Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en av de mest utbredte kreftformer globalt og er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall som følge av terapi motstand og metastasering. Forstå mekanismen bak kolorektal kreftutvikling er avgjørende for diagnostisering og behandling av CRC. microRNAs (mirnas) kan fungere som enten onkogener eller tumor dempere i mange kreftformer. En svulst suppressor rolle for Mir-27b har nylig blitt rapportert i neuroblastom, mens ingen informasjon om Mir-27b i CRC er tilgjengelig. I denne studien viste vi at Mir-27b uttrykk er redusert i de fleste CRC vev og fastslått at overekspresjon av Mir-27b undertrykker CRC celleproliferasjon, kolonidannelse og tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi identifiserte vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGFC) som en roman target gen av MIR-27b og fastslått at Mir-27b fungerte som en hemmer for tumorprogresjon og angiogenese gjennom målretting VEGFC i CRC. Vi videre fastslått at DNA hypermethylation fra Mir-27b CpG øyer synker Mir-27b uttrykk. I sammendraget, en anti-tumor rolle for Mir-27b og dens nye mål VEGFC
in vivo
kan føre til tumor nekrose og gi en begrunnelse for å utvikle Mir-27b som et terapeutisk middel.
Citation: Ye J, Wu X, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Z, et al. (2013) miRNA-27b Targets vaskulær endotel vekstfaktor C for å hemme tumorprogresjon og Angiogenese i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10,1371 /journal.pone.0060687
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 14 november 2012; Godkjent: 01.03.2013; Publisert: 12. april 2013
Copyright: © 2013 Ye et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China (nr 91019005) National, Foundation of China (No. Y2110034) Zhejiang Provincial Natural Science, 151 talent-prosjektet i Zhejiang-provinsen (HJ) og Science and Technology Bureau i Zhejiang-provinsen (No. 2011C37004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er rangert som den tredje vanligste kreftsykdommen i verden. Til tross for den kliniske gjennomføring av en rekke terapeutiske strategier, er det fortsatt en ledende årsakene til kreftrelaterte dødsfall som følge av terapi motstand og metastase [1] – [3]. Derfor forstå mekanismen underliggende kolorektal kreftutvikling er avgjørende for diagnostisering og behandling av CRC. Interaksjoner mellom svulster og stroma er anerkjent som kritiske komponenter for tumorprogresjon hos CRC [4]. Mer nylig er det bevis som indikerer at kjemokiner produseres i svulsten mikromiljøet som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), fibroblast vekstfaktor (FGF), og blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) spiller en avgjørende rolle i patogenesen av CRC økende [5], [6].
microRNAs (mirnas) er en klasse av små, endogent, ikke-kodende RNA, som spiller en viktig rolle i reguleringen av målgener ved komplementære i mRNA 3 «ikke-translatert region (3’UTR) som fører til translasjonsforskning undertrykkelse eller mRNA degradering [7]. mirnas er kjent for å virke i forskjellige biologiske prosesser, inkludert utvikling, celledeling, differensiering, apoptose, og kreft initiering eller progresjon [8], [9]. I kreft, kan mirnas fungere som enten et onkogen eller en svulst suppressor, som dokumentert av MIR-130b fremme leveren kreft stamceller (cscs) vekst og selvfornyelse via targeting TP53INP1 [10], MIR-34a hemme prostata kreft metastase ved direkte undertrykke CD44 [11], og MIR-7 å inhibere tumorvekst og metastase ved å påvirke den phosphoinositoide-3-kinase (PI3K) /AKT-reaksjonsveien i leverkreft [12]. Disse resultatene tyder på at det er av sentral viktighet for å klargjøre miRNA funksjoner, og reguleringskretser for å formulere terapeutiske strategier.
