Abstract
Androgen reseptor (AR) mediert signalering er nødvendig for normal utvikling av prostatakjertelen og også driver prostatakreft (PCA) cellevekst og overlevelse, med mange studier som viser en sammenheng mellom økte reseptor nivåer og terapiresistens med progresjon til fatal for kastrering tilbakevendende PCa (CRPC). Selv om det har blitt holdt i noen tid at transkripsjonsfaktor SP1 er hoved stimulator av AR gentranskripsjon, omfattende kunnskap om reguleringen av AR-genet forblir ufullstendig. Her beskriver vi og karakterisere i detalj to nye aktive regulatoriske elementer i 5’UTR av det humane AR-gen. Begge disse elementene inneholder overlappende bindingsseter for den positive transkripsjonsfaktor SP1 og den repressor-proteinet pur-α. Avvikende celle signalisering er karakteristisk for PCa og den transkripsjonelle aktivitet av AR-promoteren i PCA-celler er avhengig av de relative mengder av de to transkripsjonsfaktorer. Sammen med vår bekreftelse av den dominerende rollen SP1, funnene støtter begrunnelsen for målretting denne transkripsjonsfaktor til å hemme tumorprogresjon. Dette bør være spesielt terapeutisk relevans i CRPC hvor nivåene av repressor Pur-α er redusert
Citation. Hay CW, Hunter I, MacKenzie A, McEwan IJ (2015) En SP1 Modulert Regulatory Region Unikt for høyere primater Regulerer Menneskelig androgen Receptor Arrangøren aktivitet i prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10,1371 /journal.pone.0139990
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 16 juni 2015; Godkjent: 20 september 2015; Publisert: 08.10.2015
Copyright: © 2015 Hay et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Chief Scientist kontor (CSO) av den skotske regjeringen (https://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) og IH (ETM /382)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostate kreft (PCA) er den nest vanligste kreftsykdommen hos menn og utgjør den nest største årsaken til mannlige kreftdødsfall i vestlige land og den sjette henholdsvis hele verden [1]. I tillegg er forekomsten av PCa stiger i nesten alle land med frekvensen av nye tilfeller forventes å dobles innen 2030-1700000 resulterte i 500.000 flere dødsfall [2].
vekst og differensiering av normal prostata epitel -celler, så vel som utvikling og progresjon av PCa, er drevet av androgen-signalering som er mediert av androgenreseptoren (AR) [3]. Derfor hemming av AR funksjon av androgen deprivasjon terapi (ADT) med antagonister eller minking av testiklene eller intratumoural androgen syntese utgjør den viktigste prosedyren for å takle avansert og metastatisk PCa [4-6]. Til å begynne med, de fleste pasienter opplever betydelig forbedring og remisjon, men kreft alltid utvikler seg til å bli uavhengig av sirkulerende androgener og er referert til som kastrering motstandsdyktig PCa (CRPC) [7]. Denne sent, metastatisk scenen er vanligvis dødelig, og representerer den største utfordringen for utvikling av nye, effektive behandlingsformer [8]; nødvendiggjør flere AR-målrettet regimer (anmeldt i [9]). Avgjørende, CRPC svulster forbli avhengig av AR signalering; eksemplifisert i begge androgen sensitive (AS) og CRPC cellene der redusert AR ekspresjon induserer et samtidig tap av cellelevedyktighet [10].
androgen reseptor fungerer som en androgen-aktivert transkripsjonsfaktor som bindes til androgen-responselementer ( Ares) [4] i arrangører og distale forsterkere (86% til 95% av Ares [11]). Den trans evnen til reseptoren moduleres av interaksjoner med en stadig voksende liste over coregulators og transkripsjonsfaktorer (anmeldt i [12]) som virker på reseptorer selv eller endre kromatin miljø. For eksempel, pioneren transkripsjonsfaktorer FOXA1 og GATA2 fremme en åpen kromatinstruktur som forenkler AR bindende, og genom brede studier viser samlokalisering av bindingssteder for disse tre faktorene [13,14]. GATA2 spiller en særlig viktig rolle fordi samt øke AR binding til forsterkere, det deltar i kromatin looping og direkte oppregulerer AR genuttrykk [13,14]. Forhøyede nivåer av GATA2 ved PCA korrelerer med høye Gleeson score, og redusert aktivitet gjennom dempet uttrykk [13,14] eller hemming av GATA2 belegg på Ares med isoflavone curcumin [15] gi lavere PCa celleproliferasjon.
