Abstract
Økt spredning av kreftceller er direkte avhengig av økt aktivitet av det endoplasmatiske retikulum (ER) maskiner som er ansvarlig for proteinfolding, montering og transport. Faktisk er det så kritisk at forstyrrelser i det endoplasmatiske retikulum kan føre til apoptose. Dette nøye regulert organelle representerer en unik mål av kreft celler mens sparsom friske celler. I denne studien ble en standardisert mangostan frukt ekstrakt (MFE) evaluert for å modulere ER stressproteiner i prostatakreft. To menneskelige prostata kreft cellelinjer, 22Rv1 og LNCaP, og prostata epitelceller (PrECs) anskaffet fra to pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi ble behandlet med MFE. Flowcytometri, ble MTT, BrdU og Western blot brukt til å evaluere celle apoptose, levedyktighet, proliferasjon og ER stress. Deretter evaluerte vi MFE for mikrosomale stabilitet og anti-kreft-aktivitet i nakne mus. MFE indusert apoptose, redusert levedyktighet og spredning i prostata kreft celler. MFE økt uttrykk for ER stressproteiner. Interessant, MFE selektivt fremmer ER stress i prostata kreft celler mens sparsom PrECs. MFE undertrykket tumorvekst i en xenograft tumormodell uten åpenbar toksisitet. Mangostan frukt ekstrakt selektivt fremmer endoplasmatiske retikulum stress i kreftceller, mens sparsom ikke-tumorigene prostata epitelceller. Videre i en in vivo sette mangostan frukt ekstrakt reduserer xenograft tumordannelse betydelig
Citation. Li G, Petiwala SM, Pierce DR, Nonn L, Johnson JJ (2013) Selektiv Modulation av endoplasmatisk retikulum stress Markører i prostata kreftceller ved en standardisert Mangostan Frukt Extract. PLoS ONE 8 (12): e81572. doi: 10,1371 /journal.pone.0081572
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 12 juli 2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 18.12.2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health /National Cancer Institute 1R03CA138953 (J. Johnson). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
økt proliferasjon av kreftceller er direkte avhengig av den økte aktiviteten av det endoplasmatiske retikulum (eR) maskiner som er ansvarlig for proteinfolding, montering og transport [1], [2]. Faktisk er det så kritisk at modulering av proteinsyntese hvis ikke reguleres på riktig måte kan føre til apoptose [3] – [6]. Dette gjelder spesielt for cancerceller som har akkumulert en evne til å overvinne cellesyklus og apoptotiske sjekkpunkter [7]. Ettersom behovet for proteinsyntese Øker, er det en proporsjonal økning i «translasjonell slurv» som fører til opphopning av utfoldete og mis-foldete proteiner som endrer ER homeostase. Hvis venstre ukontrollert, vil disse cellene gjennomgå apoptose, er det imidlertid klart at de ikke har noen hensikt i å gjøre det. Som forventet, kreftcellene utvikle en løsning å benytte en signaltransduksjonsbane kjent som «ufoldede protein respons (UPR)». Denne prosessen kan endre transkripsjon og translasjon av proteinene for derved å reetablere ER homeostase – til en viss grad. Dette i sin tur fremmer resistens mot apoptose og øker celleoverlevelse. Dette fenomenet er godt etablert på tvers av mange forskjellige typer kreft, inkludert kreft i prostata.
Den dominerende teorien om UPR, som reguleres av flere ulike ER stressproteiner /veier, er at en positiv modulering av ER stress vil fremme overlevelse [2]. I hovedsak er dette sant, men hva kan være mer viktig er i hvilken grad ER stressproteiner er modulert. Som vist ved våre undersøkelser som inngår heri, så vel som undersøkelser av andre forskere, presenteres data som tyder på at en betydelig økning i ER stressproteiner vil resultere i apoptose i kreftceller.
