Abstract
Lungekreft er meget heterogent og er sammensatt av forskjellige undertyper som er i forskjellige differensialtrinn. De nylig identifiserte integrin-samspill proteiner Kindlin-en og Kindlin-2 er de aktivatorer av transmembrane reseptor griner som spiller viktige roller i kreft progresjon. I denne rapporten presenterer vi uttrykket profiler av Kindlin-en og Kindlin-2 i lunge kreft ved hjelp av pasientprøver og etablerte sin sammenheng med lungekreft progresjon. Vi fant at Kindlin-1 ble uttrykt i epitel-avledede ikke-små-celle lungekreft, særlig i squamous celle lungekreft, men uttrykt ved lave nivåer i dårlig differensiert stor cellelungecancer. Imidlertid Kindlin-2 ble sterkt uttrykt i stor celle lungekreft. Både Kindlin-1 og Kindlin-2 ble funnet ikke uttrykkes eller uttrykkes i meget lave nivåer i nevroendokrine-avledet småcellet lungekreft. Viktigere, den Kindlin-en uttrykksnivå var positivt korrelert med differensiering av plateepitelkreft lungekreft. Overraskende, fant vi at de aller homologe Kindlin familie proteiner, Kindlin-en og Kindlin-2, vises motvirke funksjonelle roller i lungekreftceller. Ektopisk uttrykk for Kindlin-en i ikke-småcellet lungekreft celler hemmes
in vitro
celle migrasjon og
in vivo
tumorvekst, mens Kindlin-2 fremmet disse funksjonene. Mekanistisk, Kindlin-en forbudt epithelail til mesenchymale overgang i ikke-småcellet lungekreft celler, mens Kindlin-2 forbedret epithelail å mesenchymale overgang i disse cellene. Til sammen viste vi at Kindlin-en og Kindlin-to forskjellig regulere lungekreft celle progresjon. Videre, kan uttrykket nivåer av Kindlin-1 kan potensielt benyttes som en markør for differensiering kreft lunge og målretting Kindlin-2 kan blokkere invasiv vekst av store celle lungekreft
relasjon:. Zhan J, Zhu X, Guo Y, Wang J, Wang Y, Qiang G, et al. (2012) Motsatt rolle Kindlin-en og Kindlin-2 i lunge kreft. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10,1371 /journal.pone.0050313
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 11 juli 2012; Godkjent: 18 oktober 2012; Publisert: 29.11.2012
Copyright: © 2012 Zhan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) -tasten prosjekt 30830048, Ministry of Science and Technology i Kina 2010CB912203 og 2010CB529402, NSFC31170711, den 111-prosjektet av departementet for utdanning og Beijing Natural Science Foundation 7120002 til HZ, og også av en bevilgning til Staffan Strömblad fra Center for biovitenskap ved Karolinska Institutet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er en komplisert sykdom som kan histologisk klassifisert i småcellet lungekreft (SCLC) som representerer nesten 20% av lungekreft, og hoveddelen er ikke-liten-celle lungekreft (NSCLC) som representerer mer enn 80% av lungekreft [1]. NSCLC omfatte plateepitelkarsinom (SCC), adenokarsinom (AC), og stor celle karsinom (LCC) [2]. Svært differensiert, moderat differensierte og dårlig differensierte karsinomer kan sees i SCC og AC. Lungekreft er ganske heterogene i tumorvekst, invasjon og metastase så vel som i resultatene etter behandling. Lungekreft i annen differensiering status vises avvik i malignitet, for eksempel lavt differensiert lungekarsinom er mer ondartet enn høye differensiert kreft, som er raskt voksende og svært metastatisk.
