Rad3 relaterte (ATR). Disse kinaser aktivere nedstrøms effektor kinaser Chk2 og Chk1. Chk2 kan utløse replicative senescence via p53 /p21 eller andre veier som svar på telomerer dysfunksjon og DNA-skade [36]. Nylig Chk2 ble vist å modulere cellulær respons på RITA [22]. Våre funn som RITA behandling bedt om en økning i Chk2 fosforylering uavhengig av p53 status er i samsvar med denne observasjonen (Fig. 5).
Under forhold med cellulært stress eller DNA-skade, kan Chk2 aktivering føre til en reduksjon i SIRT1 uttrykk og senescence [25]. SIRT1 er et sterkt konservert histon deacetylase som er kjent for å formidle cellulær metabolisme, aldring, og som reaksjon på stress [37]. Overekspresjon av SIRT1 har vist seg å inhibere cellulær senescens i en rekke forskjellige maligniteter [38]. I tillegg er SIRT1 overuttrykt i kjemoresistent celler, og inhiberer SIRT1 kan undertrykke tumorvekst i noen modeller [27], [38] – [40]. Faktisk, i denne studien fant vi at RITA hemmet SIRT1 uttrykk i alle cellelinjene som ble testet, uavhengig av p53 status (Fig. 5B). Videre behandling med en SIRT1 hemmer eller SIRT1 spesifikke shRNA ført til nedgang i vekst og økning i senescence i forbindelse med RITA behandling. Selv om inhibering av SIRT1 er antatt å indusere senescens primært ved å interagere med p53, har i det minste en gruppe vist at doxorubicin kan indusere senescens i SCC-celler som mangler p53 via hemming av SIRT1 [26]. I tillegg har en gruppe rapportert at hemming av SIRT1 kan indusere senescence i H1299 (p53 null) via redusert aktivitet i Ras /MAPK signalering. Disse observasjonene kan gi en link til de observerte effektene av RITA, selv i HNSCC celler som mangler p53 protein. På bakgrunn av våre funn fra denne studien, samt andres arbeid, foreslår vi at RITA induserer vekst arrest og senescence ved minst to forskjellige baner (Fig. 6B). I p53-kompetente celler, RITA virker sannsynligvis først og fremst via kanoniske p53-mål, som er den dominerende effekt av legemidlet. Det endelige utfallet av denne aktiveringen kan være enten apoptose eller senescence avhengig av sammenhengen. Omvendt blir en mindre, men fremdeles signifikant effekt på cellelevedyktighet sett i p53-defekte cellelinjer. Imidlertid, i fravær av funksjonell p53 eller p53 protein, synes RITA å utøve i det minste noen av dens virkninger via aktivering av DNA-skade respons og inhibering av SIRT1 uttrykk. Den nøyaktige innholdet i denne dobbeltfunksjon vil kreve videre studier.
Vi har tidligere knyttet respons til cisplatin og strålebehandling med induksjon av senescence, viser at celler som er mer motstandsdyktig mot disse stoffene er også motstandsdyktig mot aldrings induksjon [3 ], [4]. Selv om ønskeligheten av terapi-fremkalt senescens som en respons på klinisk brukte terapi er en sak av stor debatt [41], for celletyper som er svært motstandsdyktig mot andre former for celledød eller stansing, kan det begynnende alderdom være en alternativ terapeutisk resultat. Våre funn at lave doser av RITA (0,1-0,5) kan selektivt bevisst svært motstandsdyktig HNSCC celler til behandling in vitro [3] antyder at tilsetning av RITA kan vise seg å være en levedyktig strategi for sensibiliserende svulster for stråling, den mest brukte behandling for HNSCC.
takk
Vi vil gjerne takke Mei Zhao for hennes verdifull teknisk assistanse.