For våre studier evaluerte vi et ekstrakt fra mangostan (
Garcinia mangos
) frukt og fant det å betydelig modulere ER stressproteiner. Enda mer interessant var tilsynelatende spesifikk reaksjon å øke ER stressproteiner i prostatakreftceller samtidig redusere ER stressproteiner i prostata epitelceller. Denne effekten utgjør et komplekst forhold som eksisterer i ikke-kreft og kreftceller. Her presenterer vi bevis for at en økning i ER stress respons protein CHOP /GADD153 er en levedyktig tilnærming til nye strategier for legemiddelutvikling.
Materialer og metoder
Mangostan frukt ekstrakt, kits og antistoffer
Mangostan Frukt Extract (MFE) ble hentet fra Avesthagen, Inc. (Chatsworth, CA). Alle antistoffer for Western blot-analyse, BrdU celleproliferasjon analysesett, og spaltet caspase-3 ELISA-sett ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). BCA Protein Assay Kit og kjemiluminescerende substrater ble erholdt fra Pierce (Rockford, IL). APO-DIREKTE ™ kit ble hentet fra Phoenix Flow Systems (San Diego, California). Ett-trinns RT-PCR kit ble hentet fra Life Technologies (Grand Island, NY). RNeasy mini kit og RNase-Free DNase satt ble oppnådd fra Qiagen (Santa Clarita, CA).
Væskekromatografi
For å bestemme konsentrasjonen av α-mangostin i mangostan frukt ekstrakt Prøvene ble analysert på en HPLC farvann 2695 separasjonsmodul. Separasjonene ble oppnådd ved anvendelse av en gradient som tidligere beskrevet [8]. For bestemmelse av serumnivåene av α-Mangostin ble serumprøver analysert på en Thermoseparation SpectraSystem P4000 pumpe med en AS 3000 autosampler, en Thermoseparation SpectraSystem UV2000 detektor ved 243 nm, kjøretid 20 min, og 10 ul injeksjonsvolum ved romtemperatur. Separasjonene ble oppnådd med et isokratisk oppløsningsmiddelsystem, ved 1,0 ml /min, og en CAPCELL Pak C-18, 3 um, 4,6 x 250 mm kolonne med inline Upchurch pre-kolonne filter. Grensen for kvantifisering og påvisning er 0,039 mikrogram /ml (dvs. 95 nm), og 0,0098 ng /ml (dvs. 23,9 Nm), henholdsvis.
Cell kultur og behandlings
LNCaP og 22Rv1 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Disse cellene ble dyrket i RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Alle celler ble opprettholdt under standard cellekulturbetingelser som tidligere beskrevet [9]. Cellene ble dyrket i ovennevnte medium supplert med en rekke doser av MFE for ønsket tid, deretter klar for nedstrøms eksperimenter.
Primær prostata epitelceller og behandlings
Primær prostata epitelceller (PrECs ) ble etablert fra radikal prostatektomi vev ved University of Illinois i Chicago Medical Center, som beskrevet tidligere [10]. Friskt vev fra omkretsområdet ble valgt av en patolog ifølge et IRB-godkjent protokoll. I korte trekk ble vev spaltet i kollagenase, og sådd ut på kollagen-belagte retter i PrEGM media (Lonza, Walkersville, MD) for epitelisk celleutvekst. Alle celler ble brukt på sekundærkanalen og ~70% konfluens (celletetthet). PrECs ble behandlet med 15 ug /ml MFE i 24 timer, etterfulgt av nedstrøms eksperimenter
Celleviabilitet
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl). – 2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [11].
Celleproliferering
Celleproliferering ble bestemt av BrdU analysen i henhold til produsentens manual.
strømningscytometri
APO-DIREKTE ™ kit (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) ble anvendt for å måle apoptose av behandlede celler ved flow cytometri [11]. Kort sagt ble cellene platet 22Rv1 til 50-60% konfluens og deretter behandlet med komplett medium inneholdende MFE. Settet ble fulgt per protokoll retninger.