flertallet av CRPC tumorer som over reseptoren [16-19] med klonal seleksjon forverre problemet [20]. De forhøyede nivåer av AR tillate binding til kromatin i 100-ganger lavere konsentrasjon av ligand enn normalt [21], og den avvikende AR-drevet transkripsjonell program i CRPC tumorer tillater cellene å vokse i lave konsentrasjoner av androgen [22] eller den tilsynelatende fravær av hormon [23-25], og dermed oppheve ADT [26] og behandling med abiraterone [20].
Hos mennesker, AR genet spenner omtrent 180 kbp av X-kromosom (Xq11.2-Q12) og gir opphav til en transkripsjon av 4,3 kb som inkluderer en usedvanlig lang 5 utranslaterte område (5’UTR) på 1,1 kb. Arrangøren mangler TATA og CCAAT bokser, og i likhet med mange TATA-mindre gener, er transkripsjon drevet primært av binding av allestedsnærværende uttrykt sink finger transkripsjonsfaktor, spesifisitet Protein 1 (SP1) til GC boks regulatoriske elementer. Kjerne promoteren ligger mellom -74 og 87 bp [27] og aktive GC boksene har blitt bekreftet ved -46 til -41 bp, så vel som i den 5’UTR på 429 og 442 bp [27-29]. Sp1-drevet ekspresjon av AR-genet er tilrettelagt av et tilnærmet 90 bp strekning av homopurine /homopyrimidine umiddelbart oppstrøms av promotoren (-150 til -60 bp) som gir en rikelig tilførsel av transkripsjonsfaktoren til å binde seg til kjernen promoteren [30 ]. Når det er bundet til promoteren, for å SP1 tilknyttede direkte med TATA-bindende protein og TBP-assosiert faktor 4 (TAF4) [31] etablere initieringskomplekset. I tillegg kan Sp1 danne multimerer og flere stablet tetramerer gir mange tilkoblings områder for en rekke andre proteiner for å regulere transkripsjon både direkte og gjennom histone acetylering og kromatin remodeling (anmeldt i [32]). I tillegg til de upregulatory GC boksene, koder for flere inhibitoriske regulatoriske elementer, inkludert en kompositt NF-kB, B-myb-bindingssete [33], en negativ ER [34] og en androgen reseptor Suppressor (ARS) [35 den 5’UTR region ] som binder pur-α og hnRNP-K på motsatte tråder av DNA [36].
AR klart representerer akilleshæl av prostatakreft, men dagens primærbehandling involverer androgen antagonister har begrensninger og også fører til ekspresjon av en alternativ AR-drevet transkriptomet med variabel PCA utfall [37]. En mye mer effektiv tilnærming ville være å redusere AR aktivitet gjennom redusert uttrykk eller interferens med viktige transkripsjons kofaktorer f.eks et lite molekyl inhibitor av GATA2 har vist seg å være effektiv [13]. Begge tilnærminger avhengig detaljert kunnskap om interaksjoner av flere transkripsjonsfaktorer og regulatoriske elementer som er involvert i AR uttrykk. Derfor, som en transkripsjonsfaktor SP1 er generelt ansett for å være en viktig stimulator av AR-genekspresjon, har vi studert Sp1 funksjon ved den umiddelbare promoteren og 5’UTR av det humane AR-gen. I denne rapporten beskriver vi to nye aktive regulatoriske elementer i menneske AR 5’UTR som begge inneholder overlappende bindingsseter for positive og negative transkripsjonsfaktorer. Den transkripsjonelle utfall i PCA-celler er avhengig av de relative mengder av stimulatory Sp1 og inhiberende pur-α. Funnene underbygger også den dominerende rollen SP1 i å drive AR uttrykk og dermed forsterke begrunnelsen for målretting denne transkripsjonsfaktor, som denne handlingen vil fremme binding av konkurrerende pur-α og hemme tumorprogresjon. Til slutt, regulatoriske elementer utviser svært dårlig evolusjonære bevaring illustrerer det særegne ved menneskelig AR genregulering.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig prostata carcinom cellelinjer LNCaP og DU145 ble hentet fra den europeiske Innsamling av cellekulturer og American Type Culture Collection hhv. DU145 ble dyrket i DMEM mens LNCaP ble holdt i RPMI inneholdende 1 mM Na-pyruvat og 10 mM HEPES. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (PAA) og holdt ved 37 ° C uten antibiotika i en fuktet atmosfære inneholdende 95% luft og 5% CO
2.