Fermitin familiemedlem 1 (FERMT1) koding Kindlin -1 er en FERM (4,1-ezrin-Radixin- Moesin) holdig protein som tilhører Kindlin familien. Kindlins er integrin- samvirkende proteiner som regulerer integrin-aktivering via interaksjon med integrin β-underenheten cytoplasmatiske domene [3], [4]. Kindlin-2 er kodet av FERMT2 ble funnet å styre en toveis signalering via integrin [5]. Kindlin ble utpekt fra Kindler syndrom som ble skapt i 1954 kjennetegnet av en kombinasjon av epidermal atrofi, utvidet kapillærer og marmorert hud pigmentering [6]. Mutasjoner av Kindlin-1 hadde blitt identifisert som årsak til Kindler-syndrom [7], [8]. Inntil nylig Kindlin familiemedlem har vært koblet til utviklingen av svulster [9]. Kindlin-2 er blitt vist å bli uttrykt i ondartet mesothelioma og regulerer adhesjon og migrasjon [10], og ekspresjonsnivået av Kindlin-2 er relatert til følsomheten av prostatacancerceller til cisplatin-indusert celledød [11]. Kindlin-2-ekspresjon ble funnet korrelert med tumorinvasjon, lymfeknutemetastase, og pasientens resultater i magekreft [12]. Kindlin-1 har blitt funnet overuttrykt i 60% av lungekreft og 70% av tykktarmskreft som undersøkes av RNA ekspresjonsnivåer av ti pasienter [9]. Ganske nylig, Sin et al viste at Kindlin-1 spiller en rolle i brystkreft vekst og lungemetastase [13]. I tillegg til ekspresjon i tumorceller, ble Kindlin-2 også funnet å være sterkt uttrykt i tumoren stroma i blærekreft [14]. Men mens Kindlin-en og Kindlin-2 er knyttet til kreft progresjon, Kindlin-3 er medvirkende i blodkreft lidelser [15] – [19]. Kindlin-2 uttrykkes i stor grad i endotel og vesikulær glatt muskulatur [3], [20], og er en essensiell komponent av interkalerte plater som er nødvendig for virveldyrhjerte struktur og funksjon [21]. Men så langt er lite kjent om rollene til Kindlin-en og Kindlin-2 i lungekreft progresjon.
I denne studien har vi som mål å svare på det første at hvis Kindlin-en og Kindlin-2 spiller en rolle i kreft progresjon lunge. På grunn av den høye heterogenecity for lungekreft vi ønsker også å svare på det hvis Kindlin-en og Kindlin-to forskjellig uttrykt i ulike typer lungekreft og funksjoner tydelig i lungekreftceller. For dette formål har vi undersøkt ekspresjon av Kindlin-1 og Kindlin-2 i et panel av lungekreft vevsprøver og vektlagt for å sammenligne de relative ekspresjonsnivå av Kindlin-1 og Kindlin-2 i den samme pasient. Forbløffende identifiserte vi en gjensidig rolle Kindlin-en og Kindlin-2 i reguleringen av tumorprogresjon hos både celler og dyr. Til sammen våre funn gi en ny forståelse av Kindlin-en og Kindlin-2 i kreft celle lunge progresjon og kan bidra til fremtidig drug design mot lunge kreftbehandling.
Materialer og metoder
Etikk
den etiske komiteen for Peking University Health Science Center har godkjent studien for museforsøk (Permit Number: LA2011-73). Den etiske komiteen for Sino-Japan Friendship Hospital har godkjent studien ved hjelp av lungekreft pasienten tumorvev for forskningsformål (Permit Number: ZRLW-5) .De prosedyrer for håndtering av mus og menneskelige materialer var i samsvar med den etiske standarden på Helsinki Erklæring fra 1975 og revidert i 1983.
ekspresjonsvektorer, cellekultur og stabil transfeksjon cellelinjer
Kindlin-en full-lengde cDNA ble klonet fra en human placenta cDNA bibliotek ved hjelp av primere: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (forover primer) og GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (revers primer). PCR-produktet ble klonet inn i pCRII-vektoren, og deretter ytterligere klonet inn i pCMV10-3 x Flag vektor (Sigma) ved anvendelse av Hindlll-EcoRI-setene. U1752, H1299, A549 og U1810 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC i USA eller Cell Collection Center of Peking Union Medical School i Kina og ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen) med 10% FBS og 50 mikrogram /ml gentamycin. Cellene ble dyrket i 75 cm
2 kulturflasker eller 60 mm-retter på 37 ° C i fuktighet med 5% (v /v) CO
2. Media ble endret hver to dager. For etablering av stabile kloner som uttrykte Kindlin-en og Kindlin-to hver for seg, ble H1299 celler transfektert med flagg-Kindlin-en, flagg-Kindlin-2 og tom vektor hjelp Lipofectamine. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene passeres og G418 ble tilsatt til endelig konsentrasjon på 1200 ug /ml. Enkelt kloner som uttrykte Kindlin-en eller Kindlin-2 ble slått sammen for å unngå klonale effekter. Sammenslåtte celler som uttrykker Kindlin-en eller Kindlin-2 ble brukt for funksjonelle studier som angitt i teksten.
