Abstract
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet, etter lungekreft hos menn fra utviklede land. I en tidlig fase, er primær tumorvekst er avhengig av androgener, således generelt kan kontrolleres av androgen deprivasjon (ADT). Til slutt imidlertid utvikler sykdommen seg til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC), en dødelig form i behov for mer effektive behandlinger. G-protein koblede reseptorer (GPCR) utgjør en stor klan av celleoverflateproteiner som har vært innblandet som terapeutiske mål ved PCA vekst og progresjon. Resultatene som presenteres her gir spennende bevis for en rolle for den nylig preget glutamat familiemedlem GPR158 ved PCA vekst og progresjon. Vi har funnet at GPR158 fremmer PCa celleproliferasjon uavhengig av androgenreseptoren (AR) funksjonalitet, og at dette krever dens lokalisering i kjernen av cellen. Dette tyder på at GPR158 virker ved mekanismer som er forskjellige fra andre GPCR. GPR158 uttrykk stimuleres av androgener og GPR158 stimulerer AR uttrykk, noe som tyder på et potensiale til å bevisstgjøre svulster til lave androgen forholdene under ADT via en positiv feedback loop. Videre fant vi GPR158 uttrykk korrelerer med nevroendokrin (NE) differensiering fenotype og fremmer forankringsuavhengig kolonidannelse innebærer en rolle for GPR158 i terapeutisk progresjon og tumordannelse. GPR158 uttrykk ble økt på invaderende foran prostatakreft som dannes i genetisk definert betinget
PTEN
knockout mus modell, og samlokalisert med forhøyet AR uttrykk i cellekjernen. Kaplan-Meier analyse på et datasett fra Memorial Sloan Kettering Cancer genomet portal viste at økt GPR158 uttrykk i tumorer er assosiert med lavere sykdomsfri overlevelse. Våre funn antyder sterkt at legemidler rettet mot GPR158 aktiviteter kan representere en ny og innovativ tilnærming til forebygging og håndtering av CRPC
Citation. Patel N, Itakura T, Jeong S, Liao CP, Roy-Burman P, Zandi E, et al. (2015) uttrykk og Funksjonell rolle Orphan Receptor GPR158 i prostatakreft vekst og fremgang. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10,1371 /journal.pone.0117758
Academic Redaktør: Craig N. Robson, Nord Institute for Cancer Research, STORBRITANNIA
mottatt: 7 august 2014; Godkjent: 23 desember 2014; Publisert: 18 februar 2015
Copyright: © 2015 Patel et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd [R01-EY09828] til MEF og [R01-CA136924] til GAC. Robert E. og May R. Wright Foundation prisen til NP og MEF også gitt støtte til å gjennomføre denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesser. Nitin Patel og M. Elizabeth Fini er co-oppfinnere på en provisorisk US patentsøknad med tittelen «GPR158 som en roman mål for prostatakreft terapi», anvendt ved University of Southern California (USC). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
G-protein koblede reseptorer (GPCR) utgjør en stor klan av celleoverflateproteiner som utføre ulike cellulære funksjoner. GPCR avføle informasjon om miljøet og typisk transduce et signal inn i cellen ved binding og aktivering av heterotrimeric G-proteiner ved ekstracellulær ligandbindende [1]. Medlemmer av denne klanen har blitt grundig utnyttet for medisiner og en stor andel av tiden brukt narkotika i markedet målet GPCRs [2]. GPCR er klassifisert i sju familier via fylogenetisk analyse av deres definerende trekk: de syv trans (7TM) domene [1]. Den GPCR glutamat familien inneholder 7 foreldreløs reseptorer, tre tilhører den gamma-aminosmørsyre reseptor gren: GPR156, GPR158, og GPR179 [3,4]. GPR179 ble nylig vist å være nødvendig for depolariserende bipolare cellefunksjon i netthinnen, og mutasjoner forårsaker autosomal recessive-komp medfødt stasjonær nattblindhet [5,6]. To svært nyere publikasjoner gi den første karakterisering av GPR158 [7,8]. Den første identifisert GPR158 uttrykk i netthinnens bipolare nevroner og demonstrert en uvanlig rolle som en plasmamembran scaffoldprotein, fungerer å hemme signaliserer ved GPCRs at par med hemmende familien av Galpha proteiner ved å binde seg til Gbeta5 og rekruttere medlemmer av R7 familien av GTPase Activating proteiner (hull) til plasmamembranen [7]. Den andre publikasjon var fra laboratorium til [8]. Vi identifiserte GPR158 uttrykk i trabekelverket (TBM) celler i øyets vannutløps trasé og dens rolle i regulering av cellebarrierefunksjon, muligens bidra til patofysiologien av steroid-indusert okulær hypertensjon og glaukom.