Western blot
Hele cellelysater fra behandlede celler ble fremstilt som tidligere beskrevet [9], [12]. Lysates ble kvantifisert ved hjelp av BCA-analyse i henhold til produsentens manual. En vanlig vestlig blotting-protokoll ble fulgt. Kort sagt ble samme mengde lysatene er lagt til hver brønn av 12% pre-støpte geler (Bio-Rad, Hercules, CA). Etter overføringen ble membranene blokkert og inkubert med primært antistoff (1:1000) over natten ved 4 ° C, vasket en kort stund, og deretter inkubert med sekundært antistoff (1:2000) ved romtemperatur i 1 time. Membraner ble vasket, inkubert med underlag og eksponert i en FluorChem E imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA).
RT-PCR
Grunning for XBP-en og GAPDH RT-PCR ble syntetisert av IDT (Coralville, IA) i henhold til tidligere studier [13]. Sekvenser var; XBP-1 fremover, 5′-TTA CGA GAG AAA ACT CAT GGC C-3 «, XBP-1 revers, 5′-GGG TCC AAG TTG TCC AGA ATG C-3′, GAPDH fremover, 5»-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 «, GAPDH omvendt, 5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3». 22Rv1 og LNCaP celler ble behandlet med 15 mg /ml MFE i 24 timer. Total RNA ble ekstrahert fra behandlede og kontrollcellene. Ett mikrogram av total RNA ble benyttet som templat for ett trinns RT-PCR. Produsentens protokoll ble fulgt.
ELISA
Spaltet caspase-3 nivåer i samme mengder forskjellige cellelysatene ble påvist med ELISA. Produsentens håndboken er fulgt.
Stabilitet av MFE standardisert til a-mangostin i levermikrosomer
0,5 mg /ml humanlevermikrosomer (Invitrogen) og mus levermikrosomer (BD Biosciences) ble inkubert med testsubstansen, mangostin /MFE ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM i en oppløsning inneholdende 5 mM isositronsyre, 5 mM MgCl
2, 0,2 E /ml, isositronsyre dehydrogenase og 1 mM NADP + i 100 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4). Forbindelsene ble inkubert med mikrosomer ved 37 ° C i 0, 10, 20 og 30 minutter i duplikat. Kontroll rør ble inkubert uten NADP +. Etter inkubering ble prøvene virvlet og holdt på is inntil de er klare for sentrifugering ved 17 000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering ble supernatantene overført til ampuller og analysert ved hjelp av LC-MS-metoden som beskrevet tidligere.
In vivo
22Rv1 tumor xenograft modell
Alle dyreforsøk ble utført i henhold med retningslinjer godkjent av Animal Care og bruk komité ved University of Illinois i Chicago. Protokollen ble godkjent av Animal Care komité ved University of Illinois i Chicago (Protocol Antall: ACC-11-019) for å sikre tiltak ble gjennomført for å bøte dyrs lidelser. Ved avslutningen av studien fikk alle mus generell anestesi ved innånding (dvs. isofluran) etterfulgt av CO
2 kvelning per godkjent dyr protokollen for aktiv dødshjelp. Alle dyrene ble overvåket på en daglig basis i tillegg til dyr vare personale. Atymisk (
nu /nu
) male hårløse mus (Harlan Laboratory, Madison, WI) sju-åtte uker gamle ble holdt under patogen-frie forhold med en 12 timers lys /12 timer mørke tidsplan og matet med en autoklav AIN-76A diett
ad libitum
som beskrevet tidligere [9], [12]. 22Rv1 celler ble anvendt for å bestemme
in vivo
effekter av MFE basert på det faktum at disse cellene danner rask og reproduserbar tumorer i nakne mus med tumor-xenografter. Fjorten Dyrene ble tilfeldig delt inn i to grupper, med syv dyr i hver gruppe. Dyrene i gruppe 1 mottok bærer (100 ul av bommulsfrøolje) ved intraperitoneal (IP) administrering og tjente som kontroll. Dyrene i gruppe 2 fikk mangostanfruktekstrakt (35 mg /kg) oppløst i bomullsfrøolje ved IP to ganger ukentlig. Kroppsvekt ble registrert gjennom hele studien.