Western blotting
Celle ekstrakter ble fremstilt fra LNCaP og DU145 cellene, og vestlige blotter utført som beskrevet tidligere [38]. Menneskelig SP1, pur-α, hnRNP-K, og GAPDH ble oppdaget ved hjelp av antistoffer ab13370, ab79936, ab52600 og ab36840 (alle fra Abcam) ved fortynninger på 1: 6000, 1: 60000, 1: 17000 og 1: 12500 hhv. Anti-AR fra Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) ble anvendt ved 1: 100 fortynning. Antigen-antistoff-komplekser ble påvist ved anvendelse av pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG sekundært antistoff (Sigma) som beskrevet tidligere. Integrasjon analyse av western blots ble utført ved hjelp av Image J programvare.
RT-PCR
LNCaP-celler ble behandlet med DMSO eller 50 nM mitramycin A (Sigma) i 24 timer. Utvinning av RNA og RT-PCR for AR og GAPDH mRNA ble utført som beskrevet tidligere [34].
plasmider og seterettet mutagenese
Mutasjoner av potensielle regulatoriske elementer ble innført i plasmid phAR1. 6Luc, hvori luciferase-ekspresjon drives av 1,6 kbp av promoteren og 5’UTR av human androgen receptor-genet (mellom -741 og 842 bp) [34], ved bruk av to metoder. Base erstatninger ble opprettet ved hjelp av QuikChange II Mutagenese kit (Agilent Technologies) ved hjelp av oligonukleotider som er oppført i tabell A i S1 File, sammen med sine reverse utfyller. Delesjonsmutasjoner ble gjort ved hjelp av In-Fusion Advantage PCR kloning systemet fra Clontech hjelp av oligonukleotider som er oppført i tabell B i S1 fil. Begge protokoller ble utført i henhold til produsentens protokoll og integriteten til alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Transfeksjon og luciferasereportergenet assays
Tjuefire-brønners plater ble sådd med LNCaP eller DU145 -celler ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /cm
2 og 1,2 x 10
4 celler /cm
2 henholdsvis. Cellene ble dyrket i komplett medium i 24 timer, deretter transfektert med 440 ng /brønn av ildflue luciferase reporter-plasmid ved hjelp av JetPEI polyetylenimin (Polyplus Transfeksjon) i henhold til produsentens protokoll. Etter 24 timer ble mediet erstattet og cellene ble dyrket i ytterligere 24 eller 48 timer.
Plasmid transfeksjon ble utført i det minste i tre eksemplarer, og luciferaseaktivitet ble målt i duplikat eller triplikat ved anvendelse av en Microplate 96 GloMax luminometer (Promega) og normalisert for proteinkonsentrasjon som tidligere beskrevet [38].
Fremstilling av nukleære ekstrakter
kjerne~~POS=TRUNC ekstrakter~~POS=HEADCOMP ble fremstilt fra DU145 cellene i nærvær av proteaseinhibitorer (fullstendig protease inhibitor cocktail fra Roche pluss 1,0 mM PMSF), og protein-fosfatase-inhibitorer (5 mM β-glycerofosfat og 100 uM aktiverte Na
3VO
4) ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Dignam
et al product: [39].
