Abstract
Tumor overlevelse er betydelig korrelert med immunresponsen av pasientene. IFNg spiller en viktig rolle i tumoren vertsrespons og redusert IFNg uttrykk er ofte observert i lungekreft. Studier har vist at CpG island hypermethylation spiller en avgjørende rolle i transcriptional stanse av IFNg genuttrykk. Det er imidlertid begrenset forståelse vedrørende de molekylære mekanismer endret metylering, og om svulsten mikromiljøet har noen effekt på DNA-metylering og IFNg produksjon. I denne studien, viser vi at plasma og intracellulære IFNg nivåene er betydelig lavere i lungekreftpasienter. Hypermethylation av IFNg promoter i CD4
+ T-celler og plasma IFNg er negativt korrelert. CD4
+ T-celler fra friske individer ko-dyrket med SPC-A1-celler generert lavere nivåer av IFNg etter aktivering, forhøyet ekspresjon av DNA-metyltransferaser (DNMTs), og oppviste hypermethylation av IFNg promoteren. Som konklusjon, redusert IFNg ekspresjon av CD4
+ T-celler ko-dyrket med lungekreft celle er forbundet med IFNg promoter hypermethylation. Vår studie antyder at interaksjonen mellom lungekreft celler og CD4
+ T-celler induserer DNMT uttrykk og IFNg promoter hypermethylation i CD4
+ T-celle, som kan tjene som en viktig mekanisme for tumorindusert immunsuppresjon.
Citation: Wang F, Xu J, Zhu Q, Qin X, Cao Y, Lou J et al. (2013) nedregulering av IFNg i CD4
+ T celler i Lung Cancer gjennom Hypermethylation: En mulig mekanisme av tumorindusert immunsuppresjon. PLoS ONE 8 (11): e79064. doi: 10,1371 /journal.pone.0079064
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 02.07.2013; Godkjent: 24 september 2013; Publisert: 11.11.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81371894, 81272324, 81201359, 81101322), Key Laboratory for laboratoriemedisin i Jiangsu-provinsen i Kina (No. XK201114), et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu Higher Education institusjoner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft har en kort 5-års overlevelse siden det er vanskelig å diagnostisere og behandle på et tidlig stadium [1]. Selv om mekanismene for lungekreft initiering ikke er fullt ut forstått, antas det at tumoren unnslipper immunovervåkning [2].
Cytokiner er en del av et komplekst immunrespons som kan bidra til utvikling av kreft, så vel som eliminere den. Det er en nær sammenheng mellom tumorprogresjon og feilregulering av cytokin ekspresjon, som sett i IFNg, TGF-β, og IL-17 [3], [4]. Blant disse cytokiner, IFNg, som ble oppdaget i 1965, har et rykte for å hjelpe vakt mot neoplastisk sykdom. IFNg hemmer proliferasjon, sensitizes tumorceller til apoptose, opp regulerer MHC klasse I og klasse II ekspresjon, og stimulerer antitumorimmunaktivitet [5], [6]. Redusert IFNg serumnivåer har vært knyttet til kortere overlevelse i lungekreft [7]. Derfor belyse de molekylære mekanismer for IFNg i tumorgenese er kritisk for å få en mer klar forståelse av patogenesen tumor.
epigenetiske endringer som histonmodifikasjonene, DNA-metylering, og variasjoner i kromatinstruktur har vist seg å være viktig for den selektive transkripsjon av cytokingener i T-celleundergrupper. Blant disse, har DNA-metylering blitt studert bredt i forhold til cytokinproduksjon genekspresjon [8] – [10]. I denne studien, vurderte vi den inverse korrelasjonen av IFNg ekspresjon og DNA-metylering i lungepasienter. Enda viktigere, for å vurdere om lungekreft celler kan påvirke metylering status av immunceller ved å nedregulere IFNg uttrykk, etablerte vi en in vitro transwell dyrking system og deretter undersøkt CpG metylering av IFNg promoter i CD4
+ T-celler.
Resultater
IFNg nivåene av friske kontroller og lungekreftpasienter
ELISA ble brukt til å oppdage plasma IFNg nivåer (fig. 1a). De IFNg nivåer i lungekreftpasienter var signifikant lavere (69,30 ± 38,56 pg /ml) enn hos friske kontroller (92,62 ± 34,75 pg /ml,
P
= 0,017).