Statistisk analyse
All statistisk analyse ble utført ved hjelp VassarStats programvare. Data er uttrykt som middelverdi med standardavvik for alle grupper. Statistisk signifikans av forskjeller i alle målinger mellom kontroll og behandlede grupper ble bestemt ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey HSD-test for multiple sammenligninger. Students parede t-test ble anvendt for parvise gruppesammenligninger, etter behov. Alle statistiske tester var tosidig, og P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
HPLC av mangostan frukt ekstrakt
Ved hjelp av HPLC vi fastslått at MFE inneholdt mer enn 35% α-Mangostin og ble brukt gjennom hele studien (figur 1A . B). Flere topper indikerer at MFE inneholder også flere xantoner, for eksempel β-Mangostin og γ-Mangostin (fig 1A . B).
[A], polyphenolic xantoner isolert fra mangostanfrukten. [B], HPLC kromatogram av mangostan frukt ekstrakt. Sub-panel representerer en utvidelse av profilen for å avsløre flere bestanddeler i ekstraktet.
Mangostan frukt ekstrakt redusert celle levedyktighet og cellulær spredning på prostatakreftceller
Vi observerte at MFE har åpenbar toksisitet ved begge 22Rv1 og LNCaP-celler i henhold til mikroskop (fig. 2A). Ved hjelp av MTT-analysen, observerte vi at MFE redusert 22Rv1 og LNCaP celleviabilitet i en dose- og tidsavhengig måte med en bedre virkning på 22Rv1 celler (Fig 2B og amp;. C). MFE også hemmet 22Rv1 og LNCaP-celle proliferasjon på en doseavhengig måte (fig. 2D).
[A], mikroskopiske bilder av MFE-behandlede og ubehandlede prostata kreftceller, ble MFE dosering indikert. [B], ble LNCaP-celler ble behandlet med økende doser av MFE for 24, 48 eller 72 timer ble cellelevedyktigheten bestemt ved MTT-analyse. [C], 22Rv1 celler ble behandlet med økende doser av MFE for 24, 48 eller 72 timer ble cellelevedyktigheten bestemt ved MTT-analyse. [D], både 22Rv1 og LNCaP-celler ble behandlet med økende doser av MFE, ble celleformering evaluert ved BrdU-analyse. Absorbans verdiene ved 450 nm (A450) representerer voksende celle tall. Disse forsøkene ble utført in triplo, og er representert ved den midlere sammen med standardavvik.
mangostanfruktekstrakt indusert apoptose i prostatakreftceller
Ved en dose på 15 pg /ml MFE, andelen av apoptotiske celler 22Rv1 var gjennomsnittlig 37% bestemt ved strømningscytometri (fig. 3A). Tilsvarende nivået av apoptose markør spaltet kaspase-3 og den pro-apoptotiske protein Bax uttrykk i 22Rv1 og LNCaP-celler økte med MFE doser (figur 3B . C). Disse resultatene er i tråd med vår forrige evaluering av ren α-mangsotin [9].
[A], Andel apoptotiske celler i MFE-behandlede og ubehandlede celler ble bestemt ved flowcytometri. MFE-dosen var 15 pg /ml. [B], kløyvde caspase-3 nivåer i økende doser av MFE behandlet 22Rv1 og LNCaP celler. Cellelysater ble fremstilt fra MFE-behandlede celler og kløyvet caspase-3 nivåer ble evaluert fra samme mengder cellelysater ved ELISA, informasjon se
Materialer og metoder
. Relative uttrykk nivåer ble angitt som absorbans verdiene ved 450 nm (A450). [C], Bax uttrykk i økende doser av MFE-behandlet 22Rv1 og LNCaP. Cellelysater ble fremstilt fra MFE-behandlede celler, ble Bax ekspresjon detektert ved Western blot, og β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Disse resultatene er representanter fra tre uavhengige eksperimenter.