elektroforetisk mobilitet skiftanalyser (EMSAs)
Enten 10 mikrogram LNCaP cellekjerneekstrakt eller 120 nM renset rekombinant human SP1 protein (Active Motif) ble inkubert med 20 fmol biotin 3 «end-merket dobbelttrådet DNA oligonukleotider som bruker tidligere beskrevne forhold [34]. De fremre sekvensene til oligonukleotidene var: Sp1-1, 5»-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 «; ARS, 5»-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 «; og Sp1-3, 5»-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 «. Et ikke-merket oligonukleotid med en konsensus Sp1 regulatorisk element, SP1 innretninger, 5»-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 «ble tilsatt 15 min før den merkede probe. For supershift analyser antistoffene ab13370 og ab52600 (Abcam) mot henholdsvis human Sp1 og hnRNP-K ble tilsatt 15 minutter før tilsetningen av merket probe
De resulterende DNA:. Proteinprodukter ble løst i avkjølt 6% nondenaturing polyakrylamidgeler kjøres i 0,5x TBE-buffer, pH 8,3 (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) og detektert ved hjelp av Pierce LightShift Chemiluminescent reagenser (Thermo Scientific) i henhold til produsentens protokoll. Tallene ble utarbeidet etter autorads av EMSA geler med rekkefølgen på baner innenfor enkelte gels blir endret for å hjelpe klarhet og lette sammenligninger. Digital integrering av DNA:. Protein komplekser ble utført ved hjelp av en Vilber Loumat Fusion SL avkjølt CCD-sensor med omsorg blir tatt for å sikre at ingen pixel metning skjedde
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
En detaljert redegjørelse av chip metodikk har blitt presentert tidligere [34]. I korte trekk, ble LNCaP-celler transfektert med den aktuelle phAR1.6Luc-baserte plasmidet og dyrket på vanlig måte. Celler ble fiksert i 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C og kjerner fremstilt. Kromatin og plasmidet ble spaltet med 200 enheter HphI (NEB) i 20 minutter ved 37 ° C; etterfulgt av lysering og fjerning av uløselige rester ved sentrifugering. Supernatanten ble fortynnet i ChIP buffer og klaret å bruke Protein-G og Protein-A Dynabeads (Life Technologies). Prøver av ryddet lysatene ble beholdt som input (IP) og resten ble inkubert med antistoffer mot enten SP1 (07-645, Millipore) eller IgG. Immunokomplekser ble samlet ved magnetisering, vasket to ganger hver med: lav salt; høy salt; LiCl og TE buffer, etterfulgt av eluering. DNA-protein-tverrbindinger ble reversert med NaCl ved 65 ° C og DNA ble renset. Isolert DNA ble kvantifisert ved semi-kvantitativ PCR log fase og løses ved hjelp av agarose-gelelektroforese i TAE-buffer. Termin (F) og revers (R) primere var: ARS-F, 5′-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 «; ARS-R, 5»-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 «; Sp1-3-F, 5»-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 «og Vect-R, 5′-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3».
Statistisk analyse
Den statistiske betydningen av forskjeller i datasett av DNA .: protein kompleks formasjon i EMSA eksperimenter ble bestemt ved bruk av toveis ANOVA og paret t-test variansanalyse ble benyttet for alle andre sammenligninger mellom komplementære data
Resultater
Den menneskelige AR genet 5 « UTR inneholder to regioner med overlappende regulatoriske elementer
Undersøkelse av den menneskelige AR genet som koder for 5’UTR regionen av transkripsjon (fig 1A) avslørte en potensiell SP1-bindende GC boksen (328-332 bp) som ble funnet å ligge innenfor de tidligere beskrevne androgen Receptor Suppressor (ARS) sekvens [35] (figur 1B). Det første eksempel på en ARS regulatorisk element som kan binde den allestedsnærværende uttrykt protein pur-α ble beskrevet i mus AR-genet 5’UTR spissen 400 bp nedstrøms fra den tilsvarende humane sekvensen [40]. Ettersom begge GC-bokser og ARS områder har høyt GC-innhold, overlappende muligheten for andre eksempler på disse to regulatoriske elementer ble ytterligere undersøkt. Selv om binding av PUR-α er sekvensspesifikk med en preferanse for gjentakelser av (GGN), er det ingen klar enighet gjenkjennelsessekvens, og derfor ble den region til mus ARS beskyttet mot DNase I-fordøyelse brukt for å søke etter andre mulige områder i menneskelig 5’UTR. En region av det humane 5’UTR, distalt til ARS-sekvens, som har 85% identitet ble påvist (figur 1C), som er større enn 70% identitet sett med samme probe og de etablerte humane ARS (S1A Fig). Anvendelse av den definerte mus ARS sekvens [41] ga lignende funn med 75% identitet som var igjen, var større enn verdien av 67% for de humane ARS (S1B og S1C figur) respektivt. Potensialet roman Lyddemper region overlappes Sp1-3 regulerende element som er kjent for å huse to aktive GC boksene [29]. Dette hevet interessant muligheten for at disse to regionene kan virke til å enten stimulere eller redusere AR uttrykk.