hypotese at molekyl forskjeller mellom cscs og differensierte kreftceller kan identifisere en nøkkel molekylet i tumorvekst og progresjon og i denne studien, undersøkte forskjeller i miRNA uttrykket mellom cscs og differensierte CRC celler ved hjelp av miRNA mikromatriser. Vi fant at MIR-27b ekspresjon blir vesentlig redusert i CSC-lignende celler og i CRC vev. MIR-27b er lokalisert på kromosom 9 og har vist seg å fungere som en tumor suppressor i neuroblastom via rettet mot peroksisom proliferator-aktivert reseptor γ (PPARy) [13]. Det har også blitt rapportert at MIR-27b, kan fungere som en angiogen bryter ved å fremme endotelisk celle spiss skjebne og spirende [14], [15]. Men de spesifikke funksjoner og potensielle mål fra Mir-27b i CRC cellene er uutforsket. Vi har bekreftet at vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGFC), som spiller en rolle i tumorprogresjon, er et nytt mål av MIR-27b. Et stort antall kliniske studier har vist at ved å øke ekspresjon av VEGFC i primære tumorer korrelert med øket spredning av tumorceller til regionale lymfeknuter i en rekke humane karsinomer [16] – [18]. Nylig, regulatoriske rolle VEGFC i å initiere og poten neo-angiogenese hadde blitt avdekket [19]. Vi har oppdaget at MIR-27b kan blokkere CRC celleproliferasjon, kolonidannelse og tumorvekst, og at den fungerer som en angiogenese-inhibitor ved å målrette VEGFC og nedregulere DNA hypermethylation. Forstå mekanismene som Mir-27b hemmer tumorvekst og angiogenese etablerer en sterk begrunnelse for sin utvikling som en terapeutisk anti-svulst agent.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne forskningen ble godkjent av Institutional Review styrene i Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine. Alle deltakerne ga skriftlig samtykke fra deres informasjon skal lagres på sykehuset database og brukes til forskning.
Alle Animal verk hadde blitt gjennomført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Denne forskningen ble godkjent av Institutional Review styrene i Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine.
Cellelinjer
Den menneskelige kolorektal kreft cellelinjer, SW620, SW480, RKO, HT29 og 293T ble kjøpt fra cellen bank i Kina Academy of Medical Science (Kina). SW620 og SW480 celler ble dyrket i Leibovitz L15-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco). RKO, HT29 og 293T-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) supplementert med 10% FBS. Alle celler ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
miRNA Expression microarray analyse
Total RNA ble isolert fra CD133
+ og CD133
– CRC celler ved hjelp TRIzol® reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Mengden og kvaliteten på RNA ble evaluert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo vitenskapelig, Worcester, MA, USA). Den miRNA uttrykket profilen til hver prøve ble vurdert ved hjelp av en Affymetrix miRNA array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).
Kvantitativ PCR analyse
Total RNA fra cellelinjer, friske CRC vev eller xenograft vev ble isolert ved anvendelse TRIzol® reagens (Invitrogen). Total RNA fra parafininnstøpte vev ble isolert ved RecoverAll ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og behandlet med RNase-fritt DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner . Mengden og kvaliteten på RNA ble evaluert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer. TaqMan miRNA uttrykk analyser (Applied Biosystems) ble brukt til å kvantifisere miRNA uttrykk ved hjelp av StepOnePlus ™ -system (Applied Biosystems). Alle prøver ble kjørt i triplikat, og MIR-27b nivåer i hver prøve ble normalisert til den av U6.
Proliferation Assay
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3 celler per brønn i en 96-brønners plate inneholdende 0,2-ml Leibovitz L15 medium med 10% FBS. MTS (3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -5- [3-carboxymethoxyphenyl] -2- [4-sulfofenyl] -2H- tetrazolium-salt) reagens (Promega, Madison, WI, USA) (20 ul ) ble tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. De absorbans verdier ble målt ved 490 nm på en mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og vurderes løpende i 7 dager.