Mangostan fruktekstrakt økt uttrykk av utfoldet protein respons proteiner i prostatakreftceller
Det har vært godt etablert som ER stress aktiverer UPR å reetablere celle homeostatsis. Derfor undersøkte vi uttrykket av viktige ER stress /UPR proteiner i MFE-behandlet prostatakreftceller (22Rv1 og LNCaP). Uttrykket av tre viktige UPR proteiner, bukspyttkjertelen ER kinase (PKR) -lignende ER kinase (PERK), inositol-krever enzym 1 (IRE1) og C /EBP homolog protein (CHOP), ble gradvis oppregulert med økende doser av MFE på 22Rv1 og LNCaP-celler (fig. 3A).
mangostanfruktekstrakt modulert den eR stress-spesifikke caspase-4
det er blitt rapportert at caspase-4 er lokalisert til eR-membranen og kan funksjon som en ER stress-spesifikk caspase i humane celler [14]. Vi oppdaget spaltede caspase-4 i både 22Rv1 og LNCaP celler etter behandling celler med en rekke doser av MFE i 24 timer. Resultatene viste en doseavhengig økning av spaltede caspase-4 nivåer i MFE-behandlede celler (fig. 3B).
Mangostan frukt ekstrakt modulert ER anstand
Vi har også undersøkt mulige uttrykk endringer ER anstand i MFE-behandlet prostatakreftceller. BiP (immunoglobulin-bindende protein), en kritisk ER anstand involvert i ER stress /UPR, ble oppregulert med økende MFE doser (Fig. 3C). Calnexin er en ER membranprotein for riktig folding og kvalitetskontroll [15]. Vi observerte en svak økning av calnexin ekspresjon fra 0 til 10 ug /ml MFE i begge cellelinjer. Interessant, redusert calnexin uttrykk dramatisk ved 15 ug /ml MFE i 22Rv1 celler (Fig. 3C). ER protein endoplasmatiske oxidoreductin-en (Ero1-la-) er en ER oksidase og oppregulert ved CHOP å øke nivåene av misfoldede proteiner [16]. MFE øket Ero1-metyleter av la på en doseavhengig måte (fig. 3C). MFE økte også en annen ER anstand, PDI på en doseavhengig måte (fig. 3C). Disse dataene viste at MFE økt uttrykk for ER stress anstand i prostata kreft celler.
Mangostan frukt ekstrakt indusert skjøtes XBP-en i prostatakreftceller
I løpet ER stress, X-box binding protein- 1 (XBP-1) mRNA undergår skjøte for å fremstille en transkripsjonsfaktor oppregulering UPR gener. Dermed har vi brukt RT-PCR for å påvise Spliced XBP-1 i MFE-behandlede 22Rv1 og LNCaP celler. Skjøtes og unspliced XBP-en cDNA ble både observert i behandlede celler med bare unspliced XBP-en cDNA i kontrollceller (fig. 4D).
22Rv1 og LNCaP celler ble behandlet med økende doser av MFE eller α-Mangostin i 24 timer. Cellelysater ble fremstilt og underkastet Western blot for å detektere ekspresjon av kritiske ER stressproteiner. [A], Expression of ER stressproteiner i økende doser av MFE-behandlede 22Rv1 og LNCaP celler. [B], spaltes caspase-4 nivåer i økende doser av MFE-behandlede 22Rv1 og LNCaP-celler. [C], Expression av flere ER anstand i økende doser av MFE-behandlede 22Rv1 og LNCaP celler. Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Disse resultatene er representanter fra tre uavhengige forsøk. [D], Øvre panel, skjematisk diagram av XBP-1 spleising under ER stress. Nedre panel, agarose-gel bilder av RT-PCR-produktene. 22Rv1 og LNCaP celler ble behandlet med 15 mg /ml MFE i 24 timer. Total RNA ble ekstrahert og underkastet RT-PCR. XBP-1primers spenner over skjøtes sekvensen ble brukt. RT-PCR-produktene ble kjørt på en 2% agarosegel. GAPDH ble brukt som kontroll.