Søke etter andre mulige roller for GPR158, identifiserte vi en publisert microarray studie som viser GPR158 som en av de genene oppregulert i androgen ablasjon motstandsdyktig metastatisk tumor i forhold til primær prostatakreft [9]. En annen genekspresjon mikromatriser studie viste nedregulering av GPR158 ved tilbaketrekking av østrogen i humane østrogensensitive brystcancerceller, eller ved tamoxifen (anti-østrogen) behandling [10]. Kanskje ikke tilfeldig, involverer både krefttyper endret respons på steroidhormoner. Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet etter lungekreft hos menn fra utviklede land [11]. I utgangspunktet spredning av PCA celler avhenger androgener, og dermed androgen-deprivasjon terapi (ADT) er den primære behandling for pasienter med lokalavansert PCa. ADT gir remisjon av sykdommen i mer enn 90% av pasientene, men varigheten av responsen er vanligvis 2-3 år. Til tross for ADT behandling, metastatisk PCa og tilbakevendende sykdom avkastning etter svikt i lokaliserte behandlinger [12], en prosess som kalles kastrering-resistente PCa (CRPC). Totalt sett, metastatisk CRPC pasientene har en median overlevelse på bare 16-18 måneder, og sykdommen er fortsatt uhelbredelig [13].
Det er allment anerkjent at CRPC utvikles gjennom flere mekanismer, inkludert androgen reseptor (AR) -avhengige trasé slik som AR forsterkning og overekspresjon [14]; lokal androgen syntese [15]; endret uttrykk for AR co-aktivator og co-repressor proteiner; og AR-uavhengige trasé som alternative overlevelses trasé [16]. Målretting av AR bane har vist seg å gi den mest gjennomførbare metode for nye terapeutiske midler siden AR forblir aktiv i CRPC [17]. En annen mulig terapeutisk fokus for PCa terapi er det nevroendokrine (NE) celle-fenotype. Denne celletype oppstår i spredte foci i prostata adenokarsinom, i likhet med dens fordeling i ductal epitelceller i normal prostata. Men tettheten av NE celler er ofte større i prostata karsinom enn i normalt vev, og studier har vist at NE differensiering (NED) er beriket i tumorer høy klasse og høy scene, og nært knyttet til fremveksten av CRPC [18 -20]. Prostata epitelceller antas å transdifferentiate til NE celler, som er vist å være forskjellig fra den mindreårige populasjon av NE celler i normal prostata [18-20]. NE celler kan fremme proliferasjon av tilstøtende adenokarsinomceller i en androgen-sultet tilstand, noe som fører til CRPC [21], som er støttet av observasjoner av høyere proliferativ indeks på proksimale PCA-celler til NE celler sammenlignet med distale kreftceller [22, 23]. Dessuten har cellekulturstudier etablert at neurohormones og nevropeptider utskilt av NE celler kan støtte androgen-uavhengig vekst av PCA celler [24,25]. Men den nøyaktige opprinnelse og de forårsakende faktorer av NED er imidlertid ukjent. Derfor er identifisering av nye gener og molekylære mekanismer i å koble disse flere veier som er ansvarlig for patogenesen av CRPC kritisk nødvendig for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger.