Soft-agar Colony analysen
Celler ble sådd ved en tetthet på 300 per brønn på det øverste laget av 0,3% lavtsmeltende agarose (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 12-brønners plater med et bunnlag på 0,5% agarose i Leibovitz L15 medium inneholdende 10% FBS. Etter inkubering ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære inkubator i 2 uker ble kolonier inneholdende 20 celler visualisert under et invertert mikroskop og tellet.
tumorgenese Assay
Celler suspendert i 100 ul Leibovitz L15 medium ble implantert inn i baksiden av 4-ukers gamle hunn nakne mus for å vurdere deres evne til å initiere tumorxenografter. Tumorene ble målt hver uke, og deres volum beregnet som lengde x bredde x bredde /2.
MIR-27b terapi
SW620-celler (5 x 10
6) ble injisert inn i baksiden av 4 uker gammel kvinne NOD /SCID-mus, som alle er utviklet svulster i en uke med et volum på rundt 200 mm
3. Fem mus ble tilfeldig plassert i hver av den negative kontroll (NC) og MIR-27b-grupper. Alle mus ble intratumorally injisert med kolesterol-konjugert ligner (1 OD ligner /tid /mus) (GenePharma Tech, Shanghai, Kina) to ganger per uke og svulster måles hver 4. dag. Musene ble avlivet ved cervikal dislokasjon 5 uker etter den tiende injeksjon, og transplantable tumorer ble isolert og bedømt.
Immunofluorescens-analyse
Alle xenograft vevene ble formalin-fiksert og parafin-innleiret for seksjonering på en Leica mikrotom. Fire mikron snitt ble fremstilt og antigen gjenfinning utføres ved koking av prøvene i 15 minutter ved 100 ° C i 10 mmol /l natriumcitrat. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksidase i 20 minutter, og prøvene ble blokkert med PBS inneholdende 1% FBS. Polyklonalt kanin-anti-mus CD31 IgG (Abcam, Cambridge, MA, USA) ble fortynnet 1:200 og tilsettes som det primære antistoff; Prøvene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten. Prøvene ble deretter inkubert med det passende sekundære antistoff konjugert til fluorescein (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, Kina).
Luciferase Assay
pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression vektor (Promega ) inneholdt VEGFC mRNA 3’UTR av Mir-27b målområdet eller en mutert Mir-27b målområde (se Fil S1). PRL-TK plasmider (Promega) ble ko-transfektert inn i 293T-celler med enten den negative kontroll mimic (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «), MIR-27b mimic (5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′), eller anti-speil 27b ligne (5»-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 «) (GenePharma Tech, Shanghai, Kina) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Forholdet mellom firefly til
Renilla
luciferase aktivitet ble bestemt ved hjelp av Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) 48 timer etter transfeksjon i et luminometer.
Western blotting
Totalt protein var hentet fra celler lysert med M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo) supplert med cocktail av proteasehemmere (Sigma). Etter blokkering med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST) i 60 minutter, ble membranen inkubert med primære antistoffer anti-human-VEGFC (Cell signaleringsteknologi, Danvers, MA, USA) ( 1:2000) eller anti-human GAPDH (KangChen, Shanghai, Kina) oppløst i 5% bovint serum albumin i TBST natten ved 4 ° C.
klinisk CRC Sample Analysis
Prøvene ble samlet inn mellom 2008,1 og 2010,12 i Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine og bekreftet patologisk. Svulster ble iscenesatt ved hjelp av International Union Against Cancer (UICC) svulst staging system (tabell S1).
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). QPCR resultatene fra sammenkoblede kliniske prøver ble analysert av en to-tail paret Student
t
-test og de andre resultatene etter en to-tail uparede Student
t
-test.
P
verdier. 0,05 indikerte statistisk signifikans
Andre metoder
, inkludert celle sortering, plasmid bygging, etablering av MIR-27b, anti-MIR-27b, eller VEGFC knockdown (VEGFC-shRNA anti-Mir-27b stabile SW620 celler), ELISA, hematoxylin og eosin (HE) flekker, og metylering spesifikke polymerase kjedereaksjoner (MSP), er beskrevet i File S1.