(A) sammenligning av plasma IFNg nivåer i studiegrupper. ELISA ble anvendt for å måle plasmanivåene IFNg i 30 lungekreftpasienter og 30 friske kontroller. Plasma IFNg nivåer i pasienter og friske kontroller var 69,30 ± 38,56 pg /ml og 92,62 ± 34,75 pg /ml (*
P
= 0,017). (B) Representative resultater av IFNg ekspresjon av CD4
+ T-celler fra lungekreftpasienter (n = 2) og friske kontroller (n = 2). (C) Flowcytometrisk analyse av IFNg nivåer i kollokviegrupper. Dataene er enkeltfrekvensen fra lungekreftpasienter (n = 9) og friske kontroller (n = 9). Horisontale linjer indikerer gruppen betyr. Uavhengige t-tester ble brukt for å beregne
P
verdier (***,
P
0,001).
IFNg produseres hovedsakelig av CD4
+ T-celler, men også ved hjelp av NK-celler og CD8
+ T-celler. Å reflektere IFNg uttrykk i CD4
+ T-celler, evaluert vi CD4
+ T-celler ved flowcytometrisk analyse. PBMC fra 9 lungekreftpasienter og 9 friske kontroller ble samlet og IFNg ble detektert. En lavere frekvens av IFNg produsere CD4
+ T-celler ble påvist hos lungekreftpasienter sammenlignet med friske kontroller (fig 1B-C, P . 0.001).
IFNg Gene Arrangøren Metylering er negativt korrelert med IFNg nivåer
CD4
+ T-celler ble isolert fra PBMC av 11 pasienter og 10 kontroller. IFNg genpromoteren regioner 526 bp i lengde ble undersøkt ved bisulfitt-sekvensering av PCR. 15 omvendt tråd sekvenser av hver prøve ble scoret for sin metylering profil på CpG nettsider -295, -186, -54, 122, 128 og 171 i forhold til transkripsjonsstartsetet (fig. 2A).
(A) En 526-bp region av IFNg promoter ble PCR-amplifisert fra bisulfitt-behandlede revers tråden. Denaturert cytosines resistente mot sulfitt behandling ble scoret fra 15 klonede PCR sekvenser for den enkelte og er merket på genet kartet som CpG (Squares). (B) Gene kart over metylert IFNg promoter i CD4
+ T-celler fra ti friske kontroller. Graden av metylering ved hvert CpG nettstedet er avbildet av styrken av skyggelegging. (C) Gene kart over det metylerte IFNg promoteren i CD4
+ T-celler fra 11 forskjellige lungekreftpasienter. Graden av metylering ved hvert CpG nettstedet er avbildet som beskrevet i B. (D) IFNg metylering av CpG steder i IFNg formidler av CD4
+ T-celler var signifikant forskjellig mellom lungekreftpasienter og friske kontroller. Data som er oppgitt er den prosent metylering for hver IFNg arrangøren CpG nettstedet. En Chi-kvadrat test beredskaps bord ble brukt til å tildele
P
verdier for lungekreftpasienter vs friske kontroller. Sammenligninger etter scoring nominelle størrelser for lungekreftpasienter /friske kontroller og denaturert /unmethylated i kontinuerlige data for hver CpG side (feilfelt, SD, *,
P
0,05; **
P
0,01, ***,
P
0,001). (E) korrelasjonsanalyse for den totale prosent metylering med IFNg plasmakonsentrasjon i lungekreftpasienter. Korrelasjonen ble analysert ved Spearmans koeffisient.
Bisulfite sekvens av IFNg promoter fra lungekreftpasienter (n = 165 kloner) viste en signifikant høyere grad av metylering ved CpG områder i forhold til de i friske kontroller ( n = 150 kloner). Total metylering ved CpG steder i lungekreftpasienter og friske kontroller ble 85,4% og 71,4%, henholdsvis (
P
0,001) (tabell 1). Vi sammenlignet med prosentandelen av spesifikke CpG metylering områder for hver prøve. Den IFNg formidler av CD4
+ T-celler som vises hypermethylation 6 CpG steder i pasienter sammenlignet med friske kontroller (Fig. 2B, 2C). Spesielt CpG metylering ved IFNg formidler av pasientens CD4
+ T-celler var signifikant høyere i posisjonene -186, -54, 122, +128 og +171 (p 0,01) av Pearson Chi-kvadrat test (Fig . 2D). Blant disse stillingene, transkripsjonsfaktorbindingsseter oppstå ved -186, -54, med områder på 122, 128 proksimalt for transkripsjon start stedet.
