Abstract
Forrige rapport viste at epidermal vekstfaktor (EGF) fremmer tumorprogresjon. Flere studier har vist at vekstfaktorer kan indusere heme oxygenase (HO) -1 uttrykk, beskytte mot celleskader og kreft celledeling. I denne studien undersøkte vi involvering av c-Src, NADPH oksidase, reaktive oksygenforbindelser (ROS), PI3K /Akt, og NF-kB signalveier i EGF-indusert HO-1 uttrykk i humane HT-29 tykktarm kreft celler . Behandling av HT-29 celler med EGF forårsaket HO-1 for å bli uttrykt i treringstrinnet og tidsavhengige oppførsel. Behandling av HT-29 celler med AG1478 (en EGF-reseptor (EGFR) inhibitor), liten interfererende RNA av EGFR (EGFR siRNA), en dominant negativ mutant av c-Src (c-Src DN), DPI (en NADPH oksidase inhibitor) , glutation (en inhibitor ROS), LY294002 (et PI3K-inhibitor), og en Akt DN inhiberte EGF-indusert HO-1-ekspresjon. Stimulering av celler med EGF forårsaket en økning av c-Src-fosforylering ved Tyr406 i en tidsavhengig måte. Behandling av HT-29 celler med EGF indusert en økning i P47
phox
trans fra cytosol til membraner. EGF-indusert ROS produksjonen ble hemmet av DPI. Stimulering av celler med EGF resulterte i en økning i fosforylering Akt ved Ser473, som ble inhibert av c-Src DN, DPI, og LY 294002. Videre behandling av HT-29 celler med et dominant negativ mutant av IkB (IκBαM) inhiberte EGF indusert HO-1 uttrykk. Stimulering av celler med EGF-indusert p65 translokasjon fra cytosol til kjerner. Behandling av HT-29 celler med EGF induserte en økning i kB-luciferase-aktivitet, som ble inhibert med en c-Src DN, LY 294002, og en Akt DN. Videre EGF-indusert koloncancer celleproliferasjon ble inhibert med Sn (IV) protoporfyrin-IX (SNPP, en HO-1-inhibitor). Tatt sammen tyder disse resultater på at c-Src, NADPH oksidase, PI3K, og Akt signalveier spiller viktige roller i EGF-indusert NF-kB-aktivering og HO-1-ekspresjon i HT-29 celler. Videre overekspresjon av HO-1 medierer EGF-indusert tykktarmskreft celleproliferasjon
Citation. Lien GS, Wu MS, Bien MY, Chen CH, Lin CH, Chen BC (2014) epidermal vekstfaktor Stimulerer Nuclear Factor -κB Aktivering og Heme oxygenase-1 Expression via c-Src, NADPH oksidase, PI3K, og Akt i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 9 (8): e104891. doi: 10,1371 /journal.pone.0104891
Redaktør: Chuen-Mao Yang, Chang Gung University, Taiwan
mottatt: 25 mars 2014; Godkjent: 29 juni 2014; Publisert: 14. august 2014
Copyright: © 2014 Lien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er inkludert i papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd (101TMU-WFH-02-1, 102TMU-WFH-01-1, og 103TMU-WFH-02-1) fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om lag en million tilfeller av tykktarmskreft er diagnostisert på verdensbasis hvert år, og en økende trend i forekomsten av tykktarmskreft i asiatiske land ble rapportert i de senere år [1]. Tidligere rapporter viste at inntaket av rødt og bearbeidet kjøtt er assosiert med økt risiko for tykktarmskreft fordi rødt kjøtt inneholder omtrent 10 ganger høyere nivåer av heme enn hvitt kjøtt [2]. Heme oxygenase (HO) spiller viktige roller i fysiologiske jern homeostase, antioksidantforsvar og kreft celle spredning [3]. HO katalyserer omdannelsen av heme å biliverdin, slippe ekvimolare mengder karbonmonoksid, og samtidig induksjon av jern-sequestering ferritin [4]. Tre isoformer av HO (HO-1, -2 og -3) ble identifisert [5]. HO-1 er et induserbart enzym forårsaket av vekstfaktorer inkludert transformerende vekstfaktor (TGF) -β og epidermal vekstfaktor (EGF), som gjenspeiler den viktigste rolle av dette enzymet ved beskyttelse mot oksidativ skade [6], [7]. Videre HO-1 er ofte sterkt oppregulert i tykktarmskreft i forhold til omkringliggende normalt vev, noe som tyder på at kreftceller sterkt uttrykker HO nyte en vekstfordel og gi cellular motstand mot reaktive oksygenforbindelser (ROS) medierte kreft terapier [8] – [10 ].
