Abstract
Zoledronsyre, en svært potent nitrogenholdig bisfosfonat som brukes til behandling av patologisk bentap, utskilles umetabolisert via nyrene hvis ikke bundet til benet. I kreft pasienter som får høye doser av forbindelsen renal ekskresjon kan være assosiert med akutt tubulær nekrose. Spørsmålet om hvordan zoledronsyre internalisert av tubulære celler har ikke blitt besvart før nå. I dagens arbeid, ved hjelp av en primær human rørformet cellekultursystem, ble banen til cellulært opptak av zoledronsyre (fluorescens /radiomerket) og dets cytotoksisitet undersøkt. Tidligere studier i vårt laboratorium har vist at denne primære cellekulturmodell gående etterligner de fysiologiske egenskapene til molekyl opptak /transport av epitelet
in vivo
. Zoledronsyre ble funnet å bli tatt opp av rørformede celler via væskefase-endocytose (fra apikal og basolateral side) som vist ved dets ko-lokalisering med dekstran. Cellulært opptak og den resulterende intracellulære nivået var dobbelt så høy fra den apikale side i forhold til den basolateral side. Videre ble det intracellulære zoledronsyre nivå funnet å være avhengig av den administrerte konsentrasjon og ikke mettet. Cytotoksiske effektene ble imidlertid bare sett ved høyere administrasjons doser og /eller etter lengre inkubasjonstider. Selv om zoledronsyre tas opp av rørformede celler, kunne ingen netto rørformet transport måles. Det konkluderes med at væske-fase-endocytose av zoledronsyre og cellulær akkumulering ved høye doser kan være ansvarlig for akutt tubulær nekrose observert hos noen kreftpasienter som får høye doser av det sammensatte
Citation. Verhulst A, Sun S, McKenna CE, D’haese PC (2015) Endocytotic Opptak av zoledronsyre ved Tubular Cells kan forklare dens innvirkning på nyrene hos kreftpasienter får høye doser av det sammensatte. PLoS ONE 10 (3): e0121861. doi: 10,1371 /journal.pone.0121861
Academic Redaktør: Franziska Theilig, anatomi, SVEITS
mottatt: 28 august 2014; Godkjent: 16 februar 2015; Publisert: 10 mars 2015
Copyright: © 2015 Verhulst et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. aV er postdoktor av fondet for Scientific Research Flandern (www.fwo.be). PD fikk et forskningsstipend fra Novartis. Ansatte i Novartis har lest manuskriptet og ga tillatelse til publisering av data, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Dette arbeidet var finansiert av en forskningsbevilgning fra Novartis. SS er Chief Operating Officer i BioVinc LLC start fra 1. januar er 2014. CMK grunnleggelsen medlem og leder av den vitenskapelige styret i BioVinc LLC og eier et patent US8431714 B2 lisensiert til BioVinc, LLC. US8431714 B2 lisensiert til BioVinc, LLC. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne
Innledning
Zoledronsyre eller zoledronate (Zometa,. Novartis Pharma AG , Basel, Sveits) er en tredje generasjon, meget potent nitrogen (N) -inneholdende bisfosfonat som har vist seg gunstige effekter ved behandling av sykelig hyperkalsemi og skjelettmetastaser hos pasienter med multippelt myelom, lunge, bryst og prostatacancer [1- 3].
N-inneholdende bisfosfonater, inkludert zoledronsyre, alle viser en høy affinitet for det bein hydroksyapatitt (HAP). Derfor er disse stoffene, når sirkulerer i blodet kammeret, hurtig bindes til benvev, (± 60% av den administrerte dose av zoledronsyre holdes i benet) [4] og er antagelig frigjøres fra den under prosessen av benresorpsjon. Når absorbert inn i den beinmineraler er N-inneholdende bisfosfonater internaliseres via fluidfase endocytose av osteoklast hvor de antas å hemme farnesyl-difosfat syntase, er isoprenoid biosyntetiske enzym i reaksjonsveien kolesterolbiosyntese [5]. Forstyrrelse av en gren passasje i kolesterolbiosyntesen sti dvs. isoprenylation resulterer da i den farmakologiske aktivitet av N-inneholdende bisfosfonater [6]. Isoprenylation innebærer kovalent binding av farnesyl difosfat eller geranylgeranyl difosfat til karboksyterminal av regulatoriske proteiner, inkludert de små GTPases Ras, Rac, Rho og Cdc42. De tre sistnevnte, så vel som mange andre, er geranylgeranylated og spille en hastighetsbegrensende rolle i resorptive aktivitet av osteoklaster [7-9].