For å ytterligere evaluere effekten av metylering på IFNg uttrykk beregnet vi korrelasjonen mellom plasmakonsentrasjon IFNg og metylering hastighet hos pasienter. Plasma IFNg konsentrasjoner ble negativt korrelert med prosent av IFNg promoter metylering i pasientens CD4
+ T celler (r = -0,797,
P
= 0,004, fig. 2E).
Undertrykt IFNg ekspresjon av CD4
+ T-celle i SPC-A1 Transwell kultursystem
A transwell dyrking system ble anvendt for å undersøke effekten av lungekreft cellelinjen SPC-A1 på IFNg ekspresjon av CD4
+ T-celler (fig. 3A). CD4
+ T-celler isolert fra transwelldyrkningssystem med SPC-A1 viste dårlig IFNg produksjon etter at anti-CD3-stimulering i 6 timer eller 24 timer. I motsetning til dette, CD4
+ -T-celler dyrket i fravær av SPC-A1 viste en kraftig IFNg respons etter anti-CD3 stimulering i 6 timer eller 24 timer. (
P
0,05;
P
0,05, figur 3B.). Resultater av kvantitative RT-PCR-analyse viste også at CD4
+ T-celler dyrket i fravær av SPC-A1 viste en sterk IFNg mRNA-ekspresjon etter at anti-CD3-stimulering i 6 timer eller 24 timer, sammenlignet med CD4
+ T-celler co-dyrket med SPC-A1 (
Fold = 2,37, P
0,05;
Fold = 2,37, P .
0.05, figur 3C).
( A) CD4
+ T celler co-dyrket med SPC-A1. CD4
+ T-celler (6 x 10
5-celler /brønn) og SPC-A1 (2 x 10
5-celler /brønn) ble dyrket adskilt av en 0,4 pm pore innskuddet i 24-brønners kulturplater . SPC-A1-celler ble dyrket i de ytre brønnene og CD4
+ T-celler ble dyrket i suspensjon i de indre brønner. (B) Fremstilling av IFNg i CD4
+ -T-celler dyrket med eller uten SPC-A1. Supernatanter ble samlet opp etter at anti-CD3 eller CD28-stimulering etter 6 eller 24 timer, og IFNg påvist ved hjelp av ELISA. Resultatene er fra eksperimenter utført på CD4
+ T-celler fra 6 friske frivillige (feilfelt, SD). (C) Kvantitativ RT-PCR analyse av IFNg transkripsjoner fra CD4
+ T-celler dyrket med eller uten SPC-A1. RNA ble isolert etter at anti-CD3 eller CD28-stimulering etter 6 eller 24 timer. Resultatene er fra eksperimenter utført på CD4
+ T-celler fra 6 friske frivillige. IFNg nivåene økte 2,37 ganger når stimulert i 6 timer i CD4
+ T-celler dyrket uten SPC-A1, sammenlignet med CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1.
Hypermethylation status den IFNg arrangøren i CD4
+ T celler Co-dyrket med SPC-A1
metylering status for IFNg promoter i CD4
+ T-celler dyrket med og uten SPC-A1 celler ble evaluert. Promotoren som vises hypermethylation etter ko-dyrket med SPC-A1-celler (n = 90 kloner), viste en skarp kontrast til CD4
+ -T-celler dyrket uten SPC-A1-celler (n = 90 kloner). Prosentandelen av CpG steder i CD4
+ T-celler dyrket med eller uten SPC-A1 var 85,4% og 70,9%, henholdsvis. Antallet denaturert og unmethylated områder ble scoret og Chi-kvadrat analyse ble brukt for å vurdere p-verdier (***,
P
0,001) (tabell 2). Vi deretter sammenlignet prosent av spesifikke CpG metylering seter for hver gruppe (fig. 4A, B). Metyleringen prosent når IFNg promoteren var 80,0% -95,5% og 64,4% -78,9%, med og uten SPC-A1 ko-kultur, respektivt. CPG områder i posisjonene -295, -186, -54, +128 og +171, spesielt, viste signifikante forskjeller (fig. 4C).