betydningen av EGF i utviklingen av tykktarmskreft ble understreket i de siste årene [11]. En voksende mengde bevis tyder på at EGF regulerer flere biologiske funksjoner som kreft celle progresjon, celleproliferasjon, og metastase [11]. EGF-reseptor (EGFR) ble vist å delta i tykktarmskreftutvikling [11]. EGF binder til det ekstracellulære domene av EGFR som aktiverer nedstrømssignalbaner blant de c-Src og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt trasé [12], [13]. En tidligere rapport indikerte at overekspresjon av HO-1 spiller en beskyttende rolle i å dempe celleskader og kreft celle overlevelse [6], [7]. Men lite er kjent om hvordan EGF regulerer induksjon av HO-1 protein uttrykk.
Uttrykk for
HO-1
genet reguleres primært på transkripsjonsnivå ved å aktivere transkripsjonsfaktorer, inkludert atom faktor (NF) -κB, aktiverende protein (AP) -2, og den varmesjokk-responsive element (HSE) [14], [15]. NF-kB er en viktig faktor for regulering av transkripsjon HO-1-ekspresjon [16]. I hvile, NF-kB-binding til IκBα forhindrer NF-kB nukleær translokasjon og transkripsjonsaktivitet [17]. Men vekstfaktorer indusere IKB kinase (IKK) aktivering, IκBα fosforylering, og IκBα degradering. Denne prosessen frigjør aktiv NF-kB, som deretter translokaliseres fra cytosol til kjerner, for å binde HO-1-promoter-regionen og indusere
HO-1
genekspresjon [16], [18]. Flere rapporter har vist at EGF-indusert NF-kB-aktivering skjer gjennom flere EGFR-avhengige signaliseringsmolekyler, inkludert PI3K, protein kinase C (PKC), og IKK signalveier [19]. Vår tidligere studie viste at TGF-β indusert HO-1-ekspresjon via PI3K /Akt-avhengig NF-kB signalveien [6]. Men lite er kjent om signaltransduksjon hendelse; Spesielt, blir c-Src, NADPH oksidase, ROS, og PI3K /akt veier, noe som fører til aktivering av NF-kB og ekspresjon av HO-1 av EGF stimulering, ikke godt beskrevet.
Flere studier har vist at c-Src og NADPH oksidase spille viktige roller i å indusere genekspresjon [20], [21]. En tidligere rapport viser at trombin induserte HO-1-ekspresjonen og var avhengig av c-Src-mediert NF-kB-aktivering [20]. Det ble nylig oppdaget at NADPH oksidase generasjon av ROS produksjon er en defensiv reaksjon av en vert til apoptose og celletransformasjon [22]. NADPH oksidase er regulert av P47
phox
som er i stand til å støtte aktivering av NADPH oksidase [23]. Det er kjent at EGF stimulerer NADPH oksidase aktivitet for å produsere superoksyd, og den genererte superoksid hurtig dismutated til H
2o
2, noe som fører til EGF-induserte fysiologiske responser [24]. Imidlertid er lite informasjon tilgjengelig om rollen til NADPH oksidase i regulering av NF-kB-aktivering og HO-1-ekspresjon etter EGF-stimulering i humane tarmkreftceller. Våre funn viste at EGF aktivering av c-Src, NADPH oksidase, ROS, og PI3K /Akt signalveier som fører til aktivering av NF-kB spiller en viktig rolle i EGF-indusert HO-1-ekspresjon i humane lungekolonkreftceller. Videre HO-1 er involvert i EGF-indusert tykktarmskreft celleproliferasjon.