(A) skjematisk fremstilling av det humane AR-gen 5’UTR og umiddelbar proksimale promoter som viser de viktigste regulatoriske elementer og regionene under studien. Bent pilen indikerer transkripsjonsstartsetet (1) og ATG med pil solid viser starten på oversettelsen. (B) Potential GC boksen (grønn stiplet boks) innen bekreftet menneskelige ARS regulerende element (blå understreket). (C) Justering av den menneskelige AR 5’UTR og musen AR 5’UTR Lyddemper element beskyttet mot DNase fordøyelsen [40] (blå understreket) med bekreftet menneskelige GC bokser (grønn solid boks). Homologe sekvenser er angitt med vertikale linjer.
flere justeringer av de ekvivalente regioner av det humane AR-gen 5’UTR i 11 andre arter ved å bruke offentlig tilgjengelige DNA-sekvenser (figur 2) viste at begge sekvenser er dårlig konservert. ARS-regionen er til stede bare i primater og sekvensen i sjimpansen, som avvek fra mennesker 6,6 millioner år siden [42], har perfekt homologi med menneske. Videre, og over span av 42.2 millioner år fra divergens av mennesker og marmoset, den mest avvek primat undersøkt, de fleste av sekvensene viser bare noen få nukleotidsubstitusjoner. Den Sp1-3 region vises enda mindre homologi med bare sjimpanse dele både GC bokser med mennesker. For begge regioner av interesse, ikke-primater besatt meget lave nivåer av homologi med humant, og ingen tilsvarende sekvenser ble funnet i fuglearter eller piscine (data ikke vist). I tillegg har mus ARS-regionen er ekstremt dårlig konservert, og ingen pur-α bindende sekvens funnet i tilsvarende genomiske region av andre dyr, inkludert det nært beslektede gnager; rotte (S2 figur).
regioner av genet Har 5’UTR under undersøkelse ble sammenlignet med de av de angitte placental arter. (A) ARS (blå boks), og (B) Sp1-3 regulerende element (grønn boks). Forskjeller fra den menneskelige sekvens angis med fet, understreket skrift.
GC boksen er hoved SP1 bindingssetet i menneske AR promoter
Første forsøk undersøkt effekten av SP1 antagonist, mitramycin A, på den endogene AR-genet i LNCaP-celler. En mitramycin ble observert en doseavhengig reduksjon i AR proteinnivåer (figur 3A) med en konsentrasjon på 50 nM mitramycin A som brukes i de etterfølgende eksperimenter. RT-PCR-studier bekreftet at nedgangen i AR protein nivåer korrelert med redusert transkripsjon (figur 3B).