(A) Gene kart over det metylerte IFNg promoteren i CD4
+ T celler dyrket uten SPC-A1 fra 6 friske frivillige. Graden av metylering ved hvert CpG nettstedet er avbildet av styrken av skyggelegging. (B) Gene kart over hypermethylated IFNg promoter i CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1 fra 6 friske frivillige. Graden av metylering ved hvert CpG nettstedet er avbildet av styrken av skyggelegging. (C) metylering av CpG områder i IFNg arrangøren var signifikant forskjellig mellom CD4
+ T-celler dyrket med eller uten SPC-A1 celler. Graf oppsummerer prosent av metylert CpG nettstedet observert i hver posisjon analysert. IFNg arrangøren viser hypermethylation blant CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler sammenlignet med CD4
+ T celler dyrket uten SPC-A1 celler. Chi-kvadrat test beredskaps bord ble brukt til å tildele
P
verdier. Sammenligning av CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler vs CD4
+ T celler dyrket uten SPC-A1 celler (feilfelt, SD,
*
P
0,05;
**
P
0,01). (D) Total RNA ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR ble utført for å kvantifisere DNMT1 og DNMT3b mRNA nivåer. De mRNA-nivåer ble normalisert til p-aktin. De ble vist å være prosenter av CD4
+ T-celler dyrket med eller uten SPC-A1 celler, fra tre uavhengige eksperimenter, uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
DNMT1 og DNMT3b mRNA nivåer i CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1 cellene opp regulert sammenlignet med CD4
+ T-celler dyrket alene (DNMT1 fold = 2,7,
P
0,05; DNMT3b fold = 2.2,
P
. 0,05)
Diskusjoner
Et klarere bilde av det dynamiske forholdet mellom vertens immunsystemet og tumorvekst fremstår som celler og molekyler som delta i naturlige anti-tumor immunrespons blir identifisert [11], [12]. Vertens immunsystem aktivering av IFNg er avgjørende for en anti-tumorrespons. Fersk studie viste at IFNg er avgjørende for svulst overvåking av immunsystemet, og at det var en høy korrelasjon mellom IFNg produksjon og tumor regresjon under immunterapi [5]. Mus som mangler eller som mangler IFNg reseptorer eller STAT1 utviklede tumorer raskere, og hadde en høyere svulst frekvens enn villtype-mus etter utfordring med methylcholanthrene [13], [14].
Det er vel kjent at cytokin ekspresjon styres via et nettverk av transkripsjonsfaktorer og epigenetiske modifikasjoner [15] – [18]. Menneskelige studier har vist at IFNg produksjon i voksen perifert blod og navlestrengsblod er regulert av CpG metylering på områder innenfor eller i tilknytning til IFNg promoter i CD4
+ /CD45RO
– T-celler [19], [20]. I tillegg har en rolle for IFNg promoter metylering i atopisk syndrom blitt foreslått [21], som pekt på metylering som en mekanisme for regulering av ekspresjon. Bronkial astma pasienter viser hypermethylation av IFNg-genet i CD4
+ T-celler etter allergenbehandlingen som korrelert med redusert IFNg uttrykk [22], [23]. Lignende funn er også rapportert i PBMC fra akutt-på-kronisk hepatitt B leversvikt og tykktarmskreftpasienter [24], [25]. Alle disse observasjonene tyder DNA metylering er en viktig epigenetisk mekanisme som innebærer i IFNg uttrykk regulering.
I vår studie har vi observert redusert nivå av plasma IFNg og intracellulær IFNg i CD4
+ T-celler fra lungekreft pasienter. Disse resultatene tyder på at IFNg uttrykt lavere i lungekreft. En akkumulerende mengde bevis har implisert CpG metylering av IFNg promoteren som en viktig negativ transcriptional regulator av IFNg produksjon i humane T-celler [26], [27]. I den foreliggende undersøkelse, søkte vi bisulfitt-sekvensering for å bestemme den CpG metylering status for IFNg promoteren. En betydelig negativ korrelasjon mellom IFNg plasmakonsentrasjon og total IFNg promoter metylering i CD4
+ T-celler av lungekreftpasienter ble observert. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som tyder på at IFNg promoter metylering kan påvirke IFNg uttrykk i lungekreft. Våre resultater er i samsvar med funnene at epigenetisk metylering status av IFNg kan spille en avgjørende rolle i modulering av slimhinne cytokinsekresjon [28] og i bronkial astmapasienter [22].