PCa er vanligvis knyttet til genetiske endringer som involverer androgen følsomhet og AR [26] . I denne rapporten, undersøkte vi uttrykket, molekyl regulering, subcellulære lokalisering og funksjonelle rolle av GPR158 ved hjelp av et sett på fire humane PCA-cellelinjer med ulike endringer i AR resulterer i varierende grad av androgen-respons, androgen-følsomhet og AR uttrykk. Vi kombinerer dette med en mus PCa modell og bioinformatikk analyse av menneskelige PCA datasett. Våre funn tyder på at heving av GPR158 uttrykk er en viktig onkogen hendelse som stimulerer PCa celleproliferasjon og progresjon, og dermed kan representere en innovativ terapeutisk mål.
Materialer og metoder
Cell Culture
Primære humane prostata epitelceller (PHPECs) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og opprettholdt, i henhold til deres instruksjoner, ved hjelp av prostata epitelcelle basalmedium inneholdende cellevekst kit. Fire mennesker PCA cellelinjer opprettholdes i en av våre laboratorier (Coetzee) ble brukt i disse studiene: LNCaP, C4-2B, PC-3 og DU145, alle hentet opprinnelig fra ATCC. LnCap og C4-2B celler ble dyrket i komplett RPMI-medium, mens DU145 og PC-3-celler ble dyrket i DMEM-medium (Gibco-BRL, Bethesda, MA), begge inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellene ble splittet hver 3. dag.
LNCaP cellelinje ble etablert fra et menneske lymfeknute metastatisk svulst i prostata adenokarsinom. LNCaP-celler uttrykker AR som bærer den vanlige T877A mutasjon i ligand-bindende domene, og skaper bred steroid bindingsspesifisitet. De er androgen-responsive, som viser vekst stimulering når de ble behandlet med androgener, og de er også androgen-avhengig, gjennomgår vekststans ved uttak av androgener [27-29]. De C4-2B celler ble avledet fra en beinmetastaser som vokste i hårløse mus etter inokulering med LNCaP-avledet, kastreringsresistent c4-2 celler [30,31]. Som LNCaP celler, C4-2B celler androgen-responsive. I samsvar med dette, beholder de en funksjonell AR, selv om den viser lavere affinitet for androgener enn AR i LNCaP-celler [32]. Men i motsetning til LNCaP celler, C4-2B celler androgen-insensitive, fordi ved uttak av androgener de ikke gjennomgår vekst arrest [33]. PC-3 og DU145 cellelinjer ble etablert fra menneskelige prostata adenokarsinom, metastatisk til hjernen eller bein, henholdsvis. PC-3 og DU145 cellelinjer brukt i denne studien var tidligere preget av en av våre laboratorier (Coetzee) [34]. Begge linjene er androgen-nonresponsive og androgen-insensitive. PC-3
AR + sub-linje som anvendes i denne studien uttrykker lave nivåer av AR mRNA og protein. Selv om dette ikke resulterer i tilstrekkelig funksjonelt protein for å gi androgen-respons, ektopisk ekspresjon AR gående fremkalte en meget større transaktivering reaksjon i denne sub-linje enn i PC-3
AR- sub-linje. De DU145 cellene er AR negative. Vi utførte vår egen western blot for å bekrefte fravær eller nærvær av AR-protein i disse to linjer (S1 fig.).
Behandling av PHPEC, LNCaP og C4-2B celler med androgen, dihydrotestosteron (DHT, 10 nM ), ble utført i kulturmedium inneholdende 10% trekull-strippet serum (CSS) for å utarme androgener. For androgen sult studier, LNCaP, PC-3, og DU145 cellene ble dyrket i 10% CSS
Reagenser og oligonukleotidprimere
De reagenser som brukes i studien ble kjøpt som følger:. Lipofektamin LTX med PLUS reagens (Invitrogen, Carlsbad, California); primære antistoffer mot AR, prostataspesifikt antigen (PSA), nervecellen enolase (NSE), epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og transkripsjonsfaktor SP1, og pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-intracellulært domene (ICD) og anti-ekstracellulært domene (ECD) GPR158-antistoffer og anti-alfa-tubulin-antistoffer (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); anti-beta-aktin-antistoff (Abcam, Cambridge, UK); høy Fidelity DNA polymerase, Phusion (Finnzymes Inc., Woburn, MA); oligonukleotider primere (Valuegene INC, San Diego, CA); trekull strippet føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals Inc., Lawrenceville, GA). Alle andre reagenser ble anskaffet fra Sigma. Tabell 1 tilveiebringer sekvensene av alle oligonukleotider primerne anvendt i denne studien. For knockdown eksperimenter, brukte vi en pool av tre tilpasset designet siRNA oligonukleotider (GenePharma Co Ltd, Shanghai, Kina), aktiviteten som vi preget tidligere [8].