Resultater
Mir-27b Levels Nedgang både i Colorectal cscs og de fleste kreft Vev
cscs spille en avgjørende rolle i kreftutvikling og er forbundet med tilbakefall, metastaser og terapi motstand [20] – [22]. En rekke overflatemarkører kan anvendes for cscs sortering, inkludert CD24, CD44, CD166 og CD133 [22]. Av disse er CD133 en god cscs markør for CRC [5], [22] – [25]. Vi observerte cscs eiendommer i CD133
+ SW620 celler (Figur S1) og utlignet miRNA uttrykk profiler i CD133
+ og CD133
– celler for å identifisere mirnas involvert i tumorprogresjon. Microarray analyse oppdaget fire oppregulert (MIR-1308, MIR-720, MIR-132-stjerne og MIR-181a-stjerne) og 14 nedregulert (MIR-27b, MIR-193b, MIR-595, MIR-27a- stjerne, MIR-1307, MIR-502-3p, MIR-652, MIR-200b, MIR-31, MIR-1247, MIR-200A, MIR-200b-stjerne, MIR-362-5p, MIR-210) mirnas i CD133
+ celler (figur 1A). Når disse resultatene ble kombinert med tidligere miRNA microarray data (data ikke vist), bare Mir-27b uttrykk skilte. Dette ble bekreftet av qPCR, som viste en 2,77 ganger endring i Mir-27b uttrykk i CD133
+
versus
CD133
-. Celler (figur 1B)
(A ) forskjellig uttrykt miRNA i CD133
+ og CD133
– celler. Red betegner høy og grønt betyr lave nivåer av uttrykk. (B) MIR-27b uttrykk i CD133
+ og CD133
– celler ble vurdert av qPCR. Y-aksen indikerer fold endring. (C) MIR-27b uttrykk vurderes av qPCR i friske CRC vev i forhold til tilstøtende normalt vev fra seks pasienter. Y-aksen indikerer fold endring. (D) MIR-27b uttrykk vurderes av qPCR i 80 sammen parafin-embedded CRC og tilstøtende normalt vev. MIR-27b nivåer var normalisert til U6 og uttrykt i form av terskelsyklusen (C
t) forhold. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
0,05, **
P
. 0,01
Vi har også målt Mir-27b uttrykk i CRC vevsprøver. I det begrensede antallet tilgjengelige friske vevsprøver (n = 6), MIR-27b-ekspresjon ble nedregulert 1.5 til 5.5-ganger i CRC-vev i forhold til tilstøtende normale vev (figur 1C). I et større antall sammenkoblede parafininnstøpte vev, Mir-27b til U6 terskel syklus (C
t) verdi ratio signifikant høyere i tumorvev, noe som indikerer lavere Mir-27b uttrykk i CRC (figur 1D). Egentlig qPCR data fra 80 paret parafin-embedded CRC og tilstøtende normalt vev viste at Mir-27b uttrykk gått ned i 60% CRC sammenlignet med 15% forhøyet. MIR-27b har nylig blitt rapportert å være en tumor suppressor i neuroblastom; dermed har vi fokusert resten av våre studier på å bestemme biologiske funksjoner og reguleringsmekanismer fra Mir-27b i CRC.
Mir-27b hemmer tumorvekst og Angiogenese i CRC
Vi etablerte både speil 27b og anti-Mir-27b SW620 stabile cellelinjer (se Fil S1) for å studere biologiske funksjoner av Mir-27b (figur 2A) ved å bestemme spredning og kolonidannelse
in vitro Hotell og tumorigenesis
in vivo
. Vi fant at overekspresjon av MIR-27b trykt celleproliferasjon, mens inhibering av MIR-27b gjennom stabil ekspresjon av et anti-MIR-27b svamp fremmet celleproliferering (figur 2B). En myk-agar koloni analysen indikerte at økt Mir-27b uttrykk betydelig forbudt koloni formasjon, kjent som selvfornyelse, mens anti-Mir-27b celler dannet større og større antall kuler enn den negative kontrollen (figur 2C og D). Enda viktigere, i en tumorigenesis analysen initiert ved subkutan injeksjon av 1 x 10