Vi sammenlignet også metylering statusen for flere CpG nettsteder. I lungekreftpasienter, fem av seks CpG nettsteder (-295, -186, -54, 122, 128, 171) analysert ble betydelig hypermethylated (det eneste unntaket var stedet -295). Spesielt graden av metylering økt fremtredende på 122, og 128, noe som tyder på et nært forhold til IFNg uttrykk. Vi fant en fremtredende økning i graden av metylering i posisjonene -295, -186, -54, +128 og 171 (uten å endre på nettstedet 122) i CD4
+ T-celler co-dyrkede med adenokarsinom celle lunge linjen SPC-A1. Spesielt graden av metylering økt fremtredende i posisjonene -54, 128, og 171. Dette resultat viste en liten forskjell fra det resultat observert hos lungekreftpasienter, som eksistensen av variansen miljø mellom in vitro og in vivo tilstanden.
Det er stor interesse for bedre å forstå de molekylære mekanismer som fører til endret metylering av den IFNg-genpromoteren i tumorgenese [29], [30]. Inntil nylig var det lite data om hvorvidt lungekreftceller handle direkte på immunceller til å indusere hypermethylation av IFNg promoter. I vår forskning, den hypermethylation status i CD4
+ T-celler i lungecancerpasienter tyder på at tilstedeværelsen av kreftceller kan bidra til en endret uttrykk profil.
microenvironments spille en avgjørende rolle i tumorprogresjon hvor immun -resistente svulst varianter er valgt [31]. Tumor-avledet løselige faktorer tilskynde forskjellige mekanismer for å unngå immunangrep i tumoren mikromiljøet [32], [33]. I transwell dyrkning systemet brukes her, fant vi klare forskjeller i epigenetisk regulering av IFNg arrangøren mellom CD4
+ T-celler fra friske individer dyrket med og uten SPC-A1. Resultatet av IFNg arrangøren metylering av CpG nettsider demonstrert hypermethylation var lik den som ble observert i CD4
+ T celler av lungekreftpasienter (85,4% vs 85,4%), noe som genererte lavere nivåer av IFNg ved aktivering. Interessant, Janson et al hadde rapportert at tumor-infiltrerende CD4
+ T-celler ble feilaktig hypermethylated i kolon kreftpasienter [34].
SPC-A1 celler kan fungere på CD4
+ T celler friske frivillige for å indusere hypermethylation uten direkte kontakt, noe som tyder på tilstedeværelsen av en oppløselig, kontaktløs avhengig mikro-faktor (er). Studier har vist at DNA-metylering katalyseres av DNMTs, inkludert vedlikeholds metyltransferase DNMT1 som virker på hemi-metylerte substrater for å opprettholde metylering mønstre etter DNA-replikasjon [35], [36]. I tillegg er de novo metyltransferaser DNMT3a og DNMT3b som katalyserer metyleringen av unmethylated DNA [37], [38]. Endringer i ekspresjon DNMT korrelerer med endring i genomisk DNA-metylering, og er godt beskrevet i mange kreftformer [39] – [44]. Ved undersøkelse av DNMT uttrykk mønstre i vår modell, observerte vi en markert økning i DNMT1 og DNMT3b mRNA uttrykk i CD4
+ T-celler dyrket med SPC-A1 celler. Derfor spekulerte vi at løselige, Løse avhengige faktorer kan indusere hypermethylation av IFNg promoter ved å stimulere DNA metyltransferase aktivitet, som deretter downregulate IFNg sekresjon. Disse faktorer kan være cytokiner, nukleinsyrer, eller microRNAs utskilt eller oppebåret av lungekreftceller [45] – [47]. Imidlertid vil ytterligere forskning være nødvendig bekrefte denne hypotesen. Disse in vitro-resultater antyder at promoteren metylering kan påvirke IFNg ekspresjon i lungekreftpasienter. Metylering-mediert IFNg reduksjoner kan benytte tumor overlevelse og forskyve balansen av tumor immunitet mot tumorprogresjon.