Kvantitativ Real-Time Reverse transkripsjon-PCR (QRT-PCR)
Total RNA isolert fra PCA-cellelinjer med Aurum total RNA mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA) ble utsatt for QRT-PCR-analyse ved hjelp av iScript ett-trinns RT- PCR kit med SYBR Grønn (Bio-Rad) på CFX96 Touch real-Time PCR Detection System (Bio-Rad), i henhold til produsentens instruksjoner. Relative kvantifisering av verdier av gener av interesse ble beregnet som 2
-ΔΔCt ved den komparative Ct-metoden, hvor ΔΔCt = (Ct mål-mRNA av behandlet prøve-Ct henvisning gen av behandlet prøve) – (Ct mål-mRNA fra kontrollprøve-Ct referanse gen av kontrollprøven). Vi brukte beta-aktin eller GAPDH som en referanse genet. Primerene anvendt for estimering av GPR158, AR, PSA og NSE ekspresjon er vist i tabell 1.
Western Blot analyse
helcellelysater ble fremstilt ved å anvende radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lysebuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksykolat, 1% NP-40) tilsatt med en cocktail av proteaseinhibitorer i 20 min, fulgt av sentrifugering ved 10.000 g i 10 min. Supernatanter ble samlet opp og proteiner i ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE uten å koke prøvene og overført til PVDF-membraner. Membraner ble probet med primær antistoff mot protein av interesse, og ble utviklet av chemiluminescence med reagenser Luminol enhancer løsning og peroxide løsning (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK) og bildene ble tatt med Fujifilm bildesystem (LAS-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan). Protein lasting ble overvåket ved stripping og reprobing av membranen med beta-aktin antistoff.
Expression Konstruerer
Tre uttrykk konstruerer (GPR158-pcDNA 3,1 (+), GPR158-GFP og GPR158-NLS -M1 + 2-GFP) anvendt for disse studiene ble beskrevet tidligere [8]. Vi har også generert en annen GPR158-GFP fusjonskonstruksjon, utpekt som GPR158: A C (AA 1-665), med hele ICD sletting ved hjelp av egnede primere som er oppført i tabell 1.
Transient Transfeksjon
indikerte cellene ble transfektert med enten uttrykk plasmider eller siRNA konstruksjoner eller arrangøren reporter plasmider ved hjelp Lipofectamine LTX reagens som per leverandørens anvisninger. I korte trekk, 1-2 x 10
5-celler /brønn i 2 ml fullstendig medium ble utsådd i seks-brønns plater og dyrket til 70-80% konfluens. DNA (2 pg) ble fortynnet i 500 ul Opti-MEM I + PLUS reagens (2 ul), inkubert i 5 min ble Lipofectamine LTX (4,5 ul) tilsatt og inkubert i 30 min. Cellemediet ble erstattet med friskt 2 mL antibiotika-fritt medium, og blandingen ble tilsatt, og inkubert i 6 timer. Etter inkubasjon ble kompleksene erstattet med komplett vekstmedium. 3 dager etter transfeksjon ble cellene behandlet for enten QRT-PCR-analyse eller Western-blotting eller celle-telling.