Zoledronsyre ikke bundet til mineralisert bein utskilles, umetabolisert av nyre, hovedsakelig i løpet av de første timene etter administrering [4, 10]. Kreftpasienter ofte får en månedlig dose på 4 mg zoledronsyre tilført intravenøst i 100 ml væske i løpet av 15 minutter. I noen av disse pasientene renal utskillelse av høye sirkulerende mengder kan være forbundet med akutt tubulær nekrose, karakterisert ved at rørcellen degenerasjon, tap av børstegrense, og apoptose [11]. En sammenheng mellom toppnivåer av zoledronsyre i blodet og nyretoksisitet siden nyreskade avtar når dosen reduseres eller infusjonen tiden forlenges [1]. Videre at nyretoksisitet er ikke observert hos postmenopausale kvinner som får bare en årlig dose på 5 mg zoledronsyre under behandling av osteoporose er i tråd herved [12].
Det er ennå ikke forstått av hvilken vei zoledronsyre er tatt opp av nyrenes tubulære celler. På den annen side er det kjent at graden ved hvilken zoledronsyre og andre N-inneholdende bisfosfonater blir tatt opp av forskjellige celletyper som er proporsjonal med deres kapasitet for fluidfase endocytose [13-15]. Videre er det også mulig at zoledronsyre bruker veiene som transcellulær transport organisk anion som er involvert i den renale utskillelse av mange andre medikamenter [16-18].
En cellekultur system av primære humane nyreceller rørformede har blitt utviklet i vårt laboratorium. In vitro-modellen ble preget mye både på det fysiologiske og patofysiologiske nivå og bevis ble presentert for disse kulturene å konsekvent etterligne de viktigste fysiologiske egenskaper molekylær opptak /transport av rør epitel
in vivo product: [19-23 ]. Som tidligere beskrevet, er disse kulturene viser både i væskefase og reseptor-mediert endocytotic opptak av molekylene [22, 24]. I tillegg har de full kapasitet av kontrollert transport av molekyler, både anioniske og kationiske transporter molekyler over Epitel [18] som de uttrykker en bred palett av transportører på mRNA og protein nivå. På det funksjonelle nivå, de primære humane rørformede cellemonolag beholde det nødvendige maskineri for å formidle den netto sekresjon av det prototypiske substrater, dvs. det organiske kation, para-amino- hippursyre (PAH), og det organiske anion kreatinin.
for bedre å forstå den observerte nyretoksisitet av zoledronsyre, målet med denne studien var å undersøke mulige opptaksveier og farmakologisk behandling av zoledronsyre ved tubulære epitelceller ved hjelp av den ovenfor beskrevne primære humane cellekultur modell.