tumorvev
Lungekreft vevsprøver ble oppnådd fra Department of Thoracic Surgery Sino-Japan Friendship Hospital, Beijing Kina, og ble seksjonert ved Avdeling for patologi Health Science Center Peking University, Beijing Kina. Blant de 140 tumorvev seksjoner som ble brukt for immunhistokjemiske analyser, 65 er SCC, 43 er AC, 12 er LCC og 20 er SCLC (tabell 1). Alle disse prøvene ble utsatt for Kindlin-1 og Kindlin-2-farging. I tillegg 7 friske lungekreft vev med sammenkoblede kreft omegn vev inkluderer tre SCC, 3 AC og en LCLC. Disse vev ble anvendt for å ekstrahere mRNA for qPCR påvisning av Kindlin-1-ekspresjon.
Western blot-analyse
PBSTDS lysis buffer med tilstedeværelsen av protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH,) ble brukt til å ekstrahere de totale cellelysatene. 80% av cellelysatene ble tilsatt til 20% av 5 x SDS applikasjonsbuffer, deretter oppløses ved 10% SDS-PAGE-gel og blottet på PVDF-membraner (porestørrelse 0,45 pm). De primære antistoffer anti-Kindlin-1 mus monoklonalt antistoff (1:500 fortynning, Clone 4A5.14, Milipore, USA), anti-Kindlin-2 mus monoklonalt antistoff (1:1000 fortynning, Clone 3A3, Milipore, USA), anti -Vimentin kanin monoklonalt antistoff (1: 2000 fortynning, Epitomics, USA), anti-Ecadherin kanin monoklonalt antistoff (1: 3000 fortynning, Epitomics, USA), anti-N-caherin kanin monoklonalt antistoff (1: 10000 fortynning, Epitomics, USA ), anti-Flag-monoklonalt antistoff (1:10000 fortynning; Klon M2, Sigma, USA) og anti-β-actin mus monoklonalt antistoff (1:1000 fortynning; Klon C4, Santa Cruz, USA) ble inkubert med membranene separat etter rotasjon. Etter grundig vasking ble membranene inkubert med tilsvarende sekundære antistoffer som gjenkjenner enten kanin eller muse-Ig (Jackson Laboratories, USA). Til slutt ble båndene visualisert ved den forbedrede kemoluminescens (Pierce).
Kvantitativ PCR
Kvantitativ PCR (qPCR) analyser ble utført for å påvise ekspresjon av Kindlin-1 mRNA i lunge tumorvev. I korte trekk, ble de normale vev og lungetumor totale mRNA isolert ved Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og 2 mikrogram av total RNA ble revers transkribert ved bruk av M-MLV revers transkriptase (Promega, CA, USA). Deretter PCR ble utført med Taq PCR MasterMix (TIANGEN, Kina) med innstillingene som: 94 ° C 2 min; 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek, for 30 sykluser; 72 ° C 5 min. Primersekvensene var som følger: for menneskelig Kindlin-en, fremover: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, omvendt: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT; for aktin, fremover: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, omvendt: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. PCR-produktene ble analysert ved 2,5% agarosegelelektroforese i nærvær av etidiumbromid for visualisering. Kvantitativ PCR ble også anvendt for å identifisere endringer av MMP’er mRNA nivået indusert av Kindlin-1 og Kindlin-2 i cellelinje H1299. MMP-2 frem: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, omvendt: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC; MMP-7 fremover: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC; omvendt: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT; MMP-9 fremover: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA; omvendt: ATTTCGACTCTCCACGCATC. Relative gangers endring i qPCR ble bestemt ved den metode ΔΔCt.
cellemotilitet analyser
Transwell kamre (Costar) med 8 um porestørrelse ble brukt til å utføre cellemigrering analysen. Først ble Collagen type I brukes til å belegge den nedre overflate av Transwell membraner i 1 time ved romtemperatur. Deretter, H1299-celler stabilt transfektert med Flag-BAP (bakteriell alkalisk fosfatase), Flagg-Kindlin-1 og Flag-Kindlin-2 ble sådd ut på den øvre overflate av Transwell. Etter 6 timers inkubering i migreringsbuffer (RPMI 1640, 2 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 0.2 mM MnCl
2, og 0,5% BSA) ved 37 ° C i fuktig 5% CO
2, ble Transwell membranene fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter og farget med krystallfiolett i 10 min. Endelig ble 6 mikroskopiske felt tilfeldig valgt for å telle de migrerte celler.