Lentivirus Produksjon og Cell Transduksjon
GPR158 cDNA ble sub-klonet fra pcDNA 3.1 (+), som er beskrevet ekspresjonsvektor ovenfor, inn i pSLIK lentiviral ekspresjonsvektoren (Addgene, Cambridge, MA). Lentivirus produksjon og infeksjon ble utført som beskrevet [35]. Kort fortalt ble viral emballasje utført i HEK 293T celler etter co-transfeksjon av pSLIK-GPR158 ble to emballasje plasmider pMDLg /pRRE og pRSVREV, og VSV G konvolutt plasmid hjelp Lipofectamine 2000. virus høstet 72 timer etter transfeksjon, og viruspartikler konsentreres. LNCaP celler ble infisert med en lav MOI å sikre 30% infeksjonsfrekvensen og stabile celler (Lenti-GPR158) ble generert med hygromycin utvalg på 400 mikrogram /ml for 4-uker. For induksjon av GPR158, ble de stabile LNCaP-celler ble behandlet med 100 og 500 ng /ml doksycyklin (Dox) i 72 timer. De LNCaP-celler infisert med viruspartikler som er generert med bare pSLIK vektor (Lenti-vektor) ble anvendt som en negativ kontroll. Etter 3 dager med Dox induksjon ble cellene underkastet enten western blotting eller celle-telling eller subcellulære proteinfraksjonering assay eller bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen.
subcellulære Fraksjone
subcellulære fraksjonering ble utført bruker subcellulære protein fraksjone kit i henhold til produsentens instruksjoner (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Dette settet har vist seg å isolere cytoplasmiske, membran, nukleær oppløselig, kromatin bundet og cytoskjelettet fraksjoner av tilstrekkelig renhet for protein lokaliserings og omfordelings studier [36]. I korthet ble en trinnvis separering av cellulære fra 3 x 10
6 av angitte celler utført etter påføring av den tilførte cytoplasmiske, membran, atomoppløselige, kromatin-bundet og cytoskeletal proteinekstraksjon buffere. Proteinkonsentrasjonen i hver fraksjon ble estimert ved hjelp av BCA protein estimering kit (Thermo Scientific Inc.) og den angitte mengden protein ble utsatt for western blotting.
Colony Forming analyse
lenti- GPR158 eller lenti-vektor LNCaP-cellelinjer ble anvendt for kolonidannelse analysen. I korthet ble cellene sådd ut i en 12-brønns plate (5.000 celler /brønn). Cellene ble suspendert i fenol rød fri RPMI-1640 inneholdende 10% FBS, og 0,48% agar, og lagt over et fast lag av det samme medium inneholdende 0,8% agar. Cellene ble enten indusert i mediet ovenfor inneholdende 100 ng /mL Dox, eller behandles, under forsiktig fylling av deres media hver 3. dag. Etter en to ukers inkubasjon ble platen beiset med 0,005% krystallfiolett (EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ), avfarget over natten med PBS, og kolonier ble tellet under mikroskop og fotografert ved 20 x forstørrelse.
Immunhistokjemisk (IHC) Analyse i betinget
PTEN
Knockout Mouse
den betingede
PTEN
knockout mus modellen ble opprettet ved University of Southern California av to av medforfatterne av denne studien [37]. IHC analyse av GPR158 og AR uttrykk ble utført i alle tre (ventral, dorsolateral og anterior) lapper avledet fra prostata av en 10-måneder gamle betinget homozygot
PTEN
knockout mus (
PTEN
– /-) og en tilsvarende alders matchet kontrollgruppe (
PTEN
+ /+
). Kort fortalt ble prostata vev fiksert i 4% formaldehyd og eksempelblokker ble kuttet i 5 mikrometer tykke seksjoner, deparaffinized i xylen, og rehydrert ved hjelp av en avtagende etanol gradient etterfulgt av skylling med dobbeltdestillert H
20. For å hente antigenisitet, ble objektglass inkubert med 10 mM citratbuffer (pH 6,0), vasket med 0,1 M fosfatbuffer, blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i metanol i 15 min og med 5% geiteserum i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med anti-ICD GPR158-antistoff (1: 100) eller anti-AR-antistoff (1: 200) i 1% geiteserum ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubering med biotinylert anti-kanin-sekundært antistoff (Vector Laboratories, Burlingame , CA) i 1 time og pepperrotperoksydase streptavidin (Vector Laboratories) i 30 min, og deretter visualisert ved DAB-kit (Vector Laboratories). Objektglassene ble deretter motfarget med 5% (w /v) Harris hematoksylin. Objektglassene som inneholdt parafinsnitt av prostata fra normale og PCA forsøkspersoner ble gitt av kjernen og behandlet ved hjelp av den ovenfor angitte fremgangsmåte.