Mangostan frukt ekstrakt selektivt indusert ER stress i prostata kreft celler mens sparsom ikke-kreft prostata epitelceller
Neste, vårt mål var å karakterisere den potensielle av MFE å fremme ER stress i ikke-kreftceller. Prostata epitelceller (PrECs) ble isolert fra prostatabiopsi på to prostatakreftpasienter som gjennomgår radikal prostatektomi. Celler ble dyrket til 60-70% konfluens og deretter behandlet med MFE. Interessant, 15 ug /ml av MFE betydelig redusert PERK ekspresjon i PrECs fra både pasienter, mens samme dose av MFE signifikant økt ekspresjon i PERK 22Rv1. Som nedstrøms protein regulert av PERK, hogge uttrykk økte ikke i MFE-behandlede PrECs, mens økt dramatisk i MFE-behandlede 22Rv1 celler (Fig. 5). Disse dataene viste at MFE selektivt fremmer ER stress /UPR i prostatakreftceller, men ikke i ikke-cancerous prostata epitelceller, noe som tyder på en differensial effekt på moduler ER stressproteiner i kreftceller versus ikke-kreftceller.
PrECs ble isolert fra pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi. Prøvene ble deretter anvendt for fremstilling av celler for behandling med læremidler. PrECs fra to forskjellige prostatakreftpasienter eller 22Rv1-celler ble behandlet med 15 ug /ml av MFE i 24 timer og deretter underkastet Western blot. Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Minus og pluss symboler representerer henholdsvis fravær og nærvær av indikerte agenter. Disse resultatene er representanter fra tre uavhengige eksperimenter.
Stabilitet av α-mangostin i mangostan frukt ekstrakt i nærvær av levermikrosomer
For å karakterisere omfanget av P450 metabolisme, α-mangostin og mangostanfruktekstrakt ble inkubert i nærvær av levermikrosomer fra mus og humane kilder. For denne spesielle eksperiment vi evaluert levermikrosomer som administrasjonen av studiet agent. Ved 30 minutter ble stabiliteten av α-mangostin i MFE funnet noe ned i mus og humane levermikrosomer med 30,8% og 17%, respektivt (figur 6A barer representerer standardavviket for gjennomsnittet, *
P
0,01. [E] Representanter for svulst bærende mus fra kontroll og MFE-behandlede gruppen.
Mangostan frukt ekstrakt vesentlig hemmet veksten av menneskelig prostata kreft celle 22Rv1 i atymiske nakne mus uten åpenbar toksisitet
For å undersøke MFE sin anticancer aktivitet
in vivo
, vi bygget xenograft mus modeller med 22Rv1 celler og behandlet dem med MFE eller kjøretøy. Sammenlignet med kontroll, 35 mg /kg av MFE signifikant hemmet tumorvekst (figur 6D . E). I mellomtiden ble observert noen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom MFE-behandlede gruppen og bilen-behandlede gruppen (Fig. 6C), noe som tyder på MFE har lav eller ingen toksisitet på en effektiv dose.