Materialer og metoder
Primære menneskelige rørformet nyrecellekulturer
menneske~~POS=TRUNC tubulære epitelceller ble isolert fra normal menneskelig nyre vev som ble tilgjengelig gjennom nephrectomy utført på onkologisk indikasjon. Bruken av dette vevet i den hensikt cellekultur ble godkjent (P2013 /268) av den etiske komiteen av Erasme Hospital (Brussel, Belgia) som er involvert i vev samling. Skriftlig informert samtykke ble innhentet. Makroskopisk normalt vev ble oppsamlet og behandlet på en steril måte. Cortex og ytre stripe av ytre marg ble dissekert, Decapsulated og skåret i biter på ca 1 mm
3. Etterpå vevet fragmenter ble spaltet i kollagenase D-løsning (Roche, Ottweiler, Tyskland) i løpet av 2 timer ved 37 ° C, under kraftig rysting, og siktet gjennom en sil 120μm. Den resulterende cellesuspensjon ble anbragt på toppen av en diskontinuerlig Percoll (GE Healthcare, Zaventem, Belgia) gradient med densiteter på 1,04 og 1,07 g /ml. Etter sentrifugering (25 min, 1620 RCF), ble celler fra krysset forsiktig suget, vasket og brakt inn kultur som en blandet befolkning av proksimale tubulære, distal rørformet og samlekanal celler. Tubulære celler ble dyrket til konfluens (10 til 14 dager) på gjennomtrengelige, polykarbonat filter bærere (Costar, Corning, NY, USA) ved en tetthet på 50.000 celler /filter, i a-MEM (Life Technologies, Gent, Belgia), modifisert i henhold Gibson d’Ambrosio [25] supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). Cellekulturer dyrket på 6.5 mm permeable (0.4μm porestørrelse), filtrer støtter (Costar) får lov til å polarisere og ha en adskilt apikal og basolateral rommet.
For å unngå bruk av utett (ikke-sammenflytende) kulturer, sammenløpet av cellekulturer ble bestemt ved å måle motstanden transepitelial (TER) av monolagene. Monolag ble ikke brukt for videre eksperimenter hvis transepitelial motstand av monolaget, korrigert for motstanden i filteret, var mindre enn 55 Ω.cm
2 ( 2xSD under den midlere TER ved starten av forsøkene). TER ble målt ved hjelp av en epitelial voltohmmeter utstyrt med en STX2 elektrode (World presisjonsinstrumenter, Hitchin, UK). FCS holdig medium ble erstattet med serumfritt medium eller Krebs løsning før forsøkene beskrevet i følgende avsnitt
Målinger av celle levedyktighet /mono integritet
TER ble målt før og etter en 2t inkubasjonstiden med forskjellige zoledronsyre konsentrasjoner (0, 0,1, 1, 10 og 100 uM). Celleviabilitet ble deretter evaluert ved hjelp av en MTT baserte analysen (Lett for deg, Biomedica Gruppe, Wien, Østerrike), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellelevedyktigheten ble også registrert 4, 24 og 48 timer etter 2h inkubasjonsperioden med forskjellige zoledronsyre doser (0, 1, 5 og 100 um), og etter 4, 24 og 48 timer inkubering med zoledronsyre (0, 1, 5 og 100 uM). Eksperimenter måle cellenes levedyktighet /monolag integritet ble utført på monolag som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver. For hvert eksperiment minst 4 monolagene /tilstand ble brukt.
Opptak av fluorescensmerkede zoledronsyre i grunnskolen menneskelige rørformede nyrecellekulturer
Zoledronsyre ble fluorescensmerkede med 5-carboxyfluorescein [5-FAM ] eller Alexa Fluor 647 [AF647]. 5-FAM og AF647 ble oppnådd fra Invitrogen. Fluorescerende merking ble utført ved stabil konjugering av den succinimidylester av fluoroforen til den imidazolnitrogenet av zoledronsyre via linkeren strategi, som tidligere beskrevet av McKenna [26, 27]. Det merkede zoledronsyre ble renset ved HPLC og karakterisert ved UV-fluorescens,
1 H og
31P NMR og ved MS, som beskrevet tidligere [26, 27], og deretter løst i PBS
Sammenflytende monolag. av primære humane nyre tubulære cellene ble inkubert enten ved den apikale eller basolateral side med 5-FAM /AF647 merket zoledronsyre (50 uM) i 1 time ved enten 37 eller 4 ° C. Monolag ble deretter formalinfiksert og motfarget med Hoechst 33258. Dette forsøk ble utført på monolag som stammer fra to forskjellige nyreprøver.