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil middelverdien (SE) betydningen av forskjellene i middelverdier mellom ubehandlede og behandlede prøver ble bestemt av t-test etter å bestemme at dataene passe en normalfordeling.
Resultater
GPR158 Effects på Cell Proliferation
for å undersøke betydningen av GPR158 uttrykk til PCA utførte vi et sett av eksperimenter med humane PCA cellelinjer med ulike endringer i AR som resulterer i ulike grader av androgen-respons, androgen-følsomhet og AR uttrykk, som beskrevet i Materialer og metoder. Først vurderte vi nivåene av endogent GPR158 mRNA og protein ved real-time kvantitativ PCR og Western blotting, henholdsvis. Den raskt voksende, androgen-insensitive linjer DU145 og PC-3 (doblingstiden 1.5-2 dager) uttrykte høye nivåer av GPR158 mRNA (fig. 1A) og protein (Fig. 1B) sammenlignet med langsommere voksende celler av LNCaP linje og dens deriverte C4-2B (dobling tid 2-3 dager). Den GPR158 protein nivå i de raskere voksende celler var omtrent 2-3 ganger høyere sammenlignet med mer langsomt voksende celler.
(A) RT-PCR analyse av GPR158 mRNA uttrykk i angitt PCA cellelinjer (B) Western blot-analyse for påvisning av GPR158-protein ved hjelp av anti-ICD GPR158-antistoff i helcellelysater av angitte PCA-cellelinjer. Det samme membran ble analysert for beta-aktin, som fungerte som en lasting kontroll. Den vertikale linjen viser omplassert gel baner fra samme membran for å matche prøve rekkefølgen av fig. 1A. (C, D, E) Alle fire antydet PCA-cellelinjer ble transfektert ved 70% konfluens med enten GPR158 ekspresjonsplasmid eller tom pcDNA3.1 (+) vektoren (C og D) OR enten GPR158 siRNA eller kontroll egge siRNA (E) som angitt ved hjelp av Lipofectamine LTX-reagens og inkubert i vekstmedium i 3 dager i en 6-brønners kulturplater. (C og E) Etter 3 dager, trypsineres cellene ble telt ved bruk av trypan-blått fargestoff i et hemocytometer kammer. (D) Western blotting for påvisning av GPR158 i helcellelysater isolert fra celler transfektert med plasmider som er angitt ved hjelp av anti-ICD GPR158-antistoff. (F) Total RNA ble isolert fra DU145 celler som ble transfektert med den angitte konsentrasjon av enten GPR158 siRNA eller kontroll egge siRNA for å analysere nivået av GPR158 mRNA ved QRT-PCR. GAPDH var intern referanse kontroll. (C, E, F) Dataene viser gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige forsøk, hvert utført i duplikat. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05; ns, p . 0,05
For å vurdere mulige biologiske rolle GPR158 i regulering av celleproliferasjon av menneskelige PCA celler, utførte vi forbigående transfections med GPR158 pattedyrekspresjonsvektor tidligere beskrevet [8]. Cellelinjer transfektert med vektor alene ble brukt som en kontroll. Den virkning på celleformering ble kvantifisert etter 3-dagers transfeksjon. Transient over-ekspresjon av GPR158 i celler av LNCaP, C4-2B og DU145 linjer førte til en signifikant større andel av celleproliferasjon ved 3,88, 2,15 og 2,77 ganger i henholdsvis sammenlignet med celler transfektert med tom vektor (Fig. 1C ). Transient overuttrykk av GPR158 viste bare en marginal økning i spredning av PC-3 celler, men dette var den raskest voksende av de fire cellelinjer uten GPR158 over-uttrykk, øke muligheten for at proliferasjonsrate kan allerede være maksimalt . Overekspresjon av GPR158 i 3 dager etter transfeksjon ble bekreftet i helcellelysater av western blotting; en klar økning i GPR158 proteinnivåene ble observert i alle cellelinjene (Fig. 1 D).