Diskusjoner
Mangostan (
Garcinia mangos
) frukt er rapportert å ha en rekke farmakologiske egenskaper, inkludert økende apoptotiske indekser i flere forskjell kreftcellelinjer [17], [18]. En rekke av polyfenoler som er kjent som xantoner som består av en tricylic aromatisk ringsystem sammen med ulike isoprenyl, hydroksy, eller metoksy-grupper har blitt isolert fra mangostan. Den mest tallrike xanthone er α-mangostin, en isoprenylated xanthone, som har fått mest oppmerksomhet for sine helsebringende egenskaper [9], [19] – [23]. Ved vurdering av frukt inkludert endocarp og exocarp sammen med løv, bark og røtter mer enn 60 forskjellige xantoner har vært isolert til dato fra mangostan. Vi har tidligere rapportert på anti-kreft-aktivitet av α-mangostin i prostatakreftceller og en atymiske nakne musemodell [9]. I denne tidligere studie observerte vi α-mangostin å hemme CyclinD1 /CDK4 og foreslå en mulig mekanisme for konkurrerende hemming i bindingssetet av CDK4. I den samme undersøkelsen vi også observert naken mus implantert med 22Rv1 celler for å vise en 65% mindre tumorvolumet etter daglig behandling med α-mangostin. I vår erfaring, så vel som andre etterforskere, er α-mangostin godt tolerert med noen rapporter om doser så høye som 200 mg /kg kroppsvekt ikke å bli assosiert med noen spesifikk toksisitet. Flere rapporter sammen med våre studier har observert α-mangostin å indusere apoptose, men hendelsene som inntreffer før apoptose er mindre forstått. Videre har vi nylig rapportert om den farmakokinetiske profilen til oralt administrert α-mangostin i mus, og har vist at fullstendig blodtelling (CBC), inkludert hvite blodceller med differensial ikke ble endret [24]. Av denne grunn begynte vi å utforske det endoplasmatiske retikulum som et potensielt mål for en svært preget mangostan ekstrakt ( 35% α-mangostin).
endoplasmatiske retikulum er ekstremt følsomme for endringer i omgivelsene, som har en direkte effekt på sin struktur, integritet og funksjon [1], [2]. Som kreft er fremmet og utvikler det er en økt etterspørsel på kravene i det endoplasmatiske retikulum som dokumentert av en økning i proteinsyntesen. Denne økte etterspørselen risikerer produksjon proteiner som utfoldet seg eller misfoldede. En viktig del av denne økte etterspørselen på proteinsyntesen er «utfoldet protein respons» som inkluderer ekstra fordel, CHOP og flere andre ER stressproteiner [25]. Som homeostase i ER er «gjenetablert», kan proteinene bli foldet på riktig måte eller undergå degradering som i sin tur vil tillate cellene å overleve. Hvis homeostase ikke er etablert av utfoldet protein respons eller blir forstyrret av en ekstern agent, vil disse cellene gjennomgå apoptose. Derfor tilnærminger for å øke ER stress relatert protein responsen kan være en attraktiv metode for å endre homeostase av ER i kreftceller for å fremme apoptose. Beviset av andre forskere, og selv tyder på at bruken av små molekyler som modulerer ER stress-proteiner kan også forsinke tumorutvikling, vekst, invasjon, for derved å tilveiebringe en ny terapeutisk strategi [26], [27].
ER stress er ikke bare favoriserer overlevelsen av kreftceller, men under spesielle situasjoner kan fremme apoptose. Naturlige stoffer, som for eksempel curcumin fra gurkemeie (
Curcuma longa
) har blitt rapportert å indusere pro-apoptotiske ER stress i human leukemi HL-60 celler ved oppregulering uttrykket av fosforylert ekstra fordel, CHOP, Bip og kløyvde caspase -4 [28]. I samsvar med dette, i vår studie etter behandling med MFE både 22Rv1 og LNCaP celler gjennomgå ER stress som gjenspeiles av en økning i ER stressproteiner inkludert ekstra fordel, CHOP, IRE1α, Bip og kløyvet caspase-4. CHOP er et veletablert nedstrøms ER stress /UPR protein og spiller en viktig rolle i ER stress-indusert apoptose [29]. Mekanismene som CHOP bidrar til apoptose inkludere hemme anti-apoptotiske Bcl-2 og opp regulerende GADD34 og Ero1α. Oppregulering av GADD34 og Ero1α vil forverre ER stress ved oversettelse utvinning og økt misfoldede proteinnivåer. I 22Rv1 celler, den mest dramatiske økningen av CHOP forekom ved doser på 15 ug /ml MFE. Tilfeldigvis calnexin, en ER membranprotein sikre riktig folding og kvalitetskontroll, falt bemerkelsesverdig ved 15 ug /ml MFE behandling. Dette tyder på at 15 mikrogram /ml MFE forårsaket et mulig sammenbrudd av kvalitetskontroll system av ER. Også ekstra fordel, IRE1 og Bip alle gjennomgikk en slående økning på 15 mikrogram /ml MFE behandling. Samlet utgjør disse data tyder på at 15 mikrogram /ml MFE kan være en ideell dose å presse ER stress fra pro-overlevelse til pro-apoptose i prostatakreftceller.