For å kontrollere for det faktum at zoledronsyre signal faktisk er lokalisert inne i cellene, er cellemembranen av proksimale tubulære celler ble merket etter inkubasjon med zoledronsyre og fomalin fiksering. For dette formål monolagene ble inkubert i 20 minutter med normal esel serum (20%), og i 2 timer med et mus monoklonalt antistoff mot humant leucin-aminopeptidase, en spesifikk proksimale rørformet cellemarkør [19; 28; 29]. Deretter en AF488-merket esel anti mus sekundært antistoff (Life-teknologi, Gent, Belgia) ble brukt og monolagene ble kontra med Hoechst 33258.
Fluorescent signalene ble evaluert ved hjelp konfokalmikroskopi (Perkin Elmer, Zaventem, Belgia) og anvendelse av Volocity programvare (Perkin Elmer).
Identifikasjon av zoledronsyre holdige intracellulære vesikler
for å undersøke om det cellulære opptaket av zoledronsyre fant sted ved væskefase endocytose og /eller reseptor endocytose, konfluente monolag ble ko-inkubert med AF647-merket zoledronsyre (50 uM) og FITC-merket dekstran eller FITC-merket albumin, enten den apikale eller basolateral side ved 37 ° C i 1 time. FITC- merket dekstran og FITC-merket albumin er etablert markører for væskefase og reseptor-mediert endocytose, henholdsvis [14; 30; 31]. Dette eksperimentet ble utført på monolagene stammer fra to forskjellige nyreprøver.
Videre ble sammenflytende monolag av menneskelig rørformede nyreceller inkubert med cytokalasin B (45 min, 30 pm) før utsette celler til AF647-merket zoledronsyre, eller FITC-merket dekstran eller FITC-merket albumin. Cytochalasin B, en celle-gjennomtrengelig mykotoksin som sterkt hemmer nettverksdannelse ved aktin filamenter, generelt er anerkjent som en hemmer av endocytose. Men cytokalasin B ikke påvirke [32-34] opptaket av FITC-dekstran av væskefase endocytose.
Fluorescent signalene ble evaluert ved hjelp konfokalmikroskopi (Perkin Elmer, Zaventem, Belgia) og anvendelse av Volocity programvare ( Perkin Elmer).
Måling av intracellulære nivåer av radiomerket zoledronsyre
Den intracellulære konsentrasjonen av zoledronsyre ble kvantifisert etter å skape stabile forhold. Stabile betingelser ble oppnådd som beskrevet tidligere (Simmons, 1990), ved å tilsette de samme konsentrasjoner (5 um) av zoledronsyre i forvarmet Krebs-buffer til både den apikale og basolateral side av de polariserte cellekulturer. Etter 1 times inkubasjon,
14C-merket zoledronsyre (spesifikk aktivitet 2,04 GBq /mmol, tilgjengelig fra Novartis Pharma AG, Basel) ble tilsatt ved en konsentrasjon på 1 uCi /ml i cellekulturmediet, ved enten den apikale eller basolateral side av monolaget. Etter en ytterligere inkubasjonsperiode på 1 time permeable bærere ble skåret ut og antallet desintegrasjoner pr minutt ble målt i en scintillasjonsteller. Intracellulære nivåer av zoledronsyre er presentert som pmol /cm
2. Eksperimentet ble utført 4 ganger i monolag som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver. For hvert eksperiment minst 5 monolagene /tilstand ble brukt.
Sammenligning av intracellulær radiomerket zoledronsyre nivåer syre til intracellulære radiomerkede mannitol nivåer
På monolag av en nyre (5 monolag /tilstand), intracellulære nivåer av zoledronsyre ble sammenlignet med de av mannitol, et molekyl som ikke er internalisert av rørformede celler [18, 35]. Cellulær akkumulering av mannitol ble undersøkt ved å utføre et eksperiment identisk med den beskrevet for zoledronsyre på parallelle monolag av samme nyre.
3H-merket mannitol ble erholdt fra Perkin Eimer (spesifikk aktivitet 432,9 GBq /mmol).