For celle sårheling eksperiment, 48 timer etter transfeksjon monolagcellene var riper ved hjelp av en standard 100 mL pipette tips. De sårede monolagene ble vasket to ganger for å fjerne ikke-heftende celler med 0,1 M PBS (pH 7,2). Tolv timer senere såret ble observert med en 20 x objektiv (Nikon, Japan) og målt for bredden av celle sår. Seks mikroskopiske felt for hver tallerken ble observert og fotografert.
Immunohistochemistry (IHC)
lungetumoren lysbilder hentet fra Sino-Japan Friendship Hospital var alle formalinfiksert og paraffinembeded. Deparaffinization og hydrering ble utført og fulgt ved å avskaffe endogen peroksydase-aktivitet ved anvendelse av 0,3% hydrogenperoksyd i 30 min og mikrobølgeovn for antigen gjenfinning i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) i 20 min. Vi brukte polyklonalt anti-Kindlin-1 (PKU Animal Facility) antistoff affinitets-renset ved 2 ug /ml og monoklonale anti-Kindlin-2 (Milipore, USA) ved 2 ug /ml for å utføre disse eksperimentene. Det primære antistoff ble anvendt ved 4 ° C over natten. Deretter PV9000 2-trinns pluss Poly-HRP Anti-mus /kanin IgG Detection System (Zhong Shan Jin Qiao) ble brukt. Den streptavidin-biotin- peroksidase metoden ble brukt for deteksjon og diaminobenzidine ble søkt om underlaget (ChemMate Detection Kit, DAKO). Hematoxylin ble brukt for counterstain. Negative kontroller ble utført ved å utelate bruk av primære antistoffet.
Evaluering av immunhistokjemi
To uavhengige patologer evaluert alle immunostainings og en konsensus begrunnelse basert på diskusjonen ble registrert. Vurderingen ble klassifisert i 4 karakterer: ingen reaktivitet merket som 0, svak reaktivitet som 1+, moderat reaktivitet som 2+, og sterk reaktivitet som 3+
In vivo
xenograft tumorvekst. eksperimentere
Balb /c nakne mus ble implantert subkutant i flanken med 1 × 10
6 celler som er stabilt overekspresjon Kindlin-en, Kindlin-2 og kontroll vektor separat. Tumorer ble målt for deres størrelser i atten dager, og fortsette å spille inn i den angitte tid. Mus ble avlivet ved hjelp av eutanasi når tumorvekst på 1 cm i diameter. Svulster ble tatt ut og veid.
Statistisk analyse
Statistiske analyser for pasientmateriale ble utført med Kruskal-Wallis test og Statistiske analyser for parede prøver ansatt Student t-test. Alle statistiske analyser ble SPSS version14.0. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant på nivå med
P
. 0,05
Resultatene
Kindlin-en er uttrykt i normalt lungevev og ulike undergrupper av lungekreft
Kindlin-1 uttrykk i lungekreft er foreløpig foreslått
9,13. Imidlertid er ingenting kjent i detalj for Kindlin-1 uttrykk i ulike undergrupper av lungekreftpasienter. For å forstå den mulige involement av Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekreft progresjon, vi først undersøkt ekspresjon av Kindlin-1 i lungekreftpasient vev ved hjelp av immnohistochemistry (IHC) med et affinitetsrenset polyklonalt Kindlin-1-antistoff, med normal lunge-vev som kontroll. Vi fant at Kindlin-en var ikke påvisbar i normale lunge alveolene og svakt signal i normale lungeblodkarene ble observert (fig. 1a-A). Interessant, Kindlin-1 ble funnet høyt uttrykt i cytoplasma og kjerner av kjegleformede celler og spindel-celler fordelt i søyle epithelia (Fig. 1a-b). Imidlertid Kindlin-1 ble funnet svakt uttrykt i colummar celler, slimceller og ikke til uttrykk i kjelleren memberane. I lunge tumorvevet, ble Kindlin-1 funnet høyt uttrykt i cytoplasma og membranen av SCC (Fig. 1a-C). Videre Kindlin-1 ble funnet moderat uttrykt i cytoplasma av tumorkjertel epitel i AC (fig. 1a-D) og svakt uttrykt i LCC (Fig. 1a-E). Overraskende ble det ikke observert noen ekspresjon av Kindlin-en i det hele tatt i SCLC (Fig. 1a-F) (tabell 2).