Neste skritt var å forstå hvis MFE vil resultatet i eR stress i ikke-kreftceller, eller om det synes å være en selektiv virkning mot kreftceller. For å forstå dette nærmere, ble prostata epitelceller isolert fra to mennesker som gjennomgår radikal prostatektomi. Effekten av MFE ble undersøkt på godartet prostata primære epitelceller (PrECs) og 22Rv1 celler. I motsetning til udødeliggjorte prostatacancercellelinjer behandlet med MFE, noe som resulterer i en økning i PERK aktivitet, PrECs viste en nedgang av fordel. Denne bifasisk respons avhengig av celletypen illustrerer ytterligere kompleksitet ER stress i prostata cancer karsinogenese. Til sammen tyder bevisene på at MFE selektivt målrette prostata kreft celler mens sparsom normale celler. Et ytterligere og mer detaljert forståelse av denne differensialeffekt vil være nødvendig.
Som vi har tidligere beskrevet α-mangostin ved oral administrering resulterte i en 65% mindre tumorceller i 22Rv1 [9]. I 22Rv1 implanterte mus behandlet med MFE ble det observert en 88% mindre tumorvolum sammenlignet med kontrollmus. Dosen anvendt i dette forsøk var 35 mg /kg av mangostan fruktekstrakt som er tilnærmet lik 12 mg /kg av α-mangostin. Å forstå hvis α-mangostin er den viktigste bestanddel av mangostan frukt ekstrakt 22Rv1-celler ble behandlet med 35 mg /kg og 70 mg /kg av α-mangostin. Behandlingsregimet med bare α-mangostin representerer en 300 til 600% økning i α-mangostin eksponering. Selv ved 70 mg /kg av α-mangostin, noe som resulterte i et 69% mindre tumor, den rene fytokjemisk var ikke så effektiv som MFE inneholdende 12 mg /kg av α-mangostin (upubliserte data). I ettertid, er dette ikke så overraskende som en blanding av fytokjemikalier blir ofte rapportert å ha en synergistisk virkning som er overlegen i forhold til de enkelte fytokjemikalier. Som dokumentert av vår kromatogram er det en rekke av xantoner stede i vår pakke, muligens større enn 20 ekstra xantoner, som kan være ansvarlig for den overlegne anti-kreft egenskaper av en mangostan ekstrakt i forhold til en person xanton.
akkumulering av kimlinje og /eller somatiske mutasjoner i «normale» celler resulterer i en manglende evne til å overvinne cellesyklus og apoptotiske sjekkpunkter derved resulterer i initiering av kreft. Som proliferasjonen av celler, øker en økt etterspørsel på protein maskineri av en celle må tilpasse seg gjennom forskjellige mekanismer, inkludert endoplasmatiske retikulum stress. I våre undersøkelser har vi observert mangostanfruktekstrakt standardisert til a-mangostin for selektivt å indusere ER stress i prostatakreftceller som korrelerer med en økning i apoptotiske indekser. Interessant, i normal prostata epitelceller anskaffet fra pasienter med høy risiko for å utvikle prostatakreft MFE er observert å redusere ER stress.