6 CRC celler, fant vi at Mir-27b kan sterk undertrykke tumorvekst, mens anti-Mir-27b fremmet vekst (Figur 2E og F).
(A) MIR-27b uttrykk i negativ kontroll (NC), ble Mir-27b og anti-Mir-27b SW620 cellelinjer vurderes av qPCR. Y-aksen indikerer fold endring. (B) Celleformeringshastigheten detekteres ved å måle absorbansen ved 490 nm i en MTS-assay. (C og D) Resultater av en soft-agar-kolonianalyse. Kolonier ble visualisert ved mikroskopi etter 2 ukers inkubering. Kolonier som inneholder 20 celler ble talt. Skala barer = 200 mikrometer. (E) Resultater fra en tumorigenesis analysen. Et representativt bilde av xenografttumorer i hårløse mus injisert subkutant med 1 × 10
6 CRC celler. (F) Sammenligning av xenograft formasjon
in vivo
. Tumor volum ble målt hver uke. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
. 0,05
Vi undersøkte videre anti-tumor effekt av Mir-27b
in vivo
i et menneske CRC-bærende mus modell. Musene ble randomisert til den negative kontrollen (NC) eller Mir-27b grupper, med fem mus per gruppe. Kolesterol-konjugert NC eller Mir-27b ligner ble injisert inn i svulster. To mus i NC gruppen døde etter 4 ukers behandling, Men dødsårsaken ble ikke bestemt. I MIR-27b gruppe, forsvant en xenograft etter 4 ukers behandling (figur 3A og B), mens de andre fire xenografter var myk å ta på og alvorlig tumor nekrose ble observert ved patologisk undersøkelse (Figur 3C). Immunfluorescens analyser viste at xenografter i Mir-27b gruppen hadde mindre kapillære blodårer enn de i NC-gruppen (Figur 3D), og qPCR resultatene bekreftet at Mir-27b nivåene ble forhøyet betydelig i Mir-27b xenografter (Figur 3E). Alle disse funnene støtter en svulst undertrykkende rolle for Mir-27b i CRC og foreslå sitt potensial som en anti-CRC narkotika.
(A og B) Colorectal cancer (CRC) peiling NOD /SCID mus ble intratumorally injisert med kolesterol-konjugert negativ kontroll (NC) eller Mir-27b etterligner. Skorper ble observert i fire svulster fra Mir-27b gruppe (fine pil). En svulst fra Mir-27b gruppe forsvant helt med bare en skorpe resterende (tykk pil). (C) Hematoxylin og eosin (HE) farging av xenograft vev viser nekrotiske områder i Mir-27b gruppe. (D) En representativ immunofluorescens-analysen viser CD31-protein i xenograft vev fra NC og MIR-27b (n = 3). Skala barer = 200 mikrometer. (E) MIR-27b uttrykk i xenografter fra NC og Mir-27b ligner ble vurdert ved qPCR. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
. 0,05
VEGFC er en roman Target of Mir-27b i CRC
mirnas funksjon først og fremst som formidlere av genet Slå. Mål fra Mir-27b i CRC ble deretter analysert ved hjelp av data spådd fra TargetScan database (www.targetscan.org). Hundrevis av predikerte Mir-27b målene ble utsatt for ytterligere berikelse analyse av cellesignalveier ved hjelp av Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) pathway database (www.genome.jp/kegg/). Ved bruk av denne tilnærmingen, ble MIR-27b forutsagt å målrette kreft-relaterte signalveier inkludert VEGF, Wnt og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK). Til syvende og sist, fokuserte vi på VEGF signale siden Wnt og MAPK ikke var åpenbart påvirket i CRC (data ikke vist). Vi videre identifisert VEGFC som en funksjonell nedstrøms mål for Mir-27b. Den VEGFC 3’UTR inneholder svært konservert Mir-27b bindingsseter (figur 4A) som reagerer på Mir-27b i en dual luciferase reporter analysen. Vi fant at aktiviteten til en luciferase reporter inneholder VEGFC 3’UTR redusert med ~70% ved kotransfeksjonen med Mir-27b etterligne, men økte med ca. 100% ved kotransfeksjonen med anti-Mir-27b ligne. Videre ble ingen endring identifisert ved co-transfeksjon av mutant reporter plasmid med enten Mir-27b eller anti-Mir-27b ligner (figur 4B). VEGFC proteinnivåer ble også redusert i celler og kulturmedium ved transfeksjon med en MIR-27b ligner, mens VEGFC nivåer de øket ved transfeksjon av et anti-MIR-27b mimic (figur 4C og D).