Vi har tidligere vist at redusert ekspresjon av tumorsuppressorgener er assosiert med avvikende CpG øy metylering i genet promotorområdene i lunge kreftpasienter, og at uttrykket kan gjenopprettes ved demetylering [48]. Dette antydet at demetylering som formidles av 5-aza-dC kan tjene som en nyttig tilnærming for behandling av lungekreft [48] – [50]. Derfor behandling av lungekreft gjennom demetylering, noe som øker uttrykk ikke bare av tumorsuppressorgener, men også av cytokin gener som IFNg, bidra til å beskytte mot svulster.
I konklusjonen, IFNg promoter metylering er assosiert med redusert IFNg uttrykk i lungekreftpasienter. Samspillet mellom lungekreftceller og CD4
+ T-celler induserer hypermethylation av IFNg promoteren i CD4
+ T-celler, som fungerer som en mekanisme av tumor-indusert immunsuppresjon.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av komité for etikk Behandling av bilder av mennesker i First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University (Permit Number: 20A6-2869), og en skriftlig informert samtykke ble også hentet fra hver deltaker.
Valg av lungekreftpasienter og friske kontroller
lungekreftpasienter (N = 30) og friske voksne (N = 30) var fra første tilknyttet sykehuset Nanjing Medical University (Nanjing, Kina). Lungekreftpasienter ble diagnostisert som carcinoma av patologisk diagnose. Pasienter som fikk preoperativ kjemoterapi, strålebehandling eller operasjon før samle blodprøve hadde blitt ekskludert. De detaljerte kliniske data (inkludert alder, kjønn, røyking historie) ble innhentet fra hvert objekt medisinske poster og oppført i tabell 3. Blant lungekreftpasienter, var det 24 tilfeller av adenokarsinom, 2 tilfeller av plateepitel karsinom, 2 tilfeller av alveolar cellekreft og 2 tilfeller av dårlig differensiert karsinom.
Blood Prøvetaking og behandling
Veneblod (10 ml) med EDTA-K
2 ble samlet fra friske kontroller og lunge kreftpasienter før operasjonen. Plasma ble separert og lagret ved -70 ° C før måling av IFNg. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble separert ved Ficoll-Hypaque densitetsgradientsentrifugering (GE Health Care Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). CD4
+ T-celler ble isolert fra PBMC ved hjelp av en CD4-positive isolasjon kit (Dynal, Oslo, Norge). Renheten av isolerte CD4
+ T-celler ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av PE-konjugert anti-CD4 (Beckman, Marseille, Frankrike). CD4
+ T-celler ble deretter samlet inn for DNA-ekstraksjon, bisulfitt modifikasjon, og sekvensering.
Cellelinjer og kultur betingelser
Den menneskelige NSCLC cellelinje SPC-A1 ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Sciences i Shanghai, og dyrket i 5% CO
2 i RPMI 1640 med 2 mmol /L L-glutamin, 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), penicillin G (50 U /ml ), og streptomycin (50 ug /ml).
CD4
+ T-celler Co-dyrket i Transwell Dyrkingssystem
Transwell eksperimenter ble utført i 24 brønners plater med porestørrelse 0.4 um (Corning Costar, Corning, NY, USA). SPC-A1-celler (2 x 10
5) ble dyrket i de ytre brønnene av 24-brønners plater i 1640-medium supplementert med 10% humant AB-serum. CD4
+ T-celler (6 x 10
5) atskilt fra friske voksne ble tilsatt inn i de indre brønner i det samme medium. Som vist på fig. 3, kontrollgrupper ble etablert med CD4
+ T-celler som vokser i de indre løse brønner SPC-A1 celler. Etter 5 dagers dyrking, CD4
+ T-celler ble vasket, og 1 x 10
6-celler ble samlet opp for DNA-ekstraksjon, mens de resterende ble overført til 96-brønners kulturplater. 5 x 10
4 celler /brønn ble stimulert med 1 ug /ml løselig anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA, USA) og 1 ug /ml løselig anti-CD28 (eBioscience) (i et totalvolum på 200 ul) i 6 eller 24 timer. Etter stimulerende, ble supernatantene samlet for IFNg deteksjon av ELISA, CD4
+ T-celler ble samlet for IFNg mRNA-analyse.