a. Kindlin-1 uttrykk i vev fra normale og ulike undergrupper av lungekreft undersøkt av IHC. Bildene i presentasjonen er normal lunge (A), Pseudo-stratifisert ciliated søyle epitel (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), og SCLC (F). b. Bestemmelse av mRNA-nivåene av Kindlin-1 i de ferske kliniske prøver målt ved qPCR. c. Re-analyser av Kindlin-1 uttrykk i Oncomine database. Venstre: Kindlin-1 uttrykk hentet i Hou lunge datasett; Høyre: Kindlin-1 uttrykk hentet i Garber lunge datasett. Statistiske analyser mellom ulike pasientgrupper ble undersøkt av Student
t
test. ** Representerer for
p
. 0,01
Videre undersøkte vi Kindlin-1 mRNA uttrykk selv nylaget tumorvev fra SCC, AC og SCLC av lunge kreftpasienter. Vi fant ut at SCC viste høyere Kindlin-1 uttrykk enn AC, og SCLC vises den laveste uttrykk for Kindlin-en mellom ulike typer av lungekreftpasienter undersøkt (Fig. 1b).
oppmuntrende ovennevnte Kindlin -1 uttrykk profil som bestemmes enten ved immunhistokjemi eller qPCR ble videre støttet av re-analizing Kindlin-1 mRNA uttrykk profil i pasientens datasett fra Oncomine Database (www.oncomine.com). Etter å ha analysert kreft pasientens Hou og Garber lunge Affymetrix datasett, fant vi at Kindlin-1 uttrykk i ulike typer NSCLC på mRNA-nivået ble significanly økt (Fig. 1c), som er i overensstemmelse med de ovennevnte IHC resultater. Disse data tyder på at Kindlin-1 er faktisk svært expessed i SCC ved undersøkelse av ulike pasient co-Horts.
Kindlin-1 uttrykk er korrelert med celledifferensiering i SCC, men ikke i AC
Nevnte funnene viste at selv innenfor SCC, er heterogen Kindlin-1 uttrykk. Dette tyder på at Kindlin-1 uttrykk kan variere med endring av celledifferensiering i lungekreft. For å oppnå dette, analyserte vi Kindlin-1-ekspresjon i SCC med ulike stadier av celledifferensiering. Interessant nok har vi funnet at Kindlin-1 er sterkt uttrykt i brønnen differensiert SCC enn den moderat differensierte SCC (figur 2-A og -B.); og den moderat differensierte SCC uttrykte høyere Kindlin-1 enn den dårlig differensiert SCC (fig. 2-B og C). Men denne tendensen av Kindlin-1 uttrykk funnet i SCC var ikke aktuelt for AC (data ikke vist). Tatt sammen indikerer disse data at jo høyere differensieringstrinn svarer til den høyere ekspresjon av Kindlin-1 i SCC (tabell 2).
Representative bilder som gjenspeiler Kindlin-1-ekspresjon i SCC er blitt valgt, og statistiske analyser kan bli funnet i tabell 2. A, godt differensiert SCC. B, moderat differensiert SCC. C, dårlig differensiert SCC.