Virkningen av et overskudd av para-ammino hippursyre, østron-3-sulfat eller pamidronat på intracellulær nivåer av radioaktivt merket zoledronsyre
effekten av organisk anion transporter substrater (PAH og østron-3-sulfat (E-3S), og en ytterligere N-inneholdende bisfosfonat (pamidronat) på cellulært opptak av zoledronsyre var undersøkt ved ko-inkubering av
14C-merket-zoledronsyre med en overskuddsmengde av disse molekylene (50 uM) som beskrevet tidligere [18, 35]. eksperimentet ble utført i monolag som stammer fra 2 forskjellige nyreprøver med minst 5 monolag /tilstand.
Måling av transepitelial transport av radiomerket zoledronsyre og sammenligning med den transepitelial transport av radioaktivt merket mannitol
for å måle transport av zoledronsyre gjennom monolag av humane tubulære epitelceller en stabil tilstand ble skapt ved å inkubere monolagene i 1 time med 5 uM av molekylet i forvarmes Krebs-buffer ved både de apikale og basolateral side. Apikale til basolateral og basolateral å apikale fluks ble deretter målt i forskjellige monolagene. Derfor
14C-merket molekylet ble lagt til enten den apikale eller basolateral side av kulturer. En prøve ble deretter tatt på den motsatte side etter 1 times inkubasjon (hvis ikke annet er nevnt). Eksperimentet ble utført 4 ganger i monolag som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver. For hvert eksperiment minst 5 monolag /tilstand ble anvendt.
Transport av zoledronsyre ble sammenlignet med mannitol i monolag som stammer fra 2 nyrer (for hvert forsøk i det minste 5 monosjikt /betingelse). Apikale til basolateral og basolateral til apikale mannitol flukser ble målt ved å utføre et eksperiment identisk med den beskrevet for zoledronsyre på parallelle monolag av samme nyre.
3H-mannitol var fra Perkin Elmer (spesifikk aktivitet 432,9 GBq /mmol).
Effekt av administrert konsentrasjon på intracellulære nivåer og transepitelial transport av zoledronsyre
Effekten av administrert zoledronsyre konsentrasjon på intracellulære nivåer og transepitelial transport av forbindelsen ble undersøkt ved bruk av stabile satt opp som beskrevet i de respektive avsnitt ovenfor. Zoledronsyre ble administrert i følgende konsentrasjoner på 0,25, 1, 5, 25 og 100 uM. Dette eksperimentet ble utført to ganger på monolayers originiating fra 2 ulike nyreprøver og for hvert forsøk på minst 5 monolagene /tilstand).
statistikker
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistikk 20. data ble analysert ved hjelp av ikke-parametrisk statistikk (Mann-Whitney U test) med Bonferroni-korreksjon for multiple sammenligninger.
Resultater
Epitelial integritet og cellulær levedyktighet
Inkubasjon av monolagene i 2 timer med forskjellige konsentrasjoner av zoledronsyre (0,1 til 100 uM) ikke har en direkte effekt på epitelial integritet (fig. 1A) eller cellulær levedyktighet (fig. 1B). Vedlikehold av epitelial integritet er kritisk for å studere transcellulær transport av spesielle forbindelser som med altfor utett monolag man ikke ville være i stand til å kvantifisere transcellulær transport som det ville bli maskert av den mye høyere paracellulær transport.