For å vurdere rollen til endogent GPR158 ved PCA celleproliferasjon, vi utførte converse eksperimentet ved nedregulering av GPR158 gjennom siRNA tilnærming. Vi har tidligere rapportert karakterisering av en pool av tre siRNA oligonukleotider, viser 80-90% knockdown av GPR158 protein uttrykk i PC-3 celler på 100 nM, i en reproduserbar måte [8]. Vi transfektert hver av de fire PCA cellelinjer med 100 nM av denne siRNA bassenget. Etter 3 dager med transfeksjon, ble signifikant vekstinhibering (ca. 50%) ble observert i alle de fire cellelinjer, sammenlignet med deres respektive omkastede siRNA-transfekterte kontrollceller (fig. 1E). Vi har bekreftet den doseavhengige knockdown av GPR158 mRNA-ekspresjon ved transfeksjon av siRNA bassenget, med ca. 90% inhibisjon ved 100 nM av siRNA i DU145-celler (fig. 1F) og ca 75-90% i de andre cellelinjer (data ikke vist).
til sammen indikerer disse resultatene at uttrykket nivået av endogent protein GPR158 styrer frekvensen av PCa celleproliferasjon, uavhengig av androgen-respons, androgen-følsomhet eller AR-ekspresjon status av den humane cellelinje PCa brukt.
Virkninger av en androgen på GPR158 Expression
for å finne faktorer som regulerer GPR158 uttrykk, vi søkte på NextBio «Farmakoterapeutisk Atlas» søknad [38] som finner forbindelser og behandlinger betydelig korrelert til et gen med resultatene rangert i rekkefølge av statistisk signifikans. Vårt søk ved hjelp av «GPR158» som spørringen identifisert androgen, DHT som den mest betydningsfulle, og den første i listen over korrelerte forbindelser. Resultatene viste 7 uavhengige studier som er utført ved hjelp av LNCaP celler og alle studiene viste økt GPR158 mRNA uttrykk med DHT behandling i størrelsesorden 1,28 til 3,57 ganger (S2 fig.).
For å bestemme eksperimentelt om GPR158 er en androgen-responsive genet, gjennomførte vi DHT behandling tidsforløps eksperimenter, sammenligne androgen-responsive og androgen-sensitive PHPECs og LNCaP celler, og androgen-responsive, men androgen-
ufølsom
C4-2B celler. Representative resultater er vist i fig. 2. I PHPECs og LNCaP celler, GPR158 mRNA og protein nivåer økt med 3-4 ganger med DHT behandling på 24 timer (fig. 2, A, B, E og F). I motsetning til dette, DHT behandling hadde ingen virkning på GPR158 mRNA og proteinnivåene i C4-2B-celler (fig. 2, C og G). Begge mRNA og proteinnivåer for prostataspesifikt antigen (PSA), en godt studert AR målet genet, økt betydelig i PHPEC, LNCaP og C4-2B celler behandlet med DHT. I likhet med publiserte rapporter, vi også observert AR proteinstabilisering i DHT-stimulerte LNCaP-celler etter 12 timer i PHPEC og LNCaP-celler [39], men ikke i C4-2B celler (fig. 2, E, F og G). Viktigere, har vi funnet at AR antagonist, bikalutamid hemmet DHT-mediert økning i GPR158 mRNA og protein nivå og vi har også observert en fullstendig hemming av PSA uttrykk i PHPEC (fig. 2, D og H). GPR158 mRNA og proteinnivåer ble redusert på androgen sult ved inkubasjon av PHPEC i media som inneholder 10% CSS natten. Basert på disse resultatene konkluderer vi med at GPR158 er en androgen responsiv-genet.