Kindlin-en og Kindlin-2 er uttrykt forskjellig i ulike undergrupper av lungekreft
Til nå er det ingen rapport om Kindlin-2 uttrykk i lunge kreft cellelinjer så vel som i lungekreftpasienter. Det er av interesse å vite om både Kindlin-en og Kindlin-2 er uttrykt i lungekreftpasienter. For å oppnå dette, undersøkte vi den Kindlin-2-ekspresjon i det samme panel av pasientprøver nevnte. Mens Kindlin-2 ble funnet uttrykt i blodkarene i de normale lunge vev (fig. 3a-A), Kindlin-2 ble funnet sterkt uttrykt i cytoplasma og kjerner av kjegleformede celler (Fig. 3a-b) tilsvarende til den Kindlin-en farging som vist i fig. 1a-B. Dette indikerer at både Kindlin-1 og Kindlin-2 er uttrykt i normal bronkiene epithilium. Interessant er Kindlin-2 ekspresjon mønster ganske forskjellig fra den til Kindlin-1 i SCC. I stedet for å uttrykt i SCC og AC, ble Kindlin-2 funnet hihgly uttrykt i tumor stroma (fig. 3a-C og D), som kontrast kraftig til uttrykk mønster av Kindlin-1 i disse typene av lungekreft. Videre Kindlin-2 ble funnet sterkt uttrykt i LCC på cellemembranen og den omgivende tumor stroma i forhold til svak ekspresjon av Kindlin-1 i LCC (fig. 3a-E). I tillegg har lav eller ingen positiv farging av Kindlin-2 ble observert i SCLC (fig. 3a-F), som er lik den Kindlin-en farging i den samme celletype (fig. 1a-F). Disse IHC resultater ble ytterligere styrket ved re-analyser av Kindlin-2 mRNA uttrykk i Oncomine databaser Hou lunge og Garber lunge (Fig. 3b). I serien av SCC pasientens vevssnitt ble Kindlin-en sterkt uttrykt i tumorcellene, mens Kindlin-2 ble funnet uttrykt hovedsakelig i tumor stroma (fig. 3c-A, -B). Disse observasjonene indikerer at Kindlin-en og Kindlin-2 er forskjellig uttrykt i lunge kreftceller.
a. Kindlin-2 uttrykk i vev fra normale og lungekreft vev undersøkt av IHC. Bildene i presentasjonen er normal lunge (A), Pseudo-stratifisert ciliated søyle epitel (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), og SCLC (F). b. Re-analyser av Kindlin-2 uttrykk i Oncomine database. Venstre: Kindlin-2 uttrykk hentet fra Hou lunge datasett; Høyre: Kindlin-2 uttrykk hentet fra Garber lunge datasett. Statistiske analyser mellom ulike pasientgrupper ble undersøkt av Student
t
test. ** Representerer for
p
0,01. c. Sammenligning av de uttrykk for Kindlin-en og Kindlin-2 i SCC fra samme pasient. Som vist Kindlin-2 er høyt uttrykt i tumor stroma, men ikke i lungecancerceller.
Tabell 2 oppsummert ekspresjon av Kindlin-1 og Kindlin-2 i tumorer av forskjellige lungekreftpasienter. Kindlin-1 uttrykk var positiv i 84% av lungekreftpasienter. For de ulike kreft subtyper, både Kindlin-en og Kindlin-2 viste høy positiv rate i NSCLC enn i SCLC (
p
0,0001). Interessant, innen NSCLC Kindlin-en uttrykkes ved lave nivåer i LCC, moderat i AC, og det høyeste uttrykk for Kindlin-1was funnet i SCC (
p
0,0001). Imidlertid har Kindlin-to gjensidig uttrykk profil: uttrykket nivået av Kindlin-2 er lav i SCC, moderat i AC og det høyeste uttrykk for Kindlin-2 ble observert i LCC (
p
0,0001) . Intriguingly ble Kindlin-1-ekspresjon funnet korrelert med differensiering av tumorer. SCC, bestående av plateepitel epitel, og AC består av kjertler epitel ble stilt høyere Kindlin-1 uttrykk enn LCC som er klassifisert som udifferensiert karsinom (
p
0,0001). Videre har godt differensiert SCC et høyere Kindlin-1 uttrykk enn dårlig differensiert SCC (
p
= 0,0024). Til sammenligning ble ingen sammenheng identifisert for Kindlin-1 uttrykk med differensiering for AC (
p
= 0,8523). Tilsvarende Kindlin-2 uttrykk ble ikke funnet å være korrelert med differensiering av ulike undergrupper av lungekreft (
p
= 0,1759).