LNCaP-celler ble inkubert med mitramycin A i 24 timer og deretter analysert. (A) Western blot-analyse med de relative verdier av AR /GAPDH er vist nedenfor. (B) RT-PCR av AR og GAPDH mRNA. LNCaP-celler ble transfektert med phAR1.6Luc (WT) eller phAR1.6Luc-ΔCG og behandlet med DMSO eller 50 nM mitramycin A i 24 timer og luciferase-aktiviteten ble målt. Data representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans av de angitte sammenligninger er: * p 0,05; ** P 0,01 og *** p. 0,001
Selv om det lenge har vært holdt som transkripsjonsfaktor SP1 er den viktigste driveren for uttrykk av TATA-boksen-mangler menneskelige AR genet, relative betydning av GC boksen (Sp1-1; -45 til -40 bp) i kjernen promoteren er uklar med delesjonsstudier tyder på at det er enten vesentlig [27] eller ikke spiller en vesentlig rolle [43]. Mutasjon av GC boksen i phAR1.6Luc luciferase reporter plasmid [34] som inneholder en 1,6 kbp delen av Har arrangøren og 5’UTR mellom posisjonene -741 bp til 842 bp førte til en 80% reduksjon i luciferaseekspresjon i transfektert androgen responsive LNCaP celler (figur 3C). På lignende måte ble en 46% reduksjon observert med androgen ikke-responsiv cellelinje PCa DU145 (data ikke vist). Sammen utgjør disse analysene viste at kjernen arrangøren GC-boksen, og Sp1 bindende, spiller en fremtredende rolle i uttrykket av AR mRNA og protein. Viktigere, forble det muterte reporter plasmid utsatt for hemming av mitramycin A (figur 3C), noe som bekrefter at SP1-mediert oppregulering av AR genet skjer på andre områder enn GC boksen.
Den 5’UTR overlappende regulerings elementene kan opp- eller nedregulere promoteraktivitet
for å belyse den funksjonelle aktiviteten til andre potensielle regulerende elementer som ble studert, ble flere mutasjoner introdusert i phAR1.6Luc luciferase reporter plasmid. Transfeksjon eksperimenter ble utført ved anvendelse av både androgen responsiv, LNCaP og ikke-responsive, DU145 PCA cellelinjer som ble dyrket i fullstendig medium for å sikre at alle cellesignalveier som er avhengig av mediekomponenter (vekstfaktorer og hormoner), ble funksjonell.
for å fastslå rollen som Sp1 binding til potensialet GC boksen i ARS (322-345 i 5’UTR), ble basesubstitusjoner innført for å skape reporter phAR1.6Luc-UTRm1 som resulterte i reduksjoner uttrykks på 29% og 13% i DU145 og LNCaP celler henholdsvis (figur 4A og 4B) bekrefter en aktiv rolle for denne romanen GC boksen i oppregulering AR uttrykk. Omvendt, har denne regionen av 5’UTR blitt vist å fungere som en negativ regulatorisk element gjennom binding av transkripsjonsfaktoren pur-α som er blitt rapportert til å være forstyrret i henhold EMSA betingelser ved inkludering av et par av to-basesubstitusjoner [35], og disse ble brukt for å fremstille reporter phAR1.6Luc-UTRm2. Men ved å bruke denne reporteren transkripsjonen aktivitet ble redusert med 36% og 20% i DU145 og LNCaP henholdsvis heller enn øket (figur 4B) som kan forutsies ved frigjøring av en inhibitor. Inspeksjon av sekvensendringer som produseres av mutasjon viser at guanin og cyctosine i sentrum av det antatte GC-boks ble erstattet av adenin på en måte som er analog til den Sp1-spesifikk mutasjon i phAR1.6Luc-UTRm1. Derfor, tap av Sp1 bindende i dette regulatoriske element er den dominerende utfallet, noe som gir ytterligere bevis på at den antatte GC boksen kan aktivt oppregulere AR uttrykk. I sannsynligheten for at substitusjon mutasjon av ARS-regionen var utilstrekkelig til å hindre at pur-α og hnRNP-K-binding under fysiologiske betingelser, ble hele regulerende element slettes for å skape phAR1.6Luc-UTRΔm1. I dette tilfellet ble promoteraktivitet oppregulert ved 1,27 og 1,67 ganger i henholdsvis DU145 og LNCaP (figur 4B) med den forskjell mellom de to cellelinjene blir signifikant (p 0,01).