(A) og levedyktighet (vurdert ved å måle produksjonen MTT) (B) av sammenflytende monolag av primære humane tubulære celler. TER ble målt før og etter en 2 timers inkubasjonsperiode med zoledronsyre (0 til 100 uM), hvoretter levedyktighet ble målt. Hvert datapunkt representerer middelverdien ± SD av 4 forsøk, utført på cellekulturer som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver. Under hver av de fire forsøkene minst 4 monolag /betingelser ble anvendt. (C og D) Virkning av zoledronsyre inkubasjon på levedyktigheten av konfluente monolag av primære humane tubulære celler på lengre sikt. Sammenflytende monolag av primære humane tubulære celler ble inkubert med forskjellige (0 til 100 ^ M) konsentrasjoner av zoledronsyre i 2 timer og cellelevedyktigheten ble målt 4, 24 og 48 timer senere (C). Sammenflytende monolag av primære humane tubulære celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av zoledronsyre til 4, 24 eller 48 timer hvoretter cellulær levedyktighet ble målt (D). Hvert datapunkt representerer middelverdien ± SD av 2 forsøk, utført på cellekulturer som stammer fra 2 forskjellige nyreprøver. Under hver av de 2 forsøkene minst 4 monolag /tilstand ble anvendt. * P. 0,05 vs 0 mikrometer
Måling av cellulær levedyktighet ved 4h, 24 og 48 timer etter en 2 timers inkubasjon med ulike konsentrasjoner av zoledronsyre (0-100 mm), avdekket en betydelig redusert levedyktighet for den høyeste konsentrasjonen av zoledronsyre (100 uM), 48t etter inkubasjon (p 0,0005) (fig 1C.). Når cellene ble inkubert i 4 timer, 24 timer eller 48 timer med de samme konsentrasjoner av zoledronsyre, ble en signifikant, doseavhengig reduksjon i levedyktigheten observert etter 48 timer (fig. 1 D).
cellulært opptak av zoledronsyre
Inkubering av primære humane rørformede monolag ved 37 ° C med fluorescens (enten 5 (6) -FAM eller AF647) merket zoledronsyre ved den apikale membran førte til en tydelig vesikulær fluorescerende signal inne i cellene (fig. 2). Den intracellulære lokalisering av forbindelsen ble ytterligere bevist ved ko-immunfarging av den proksimale rørformede cellemembranen med leucin aminopeptidase (fig. 3). Ingen forskjell kunne observeres i lokalisering av fluorescerende signal når den fluorescensmerkede zoledronsyre ble administrert ved basolateral i stedet for den apikale side av monolagene. Videre er ikke noe signal kan bli observert når cellene ble inkubert ved 4 ° C (Fig. 2C-D).
ett lag A og B ble inkubert ved 37 ° C, Cand D ved 4 ° C.
for å undersøke der veien zoledronsyre er tatt opp i cellene, cellular monolagene ble co-inkubert med enten FITC-merket dekstran (etablert markør for væskefase endocytose eller FITC-merket albumin (etablert markeringen av reseptor-mediert endocytose) og AF647 merket zoledronsyre administrert ved den apikale eller basolateral side. Som vist på fig. 4 (opptak fra apikal side), zoledronsyre og dekstran er tydelig co-lokalisert i de intracellulære vesikler som bevis på cellulært opptak av væske fase endocytose. Et lignende bilde ble observert etter ko-inkubering av fluorescensmerkede zoledronsyre og dekstran på basolateral siden. Som vist på fig. 5 (opptak fra apikal side), zoledronsyre inneholdende vesiklene ikke samtidig lokalisere med vesikler inneholdende albumin , impliserer at zoledronsyre ikke blir tatt opp av reseptor-mediert endocytose som er ytterligere bevist ved det faktum at, i motsetning til zoledronsyre, albumin er nesten ikke opptas fra basolateral side (data ikke vist).
piler viser tydelig samlokalisering av zoledronsyre (rød signal) og dekstran (grønt signal) i samme vesikler, gule flekker i det fusjonerte figuren.
zoledronsyre (rød signal) og albumin (grønt signal) åpenbart ikke er colocalized.
videre oppnådde resultatene etter inkubasjon celler med cytokalasin B ytterligere bekrefter en felles opptak vei for zoledronsyre og dekstran. Mens Cytochalasin B resulterte i en klar inhibering av albumin opptak ingen effekt ble sett for dekstran /zoledronsyre (fig. 6). Etter cytokalasin B inkubering den grønne merket albumin er plassert langs den cellulære membran, og ikke som vesikler i cellene. Disse resultatene indikerer at dekstran og zoledronsyre blir tatt opp av en felles, opptak rute, dvs. væskefasen endocytose mens albumin blir tatt opp av en annen (reseptor-mediert) endocytotic prosess, hemmet med cytokalasin B.