Kindlin-en og Kindlin-to motsatt regulere lungekreft celle progresjon
in vitro
Gitt at Kindlin-en og Kindlin-2 er forskjellig uttrykt i lungekreftceller, er det fristende å forstå om Kindlin-en og Kindlin-2 også fungere forskjellig til regulere lungekreft celle progresjon. Vi har tidligere funnet at Kindlin-2 ble sterkt uttrykt ved tumor invasiv foran i ondartet mesothelioma [10]. For å oppnå dette, undersøkte vi uttrykket av Kindlin-en og Kindlin-2 i
de novo
SCC som er lokalisert på de sekundære områdene fra intra-lunge formidling av en SCC pasient. Som vist på fig. 4a-A, Kindlin-1 ble sterkt uttrykt ved tumormassen av
de novo
SCC men svakt uttrykt i tumor invasiv foran. Imidlertid er Kindlin-en farging konsentrert i kjernen av cellene ved tumor invasiv foran
de novo
SCC, noe som tyder på en cytoplasma til kjernen overgang kan eksistere for Kindlin-1 (Fig. 4a-A.Arrowed) . I motsetning til dette ble Kindlin-2 ikke ble funnet uttrykt i lignende type struktur fra den samme pasient (fig. 4a.B). Interessant, et cytoplasma til kjernen overgang fra Kindlin-2 ble også funnet på svulsten invasiv foran (fig. 4a-B.Arrowed). Til sammen tyder disse data på at Kindlin-1, men ikke Kindlin-2 er involvert i reguleringen av lungekreft cellekolonisering i SCC. Derfor fortsatte vi å karakterisere differensial rollen Kindlin-en og Kindlin-2 i reguleringen av lungekreft progresjon. Vi først oppdaget uttrykk for Kindlin-en og Kindlin-2 samt epitelial til mesenchymale overgang (EMT) markører E-cadherin og vimentin i lungekreftcellelinjer avledet fra SCC, AC og LCC og fant at Kindlin-en og Kindlin- 2 ble uttrykt forskjellig i lungecancercellelinjer (fig. 4B). Vi etablerte H1299 celler som stabilt overuttrykt Kindlin-en. Vi fant at EMT markører N-cadherin og vimentin ble nedregulert i lungekreft H1299-celler som stabilt overuttrykk Kindlin-1 sammenlignet med kontrollceller som uttrykker Flag-BAP (fig. 4c), noe som antyder en rolle Kindlin-1 i inhibering av EMT program i lunge adenokarsinom celler. Videre, for å granske differensial rollen Kindlin-1 og Kindlin-2 i regulering av lungekreft celle motilitet, utførte vi den hepatotactic migrasjonsanalysen på type I kollagen som medierer β1 integrin-relaterte cellemigrering. Vi fant at Kindlin-1 hemmet mens Kindlin-2-promo H1299 cellemigrering i et Transwell-analyse (Fig. 4d). Imens tydelig rolle Kindlin-en og Kindlin-2 i regulering av lungekreft celle invasjon ble undersøkt ved å bestemme uttrykket av metalloprotenases inkludert MMP7, MMP9 og MMP13. MMP7 og MMP9 ble funnet å bli nedregulert ved ektopisk ekspresjon av Kindlin-1, mens MMP7 og MMP13 ble oppregulert ved ektopisk ekspresjon av Kindlin-2 (fig. 4e). I en transient transfeksjon, overekspresjon av Kindlin-en førte til nedregulering av N-cadherin (Fig. 4f venstre panel), noe som tyder på en hemmende rolle Kindlin-en på EMT forekomst. Imidlertid knockdown av endogent Kindlin-2 sank nivået N-cadherin (fig. 4f venstre panel), en effekt som er ekvivalent med overekspresjon av Kindlin-1. Videre har vi undersøkt uttrykket nivåer av Kindlin-2 i grunn LCC, og fant at Kindlin-2 ble sterkt uttrykt i lymfeknutene spredning LCC (fig. 4g-B, se pilen) sammenlignet med den primære svulsten fra den samme pasient ( fig. 4g-A). Denne oppdagelse indikerte at høy grad av Kindlin-2-ekspresjon kan svare til et høyt potensial av LCC invasjon. Samlet utgjør disse data indikerte at differensial uttrykk for Kindlin-en og Kindlin-2 i lungekreftpasienter tilsvarer en motsatt forskrift om cellemigrasjon samt på celle invasiv evne.