ELISA
IFNg nivåene i kultursupernatantene og plasma ble bestemt ved ELISA (R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)., i henhold til produsentens protokoll
FACS Analyse
PBMC ble stimulert med PMA (10 ng /ml). Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 ug /ml og inkubert i 4 timer. PBMC Prøver ble tatt fra responderende kulturer og farget med en kombinasjon av fluorokromkonjugerte konjugert mAb som består av anti-CD8-PE-Cy5 og anti-CD3-FITC (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Etter fiksering og permeabilization (Fix Perm, Caltag, Buckingham, UK), ble cellene farget med anti-IFNg-PE og isotypiske mAbs (BD Pharmingen). Isotype-matchet kontrollantistoffer ble anvendt for å bestemme nivået av bakgrunnsfarging for mAb blanding. Alle hendelsene ble anskaffet ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Data ble analysert med CELL Quest Software (BD PharMingen).
RNA Isolation og kvantitativ real-time PCR
RNA isolering ble utført ved hjelp miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA) og revers transkribert ved hjelp av en PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, Tokyo, Japan) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble analysert for uttrykket av målgener og kvantifisert ved RT-PCR bruker SYBR Premiks Ex Taq ™ .Quantitative PCR ble utført på en ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-primere som ble anvendt var: IFN-γ-fram, 5′-GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG G-3 «; IFN-γ-revers 5»-TGT CTT CCT TGA TGG TCT CCA CAC-3 «; DNMT1 fremover, 5»-GAT CGA ATT CAT GCC GGC GCG TAC CGC CCC AG-3 «; DNMT1-revers, 5»-ATG GTG GTT TGC CTG GTG C-3 «; DNMT3b fremover, 5»-CCT GCT GAA TTA CTC ACG CCC C-3 «; DNMT3b-revers, 5»-GTC TGT GTA GTG CAC AGG AAA GCC-3 «; β-aktin-forward, 5»-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 «; β-aktin-revers, 5»-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3 «. Ct-verdier ble normalisert til uttrykk i CD4
+ T-celler ved hjelp av to
-ΔΔCt metode og β-actin som husholdningsgenet. Forsøkene ble gjort i tre eksemplarer, og resultater fra tre uavhengige eksperimenter ble i gjennomsnitt.
DNA Isolering og Metylering analyse
Metylering analyse ble utført med bisulfite sekvensering. Genomisk DNA fra CD4
+ T-celler ble isolert ved anvendelse av QIAamp Mini Kit (Qiagen) som anbefalt av produsenten. DNA ble bisulfitt omdannet ved hjelp av CpGenome ™ DNA modifikasjon Kit (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne anvendt for å amplifisere IFNg-promoteren var: IFNg-forover, 5′-TGT GAA TGA AGA GTT AAT ATT TTA TTA-3 «; IFNg-revers, 5»-TTG GTA GTA ATA GTT AAG AGA ATT TA-3 «[19]. PCR-produkter ble samlet ved hjelp av bisulfitt-behandlede DNA som templat.
Den mest fremtredende PCR-bånd ble separert på 2% agarose-gel-elektroforese, og renset ved gel-ekstraksjon (Qiagen), behandlet med TA kloning ved hjelp av DNA-tailing (Takara), og sekvensert på en ABI 3730 (Applied Biosystems). Alle operasjoner ble utført av GeneScript Corporation (en Sino-Amerika joint venture, Nanjing, Kina). Sekvensene ble analysert av bioinformatikk programvare Chromas Versjon 1.45 (Technelysium, South Brisbane, Australia).
Statistical Analysis
Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (IBM, Chicago, IL, USA). Uavhengige t-tester ble benyttet for å sammenligne plasmanivåer og IFNg intracellulære forskjeller mellom pasienter og friske kontroller. Dataene er oppsummert som gjennomsnitt ± SD. Metylering forskjeller i IFNg arrangøren mellom ulike grupper ble vurdert ved hjelp av en Pearson Chi-kvadrat test.
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Takk
Vi er takknemlige for den tekniske støtten fra National Key Klinisk Institutt for laboratoriemedisin i Jiangsu-provinsen Hospital.