Kvantifisering av cellulært opptak /intracellulære nivåer av zoledronsyre
fig. 7 viser intracellulære nivåer av
14C-merket-zoledronsyre i primære cellekulturer avledet fra 4 forskjellige nyreprøver. Igjen, disse eksperimentene tyder på at zoledronsyre er tatt opp fra både den apikale og basolateral side og dessuten vise at intracellulære nivåer blir signifikant (p 0,0005) høyere når det gis ved apikale siden (28,7 ± 11,8 pmol /cm
2 ) sammenlignet med basolateral side (13,2 ± 5,9 pmol /cm
2). Til sammenligning var de intracellulære nivåer av mannitol var bare 3,3 og 4,0 ± 1,0 pmol /cm
2, når det gis til enten den apikale eller basolateral side, henholdsvis.
Denne figuren viser resultatene av 4 eksperimenter på monolag som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver (for hvert forsøk i det minste 5 monosjikt /betingelse). Intracellulære konsentrasjonen ble beregnet som pmol /cm
2
Effekt av organisk anion transporter underlag og pamidronat på intracellulære nivåer av zoledronsyre
Et overskudd av organisk anion transporter substrater PAH /E-3S ble anvendt for å undersøke hvorvidt zoledronsyre opptak i tubulære celler blir mediert av organisk anion transportører. Et overskudd av pamidronat, en N-inneholdende bisfosfonat, ble brukt for å sjekke for en felles reaksjonsvei opptak av begge bisfosfonat molekyler. Siden intracellulære nivåer av zoledronsyre ikke endret i nærvær av et overskudd av det organiske anion transporter substrater PAH og E-3S (fig. 8), heller ikke administrering av pamidronat utøve noen virkning på de intracellulære nivåene av zoledronsyre (Fig . 8) ingen argumenter ble oppnådd for zoledronsyre opptak av organiske anion transportører og heller ikke for en felles opptak ruten for begge bisfosfonater.
Hver figur representerer resultatene av en representant eksperiment på celler som stammer fra en nyre (minst 5 monolag /tilstand). Intracellulære konsentrasjonen av zoledronsyre ble beregnet som pmol /cm
2.
transepitelial transport av zoledronsyre
Vi neste undersøkt om cellulær akkumulering av zoledronsyre gikk sammen med netto transcellular zoledronsyre syre flukser. Flukser rettet enten fra apikal til basolateral side (Ja-bl) eller basolateral til den apikale siden (JBL-a) ble målt i monolag stammer fra 4 forskjellige nyreprøver. Resultatene viste flukser i begge retninger for å være tilnærmet lik hverandre (fig. 9), noe som tyder på at zoledronsyre transporten finner sted ved den paracellulære vei. Dette ble ytterligere bekreftet ved det funn at de transepitelial fluksene av zoledronsyre ikke var høyere enn de mannitol (fig. 10).
Denne figuren viser resultatene av eksperimenter på 4 monolag som stammer fra 4 forskjellige nyreprøver ( for hvert eksperiment minst 5 monolag /betingelse). Transepitelial flukser i begge retninger var ikke signifikant forskjellig fra hverandre.
Dette tallet representerer resultatene av en representant eksperiment på celler som stammer fra en nyre (minst 5 monolagene /tilstand).
konsentrasjon avhengighet av rørformet håndtering av zoledronsyre
for å sjekke mulig effekt av zoledronsyre fokus på transport og intracellulære akkumulercellekulturer ble inkubert med ulike konsentrasjoner av forbindelsen som spenner 0,25 til 100 uM (fig. 11). Resultatene i fig. 10A viser at belegg fra apikal til basolateral side (Ja-BL) og fra basolateral til den apikale siden (JBL-en) ikke skiller seg fra hverandre over hele konsentrasjonsområdet. Videre er det funn at det ikke platå blir nådd, gir en ytterligere indikasjon på at transporten utelukkende finner sted ved den paracellulære vei.