In vivo
, VEGFC protein nivåene var lavere i Mir-27b xenografter sammenlignet med i NC-gruppen (Figur 4E).
(A) VEGFC er spådd som en roman mål fra Mir-27b . (B) 293T celler ble ko-transfektert med tomme pmirGLO Dual-luciferaserapportørplasmid plasmider eller VEGFC 3’UTR ildflue luciferase reporter plasmider og PRL-TK-luciferase plasmider, sammen med Mir-27b etterligner eller anti-Mir-27b. Etter 48 timer, ildflue luciferase-aktiviteten ble målt og normalisert til den av Renilla luciferase. (C) CRC celler ble transfektert med NC, Mir-27b eller anti-Mir-27b ligner og uttrykk for VEGFC ble oppdaget av western blotting. (D) CRC celler ble transfektert med NC, Mir-27b eller anti-Mir-27b ligner og VEGFC i kulturmediet ble oppdaget av ELISA. (E) VEGFC protein i xenografter fra negativ kontroll (NC) og Mir-27b ligner ble oppdaget av western blotting. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
. 0,05
VEGFC Spiller av Tumor fremmende rolle i CRC
Mange studier har rapportert at VEGFC korrelerer med tumorvekst og metastase i en rekke kreftformer, inkludert CRC [16] – [18]. Vi etablerte VEGFC-knockdown anti-Mir-27b SW620 celler gjennom uttrykk for en hemmende shRNA (se Fil S1) (figur 5A). VEGFC-knockdown trykt celleproliferasjon sammenlignet med NC-celler (Figur 5B), betydelig hemmet kolonidannelse (Figur 5C og D) og redusert tumorvekst (figur 5E og F). Sammen er disse observasjonene sterkt at VEGFC spiller rolle i å stimulere spredning og fremme tumorigenesis i CRC. Selv om det er et sett med predikerte Mir-27b mål, VEGFC som en funksjonell nedstrøms mål for Mir-27b kan fullt ut bekreftet i våre forsøk.