(A) Skjematisk fremstilling av luciferase reporter konstruere phAR1.6Luc drevet av 1,6 kbp av Har arrangøren og 5’UTR med potensial transkripsjonsfaktor binding til regionene av interesse. Sp1-3 inneholder to SP1 bindingssteder. (B og C) De indikerte PCA cellelinjer dyrket i fullstendig medium, ble transfektert med enten phAR1.6Luc inneholdende WT-sekvensen (svarte søyler) eller mutert versjon (grå søyler) vist over hvert diagram. Luciferase data representerer gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter og den statistiske signifikans av de angitte sammenligninger er: * p 0,05; ** P 0,01 og *** p. 0,001
Analoge mutasjoner ble også innført i tredje regulatorisk sekvens av interesse (423-446). Først ble de to GC boksene i Sp1-3 muteres enten individuelt (phAR1.6Luc-UTRm3 og phAR1.6Luc-UTRm4) eller sammen (phAR1.6Luc-UTRm5). Luciferaseaktivitet viste at oppbrytning av GC boksene resulterte i signifikant reduksjon i promoter stimulering. De to enkeltmutasjoner redusert transkripsjonen aktivitet med 42% og 29% i DU145-celler og med 29% og 17% i LNCaP-celler, og de doble mutasjon viste reduksjoner på 34% og 16% i de to cellelinjene henholdsvis (figur 4C). Igjen, reduksjoner i promoter aktivitet var større i DU145 enn LNCaP. Virkningene av mutasjonene var ikke kumulative som kan forventes fra to overlappende bindingsseter. På en måte tilsvarende den som sees med 322-345 region, basesubstitusjon mutasjon av potensielle overlappende negativt regulerende element i phAR1.6Luc-UTRm6 produsert tap av transkripsjonen aktivitet på 9% og 4% i henholdsvis DU145 og LNCaP (Fig 4C). Disse verdiene var mindre de sett med 322-345-regionen beskrevet ovenfor, men de var i samsvar med sekvensen endres med bare en mindre innvirkning på SP1-bindingssetene. Sletting av hele potensialet negative regulatoriske element i phAR1.6Luc-UTRΔm2 førte til 1,18 og 1,50 ganger oppregulering av transkripsjonen aktivitet i DU145 og LNCaP henholdsvis (fig 4C). Som med den phAR1.6Luc-UTRΔm1 slettingsmutasjon, økningen i promoter-aktivitet var signifikant større i LNCaP enn DU145.
bindingskaraktertrekkene til den 5’UTR overlappende regulatoriske elementer
Muligheten for at SP1 binder seg til alle de tre regionene som studeres, ble undersøkt av elektromobilitet skiftanalyser (EMSAs). I innledende forsøk ble renset rekombinant human SP1 protein inkubert med merkede oligonukleotidprober inneholder enten den primære GC boksen (Sp1-1), potensialet romanen SP1 bindingssetet i ARS region eller Sp1-3. Elektroforetisk fordeling av de resulterende produkter med alle de tre merkede prober viste en enkelt høy molekylvekt-DNA.: Proteinkompleks nær toppen av gelen (figur 5A, kolonnene 2-4) var i overensstemmelse med Sp1 som har en molekylvekt på 95 kDa
Renset Sp1-protein (panel A) eller kjerneekstrakt fra DU145-celler (panel (B) til (D)) ble inkubert med de merkede oligonukleotidprober som er angitt nedenfor for hver enkelt gel, og produktene kan løses ved elektroforetisk mobilitet skift analyse. Tilgang er vist over gels og var: Ab, antistoff; PI, pre-immunserum; Mith, mithramycin; SP1 cons, konsensus SP1 oligonukleotid. Konkurrerende umerkede oligonukleotider (100 gangers molart overskudd) eller immunsera ble tilsatt før tilsetningen av proben. EMSAs er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. (A) De indikerte merkede prober ble inkubert med renset protein Sp1 bortsett fra i bane 1 som hadde ingen tilsetning. Svarte pilen indikerer SP1-DNA kompleks. (B) Anti-Sp1-antistoff ble tilsatt som angitt, og de komplekse fraværende etter inkubering med antistoffet er angitt ved pilen. (C) mitramycin (120 nM) ble tilsatt for å indikert baner og komplekset utarmet etter inkubering med stoffet er indikert ved den heltrukne pilen. (D) Umerket konkurrerer oligonukleotid koding SP1 konsensus bindingssetet ble lagt til som vist.