Virkningen av konsentrasjonen av zoledronsyre på sin intracellulære nivå er vist i fig. 11B. Igjen, den intracellulære akkumuleringen ikke nå et platå innenfor det brede konsentrasjonsområdet undersøkt. Sistnevnte funn er indikativt for det faktum at cellulær akkumulering av zoledronsyre ikke er regulert av membranseptum protein transportmolekyler, slik disse ville bli mettet med rimelighet ved de høye konsentrasjoner som anvendes i foreliggende eksperiment.
(A) og intracellulær zoledronsyre konsentrasjon (B). Zoledronsyre transport og intracellulær akkumulering ble målt i konfluente monolag av primære humane tubulære celler ved hjelp av steady state-oppsett. Dette tallet representerer resultatene av en representant eksperiment på celler som stammer fra en nyre (minst 5 monolagene /tilstand).
Diskusjoner
Zoledronsyre er et velkjent terapeutisk middel som brukes å redusere benresorpsjon hos pasienter med osteoporose (Reid
et el
., 2002). I tillegg er forbindelsen også anvendes ved forholdsvis høyere doser hos pasienter med multippelt myelom, lunge, bryst og prostatacancer [1-3]. På grunn av sin høye affinitet til hydroksyapatitt, blir mesteparten av den administrerte zoledronsyre antas å hope seg opp i benet. Den zoledronsyre som ikke binder til benet utskilles, umetabolisert via nyrene, hovedsakelig i løpet av de første timene etter administrering [4, 10]. Etter administrering av høye doser av zoledronsyre kan være forbundet med akutt tubulær nekrose i et antall pasienter [11], zoledronsyre opptak /opphopning av rørformede celler sannsynligvis inntreffer. Faktisk fluorescensmerket risedronat, som strukturelt ligner på zoledronsyre, er blitt påvist i ben, men også ved nedsatt vev etter administrering til mus [14].
Ved hjelp av den ovenfor beskrevne primære humane rørformet cellekultur oppsett viktige aspekter ved rørformet zoledronsyre håndtering ble undersøkt. En zoledronsyre konsentrasjonsområde på 0,0, 0,25, 1,0, 5,0, 25 og 100 um (svarende til 0, 67,5, 270, 1350, 6750 og 27.000 ng /ml) ble anvendt. Siden serum zoledronsyre Cmax nivåer i pasienter etter en 15 minutters intravenøs infusjon av 4 mg zoledronsyre er rundt 300ng /ml [10], de laveste konsentrasjonene som brukes i våre eksperimentelle oppsettet således helt samsvarer med serumnivåer i zoledronsyre behandlede pasienter. Ved å bruke de høyere zoledronsyre konsentrasjoner (25 og 100 ^ M) var vi i stand til å vise at zoledronsyre opptak /transport var ikke satiable.
Det kunne tydelig vises at zoledronsyre opptak i rørformede celler skjer ved væskefase endocytose . Dette er i samsvar med observasjonen av Roelofs et al. viser at cellulært opptak av zoledronsyre og dens analoge risedronate fortrinnsvis foregår i celletyper med et høyt væskefase endocytotic kapasitet som osteoklaster og monocytter /makrofager [13, 14].
For å utelukke en mulig effekt av den store kromofor på opptak av merket zoledronsyre, to forskjellige fluorescerende markører ble valgt som viste konsistente resultater og således indikerer at opptaket av zoledronsyre av de rørformede celler ble bestemt hovedsakelig av det opprinnelige legemidlet i stedet for de konjugerte fluorescerende fargestoffer. Dette er ytterligere støttet av det faktum at radiomerkede zoledronsyre også blir tatt opp i de primære humane tubulære celler. Kvantifisering av opptaket av radiomerket zoledronsyre viste en signifikant høyere (± 2 ganger) opptak fra den apikale side i forhold til den basolateral en.