(A) VEGFC knockdown i anti-Mir-27b stabile celler var bekreftet av western blotting. (B) Celleformeringshastigheten ble bestemt ved å måle absorbansen ved 490 nm i en MTS-assay. (C og D) Resultater av en soft-agar-kolonianalyse. Kolonier ble visualisert ved mikroskopi etter 2 ukers inkubering. Kolonier som inneholder 20 celler ble talt. Skala barer = 200 mikrometer. (E) Resultater av en tumorigenesis analysen. Et representativt bilde av xenografttumorer i nakne mus subkutant injisert med 1 x 10
6 CRC celler. (F) Sammenligning av xenograft formasjon
in vivo
. Tumor volum ble målt hver uke. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
. 0,05
DNA Hypermethylation Reduserer Mir-27b Expression
Både transkripsjons og epigenetiske trasé regulere genuttrykket . Epigenetiske mekanismer omfatter DNA metylering, histon acetylering og ikke-kodende RNA [26]; stanse av noen mirnas er assosiert med CpG øy hypermethylation i en rekke kreftformer [27] – [29]. For å avgjøre om epigenetiske mekanismer mediert Mir-27b funksjon, dyrket vi celler i nærvær av histondeacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) eller metyltransferase hemmer 5-aza-DC (5AZA) (Calbiochem, San Diego, CA, USA). MIR-27b nivået uendret i celler dyrket med en nmol /ml TSA i 3 dager. Men behandling med 5 nmol /ml 5AZA markert forhøyet Mir-27b uttrykk (Figur 6A). Disse resultatene tyder på at DNA hypermethylation spiller en viktig rolle i reguleringen av MIR-27b. Den antatte arrangøren stedet av MIR-27b i kromosom 9 ble klonet inn en luciferase vektor (se Fil S1) og verifisert ved hjelp av luciferase analyser (Figur 6b). MSP resultater indikerte MIR-27b CpG øy hypermethylation i flere CRC-cellelinjer (figur 6C).
(A) Konsentrasjonene av MIR-27b ekspresjon i kolorektal cancer (CRC) cellelinjer ble bestemt ved qPCR etter behandling med 5AZA eller TSA i 3 dager. (B) Resultater av luciferase aktivitetsanalyser etter transfeksjon med den anslåtte Mir-27b promoter normalisert til PRL-TK Renilla luciferase. (C) MSP-analyse av MIR-27b CpG øy i et sett CRC-cellelinjer. Band i «M» baner er PCR produktene oppnådd ved bruk av metylering spesifikke primere og de i «U» baner er produkter fremstilt ved hjelp unmethylated spesifikke primere.
Diskusjoner
cscs hypotese har vært påvist i en rekke forskjellige faste tumorer [20], [21], og den nåværende litteratur er fokusert på rollen til mirnas i human cancer. mirnas anses å ha utbredt regulerende aktivitet i et bredt spekter av utviklingsprosesser og er innblandet i ulike sykdommer, inkludert kreft [8].
Vi har søkt å undersøke funksjonen av miRNAs i CRC. Vi antok at de molekylære forskjeller mellom cscs og differensierte kreftceller kan identifisere nøkkelmolekyl ansvarlig for tumorvekst og progresjon. Begge
in vitro Hotell og
in vivo
undersøkelser fastslått at CD133
+ celler i CRC kunne klassifiseres som cscs-lignende celler basert på deres stamcelleegenskaper. Dette cscs modellen ble benyttet for å undersøke og identifisere 18 forskjellig regulerte miRNAs. MIR-27b var den eneste miRNA identifisert flere ganger i disse forsøkene; ingen informasjon om hvilken rolle denne miRNA i CRC har blitt rapportert. Vi fant at MIR-27b ikke påvirker CRC stamcelledifferensiering ved å forandre ekspresjon av stamcelle-assosierte gener
Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1
(data ikke vist). Videre studier viste redusert Mir-27b uttrykk i de fleste CRC vev.