a. Uttrykk for Kindlin-en og Kindlin-2 i den sekundære
de novo
SCC fra en invasiv SCC pasient. A. Kindlin-1 uttrykk i
de novo
SCC. B. Kindlin-2 uttrykk i
de novo
SCC fra samme pasient som i A. b. Venstre panel: Differential uttrykk for Kindlin-en, Kindlin-2, E-cadherin og vimentin i ulike lungekreftcellelinjer kontrollert av aktin for lasting. Høyre panel: Kvantifisering av de relative protein uttrykk nivåer. c. Venstre panel: Stabil uttrykk for Kindlin-en i H1299 celler. Indikert blandes stabile kloner som uttrykker Flag-Kindlin-en. Høyre panel: Kvantifisering av de relative proteinnivåer for Kindlin-en regulert N-cadherin og vimentin. d. Kindlin-en og Kindlin-to forskjellig regulere migrasjon i H1299 celler. Vises er kvantifisering og plottet som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. Statistiske analyser mellom ulike cellegrupper ble undersøkt av Student
t
test. ** Representerer for
p
0,01. e. Kindlin-en og Kindlin-to forskjellig regulere mRNA nivåer av MMP analysert ved qPCR i H1299-celler som stabilt uttrykker Kindlin-en og Kindlin-2. Sett viser uttrykk for Kindlin-en og Kindlin-2 i de stabile blandede kloner anvendt i qPCR. f. Venstre paneler: Uttrykk for Kindlin-en nedregulerer N-cadherin og knockdown av Kindlin-2 nedregulerer N-cadherin. Høyre paneler: Kvantifisering av de relative proteinnivåer for Kindlin-1- og Kindlin-to-regulert N-cadherin. Statistiske analyser mellom ulike cellegrupper ble undersøkt av Student
t
test. ** Representerer for
p
0,01. g. Uttrykk for Kindlin-2 i lymfeknute spredning stor kreftpasient celle lunge. A. Primær stor celle lungekreft; B. Lymfeknute spredning stor celle lungekreft fra samme pasient.
Kindlin-en og Kindlin-to motsatt regulere lungekreft cellevekst i en
in vivo
mus xenograft modell
Basert på ovennevnte funn at Kindlin-en og Kindlin-2 ble uttrykt forskjellig i lungekreft pasientprøver, og motsatt regulert lungekreft cellemigrasjon
in vitro
, var vi ivrige etter å vite om Kindlin -1 og Kindlin-2 spiller en tydelig rolle i reguleringen av tumorvekst
in vivo
. For dette formål, er mus tumorxenografter med Kindlin-1 overekspresjon vokste langsommere og størrelsene av tumorer var mindre enn den til kontrollgruppen (Fig. 5a og b). Imidlertid tumorer med Kindlin-2 overekspresjon vokste mye raskere og størrelsene av tumorer var mye større enn den til kontrollgruppen (Fig. 5a og b). Interessant, tumorvev utvinnes fra muse xenografter vises også økt N-cadherin og vimentin uttrykk i Kindlin-2 overekspresjon svulster, med noen endringer for N-cadherin og vimentin i Kindlin-en overuttrykt eller kontroll svulster (Fig. 5c). Disse dataene viste tydelig at Kindlin-en og Kindlin-2 ikke bare motsatt regulert tumorvekst, men også svulsten invasiv potensial i
in vivo
mus xenograft modell.
a. Tumor vekstkurve. Svulsten volum H1299-Flag-Kindlin-en gruppe er betydelig mindre enn Flag-BAP gruppe (
p
0,01 som analyseres av Student
t
test) på dag 22 og i mellomtiden volumet av Flag-Kindlin-2 gruppen er åpenbart større enn Flag-BAP gruppe (
p
0,01 som analyseres av Student
t
test). b. Svulster utvinnes fra mus på dag 27. c. Venstre panel: Bestemmelse av uttrykk for N-cadherin og vimentin fra tumorxenotransplantater stabilt uttrykker Kindlin-en, Kindlin-2 og kontroll BAP ved Western blot analyser. Høyre panel: Kvantifisering av de relative proteinnivåer for Kindlin-1- og Kindlin-to-regulert N-cadherin og vimentin. Statistiske analyser mellom ulike svulst grupper ble undersøkt av Student
t
test.