Inkubasjon av kjerneekstrakt forberedt fra prostatakreft cellelinje DU145 med enten Sp1-1, ARS eller Sp1-3 oligonukleotider produseres flere bånd med nesten identiske elektro motilities (figur 5B, baner 1, 4 og 6 henholdsvis). Bindingen av Sp1 ble bekreftet i alle tilfeller ved tilsetning av anti-Sp1-antistoff som ga en supershift med Sp1-1 oligonukleotid og sterkt redusert sammenstillingen av et høymolekylært DNA: proteinkompleks med både ARS og Sp1-3 (fig 5B , baner 2, 5 og 7 henholdsvis), mens preimmunserum ikke hadde noen effekt (figur 5B, felt 3). Ulike utfall av inkubasjon med anti-transkripsjon faktor antistoff kan oppstå i EMSA analyser f.eks CREB-en til CRE områder i den menneskelige insulin og somatostatin arrangører [44], på grunn av flere faktorer, inkludert: styrken på binding til DNA; den romlige /konformasjonelle organiseringen av proteinet på regulatoriske elementer, orienteringen av DNA ved siden av konsensus og tilstedeværelsen av bundne kofaktorer.
Tilsetning av mitramycin A, som interfererer med binding av Sp1 til dets regulerende element [45 ], sterkt redusert dannelse av de høymolekylære komplekser med alle tre oligonukleotider (figur 5C, sammenlign spor 1 og 2, 3 og 4, og 5 og 6). På samme måte, preinkubering med overskudd av umerket oligonukleotid som inneholder konsensus-Sp1 bindingssekvens praktisk talt eliminert alt DNA: proteinkompleksdannelse (figur 5D, sammenlign spor 1 og 2, 3 og 4, og 5 og 6). Sammen utgjør disse resultatene bekrefter binding av SP1 til alle tre GC boksen inneholder sekvenser, som støtter konklusjonene fra reporter gen eksperimenter (fig 4). Videre forskjellen i resultater sett med oligonukleotider for Sp1-1 området i kjernen arrangøren i forhold til ARS og Sp1-3 områder, som vises tydelig lavere affinitet for naturlig SP1, ulike utfall ved inkubasjon med anti-SP1 antistoff og lavere mutasjon-indusert reduksjon i luciferase-analyser (figur 4), foreslo at binding av SP1 til kjernen arrangøren GC boksen var sterkere enn til 5’UTR.
transkripsjonsfaktor pur-α bindes fortrinnsvis til guanine- rik enkelt-trådet DNA eller de tilsvarende sekvensene i dobbeltkjedet DNA. Inkubasjon av kjerneekstrakt med enten doble strandet eller G-rike enkelt motsatt tråd av ARS og Sp1-3 sonder ga ganske ulike resultater. Begge de enkelte strandet prober produsert en DNA: proteinkompleks (merket med åpen pil) som vandret litt foran SP1: DNA og andre med høy molekylvekt komplekser vanligvis sett med dobbel strandet probe (fig 6A). I samsvar med evne til pur-α til også å binde dsDNA, både ARS og Sp1-3 dobbeltrådet oligonukleotid produsert en svak DNA: proteinkompleks som migrerte i en svært lignende stilling til produktet sett med enkelt-trådede prober. Viktigere, DNA: proteinkompleks dannes med den G-rike streng av Sp1-3 oppførte seg på en identisk måte som i den tilsvarende ARS oligonukleotid som er kjent for å binde pur-α [36]. Interessant, binder pur-α DNA som dimerer og multimerer [46] som ville overleve de ikke-denaturerende betingelser av EMSA som resulterer i den åpenbare høymolekylære migrasjon egenskapene av DNA: proteinkomplekser. Den kommersielle anti-PUR-α antistoff mislyktes i å fremkalle en effekt, og det rensede protein er ikke tilgjengelig. Likevel er de komplementære cytosin-rike termin tråder av ARS og Sp1-3 oligonukleotider mislyktes i å fremstille DNA: proteinkompleks som bekrefter spesifisiteten av binding til G-rike tråd (figur 6B, sammenlign spor 1 og 7, og 4 og 8).
Nuclear ekstrakt fra DU145-celler ble inkubert med de merkede oligonukleotidprober som er angitt nedenfor for hver enkelt gel, og produktene kan løses ved elektroforetisk mobilitet skift analyse. Tilgang er vist over gels og var: Ab, antistoff; PI, pre-immunserum. EMSAs er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter.