Vi neste undersøkt funksjonen av MIR-27b i CRC og viste at det kunne gi en betydelig undertrykke selvfornyelse
in vitro Hotell og tumorigenicity
in vivo
. Videre identifiserte vi VEGFC som en funksjonell nedstrøms mål for Mir-27b ved hjelp av flere metoder. Så vidt vi vet, er dette den første studien for å rapportere spesifikk funksjon og en roman funksjonell mål fra Mir-27b i CRC. VEGFC hører til blodplate-avledet vekstfaktor-familie og dets ekspresjon korrelerte signifikant med dårligere histologisk karakter, lymfatisk invasjon og venøs invasjon [16] – [18], [30], og nyere bevis antyder den har en viktig rolle i angiogenese. [19], [31] Flere nyere studier rapporterer at autokrint regulering av kreft celler migrasjon via VEGFC /VEGFRs er en viktig induktor av tumor celleproliferasjon, invasjon og metastasering. [30] Det er også nye bevis som støtter en antatt rolle for mirnas som tumor suppressors eller onkogener som kan føre til målrettede kreft behandlingsstrategier [32], [33]. MIR-34a har potent antitumoreffekter i tumorer og prostata kan representere et terapeutisk middel for prostatacancer [11]. Intratumoral injeksjon av kolesterol-konjugert MIR-199A /b-3p ligner hemmet tumorvekst og redusert serum AFP nivåer i leverkreft [34]. Ondartede celler er avhengig av avvikende miRNA uttrykk; disse små RNA gir viktige muligheter for utvikling av fremtidige miRNA-baserte terapier [30], [35], [36]. På grunn av de alvorlige bivirkninger av tradisjonell kjemoterapi, forskning på andre metoder for CRC behandling, som genterapi, er tiltalende.
Tumor angiogenese er avgjørende for tumorvekst og vedlikehold, og mange studier har vist at angiogenese inhibitorer kan gi en signifikant terapeutisk fordel [37], [38]. Her rapporterer vi at alvorlig nekrose ble observert i xenografter fra Mir-27b ligner, som også utviklet færre kapillære blodårer enn NC-gruppen, og i en xenograft helt forsvunnet med resten bare en skorpe. Disse data viser anti-tumor effekt av Mir-27b
in vitro Hotell og
in vivo
, noe som tyder på MIR-27b for å være et lovende mål for CRC behandling etter effekt og sikkerhet av genterapi er bestemt.
de som er involvert i regulering av transkripsjon mekanismer er variert, og mens de underliggende miRNA feilregulering i kreft ikke er ennå ikke fullt ut forstått, har miRNA-mediert promoter hypermethylation blitt identifisert i majoriteten av svulster. Vi fant ut at Mir-27b mediert genet Slå i CRC skyldtes reversibel hypermethylation av CpG øyer og ikke histone acetylering.
veksten av blodkar er avgjørende for kreft vekst og reparasjon. Nyere bevis indikerer at tumorangiogenese kan bli indusert ved cscs grunn av angiogen faktor-ekspresjon i tumormikromiljøet [37], [39]. Anti-angiogenese behandling rettet mot VEGF kan utarme svulsten blodkar og ablate selvfornyende cscs [37], [40]. Våre data viser at Mir-27b utspring i cscs fra CRC og fungerer som en viktig tumor suppressor og angiogen faktor ved å målrette VEGFC. Videre studier av cscs eller angiogenese vil lette utviklingen av romanen kreft terapeutiske strategier. miRNA-baserte terapeutiske strategier kan også føre til bedre forvaltning av svulster i ikke altfor fjern fremtid [41], [42]. Disse resultatene ikke bare gi rom for en bedre forståelse av mekanismene som regulerer CRC celler, men også legge til rette for en gradvis utvikling av mer effektive kreftbehandlingen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
CD133 + SW620 celler utstillingen kjennetegn cscs
in vitro Hotell og
in vivo
. (A) Strømningscytometri dot plot som viser fordelingen av CD133
+ -celler i CRC-cellelinjen SW620. (B og C) Resultater av en soft-agar-kolonianalyse. Kolonier ble visualisert ved mikroskopi etter 2 ukers inkubering og de inneholdende 20 celler ble tellet. Skala barer = 200 mikrometer. (D) Resultater fra en tumorigenesis assay. Et representativt bilde av xenografttumorer i naken mus som ble injisert subkutant med 5 × 10
4 CD133
– eller CD133
+ SW620 celler. (E) Sammenligning av xenograft formasjon
in vivo
. Tumor volum ble målt ukentlig. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *
P
0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0060687.s001 plakater (TIF)
Fil S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0060687.s002 plakater (DOC)
Tabell S1.
Clinicopathological funksjonene CRC pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0060687.s003 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Dr Zhong Shi for språkvask .