(AC og EG) Celler av de angitte linjer ble inkubert i medium inneholdende 10% CSS for androgen sult over natten (0 tidspunkt), etterfulgt av behandling med DHT (10 nM) for de angitte tidsperioder. Total RNA (A-C) eller cellelysatene (E-G) ble isolert og underkastet QRT-PCR og western-blotting, henholdsvis for å anslå AR, PSA, GPR158 og beta-aktin uttrykk. (D og H) PHPEC ble dyrket i medium inneholdende 10% FCS eller 10% CSS, behandlet med DHT (10 nM) alene i 24 timer eller pre-inkubert med bikalutamid (10 uM) i 1-time før DHT behandling i media inneholdende 10 % CSS. Total RNA eller hele cellelysatene ble isolert og QRT-PCR og western-blotting ble utført, henholdsvis å detektere GPR158, AR, PSA og beta-aktin nivåer (D) mRNA-nivået av de ovenfor angitte genene ble betraktet som en i celler dyrket i 10% FCS for å beregne den relative ganger forskjell av disse gener i andre eksperimentelle betingelser. (AH) Dataene representerer tre uavhengige eksperimenter.
GPR158 Påvirkning av AR Expression
LNCaP /C4-2B menneskelig PCa progresjon modell visningsegenskapene til overgangen fra androgen-avhengighet til androgen insensitivitet [32,40], og AR spiller en avgjørende rolle i denne prosessen [41]. Fig. 3 viser resultatene av vår analyse av GPR158 effekter på AR uttrykk. Transient over-ekspresjon av GPR158 i LNCaP-celler økt, og stanse av endogen GPR158 redusert, mRNA for AR, så vel som for PSA (fig. 3A). I både LnCap og C4-2B celler, over-ekspresjon av GPR158 betydelig økt AR og PSA-proteinnivåer, mens knockdown av GPR158 (90% reduksjon) betydelig redusert AR og PSA-proteinnivåer (Fig. 3, B og C). Sammen indikerer disse resultater at GPR158 stimulerer AR og PSA uttrykk.
LNCaP (A, B, C) og C4-2B (B og C) ble transient transfektert ved hjelp av Lipofectamine LTX-reagens med enten GPR158 ekspresjonsplasmid eller vektor (A og B) OR enten GPR158 siRNA eller kontroll egge siRNA (A og C). Etter 3 dager med transfeksjon, ble totalt isolerte RNA- og protein cellelysater anvendt for QRT-PCR (A) og Western blotting (B og C), henholdsvis for ekspresjon analyse av GPR158, AR, PSA og β-aktin mRNA og protein. Dataene representerer to uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
doseavhengig Effekter av GPR158
For å undersøke hvilken rolle GPR158 i regulering av celleproliferasjon og AR genekspresjon videre, vi opprettet den lenti-GPR158 LNCaP cellelinje. Dette er en sublinje av LNCaP-celler som stabilt transformert med et lentivirus som uttrykker GPR158 under kontroll av Dox. Dox-induserbar lentivirus system gjør det mulig for stram regulering av GPR158-ekspresjon i en doseavhengig måte. LNCaP celler ble valgt for denne modellen fordi de uttrykker de laveste endogene GPR158 nivåer. Det ble nylig vist at Dox forandrer de metabolske og sprednings profiler av LNCaP-celler ved høyere konsentrasjoner [42], en effekt som vi bekreftet (data ikke vist). Derfor, i alle forsøkene med denne cellelinjen, sammenligner vi resultatene oppnådd med den lenti-GPR158 LNCaP-cellelinje som ble oppnådd ved bruk av parallelle kulturer av paren LNCaP-celler ble behandlet med de samme doser av Dox.
fig. 4 viser representative resultater fra forsøk ved bruk av lenti-GPR158 LNCaP-cellelinjen. Behandling av lenti-GPR158 Dox LNCaP med for 3 dager indusert GPR158-ekspresjon i en doseavhengig måte, sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4A). Vi konsekvent observert en omtrent tre ganger og seks ganger økning i GPR158 proteinnivåer etter behandling med Dox ved 100 ng /mL og 500 ng /ml, henholdsvis, i 3 dager (fig. 4A).