Materialer og metoder
Material
EGF ble hentet fra Peprotech (London, UK). LY 294 002, diphenyleneiodonium klorid (DPI), glutation, og 2 «, 7»-dichloroflurorescein diacetat (DCF-DA) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). En dominant negativ mutant (DN) IκBα (IκBαM) ble kjøpt fra Clontech (Mountain View, CA, USA). pGL2-ELAM-Luc (som er under kontroll av en NF-kB bindingssetet) og PBK-CMV-Lac Z ble vennlig levert av Dr. Wan-Wan Lin (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). En DN av Akt (Akt DN) ble vennlig levert av Dr. Che-Ming Teng (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). Den pcDNA plasmid ble gitt av Dr. M.-C. Chen (Taipei Medical University, Taipei, Taiwan). En c-Src DN ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, NY, USA). Føtalt kalveserum (FCS), penicillin /streptomycin, og Lipofectamine Plus reagens ble kjøpt fra Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Sn (IV) protoporfyrin-IX (SNPP) ble kjøpt fra Frontier Scientific (Logan, UT, USA). Styr lite forstyrrende (si) RNA, EGFR siRNA, og antistoffer som er spesifikke for HO-1, c-Src, P47
phox
, akt1 /2, EGFR, Na
+ /K
+ ATPase, p65, IκBα, og anti-mus og anti-kanin immunglobulin G (IgG) konjugert pepperrot peroxidases (HRPs) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX, USA). Akt fosforylert ved Ser473 og c-Src fosforylert ved Tyr416 ble anskaffet fra New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Lamin A /C ble kjøpt fra GeneTex (Ipswich, CA, USA). AG1478 og BrdU-celleproliferasjon analysesett ble kjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Alle materialer for natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA).
Cell kultur
HT29 menneskelige tykktarmskreftceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Livingstone, MT, USA), og cellene ble opprettholdt i RPMI 1640 inneholdende 10% FCS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet 37 ° C inkubator. Etter å ha nådd konfluens, ble cellene sådd ut på 6-cm retter for Western blotting og en revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR), på 12-brønners plater for celle transfeksjon og den kB-luciferase aktivitetsanalyse, og på 96-brønners plater for BrdU celleproliferasjon og ROS generasjon analyser.
Western blot analyse
for å finne uttrykk for HO-1, c-Src fosforylert ved Tyr416, Akt fosforylert ved Ser473, c-Src, akt1 /2, og EGFR i HT-29-celler, proteiner ble ekstrahert, og en Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [6]. I korthet, HT-29 celler ble dyrket i 6 cm retter. Etter å ha nådd konfluens, ble vekstmediet fjernet og erstattet med 2 ml RPMI 1640 uten FCS i 24 timer. Cellene ble behandlet med bilen og EGF, eller forbehandlet med spesifikke hemmere som indikert fulgt av EGF. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger i iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og oppløst i lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris (pH 7,0), 140 mM NaCl, 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 5 mM ditiotreitol, 0,5% NP-40, 0,05 mM pepstatin A, og 0,2 mM leupeptin. Prøver av like mengder av protein (50 ug) ble underkastet SDS-PAGE, og deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran som deretter ble inkubert i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween-20 (TBST) buffer inneholdende 5% bovint serum albumin. Proteiner ble gjort synlige ved spesifikke primære antistoffer, og deretter inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Den immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence følge produsentens instruksjoner. Kvantitative data ble oppnådd ved hjelp av en data densitometer med vitenskapelige bildesystemer (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
RNA ekstraksjon og RT-PCR
For å forsterke menneskets tykktarm kreft celle HO 1 mRNA, spesifikke primere ble syntetisert. De HO-1 primere som ble brukt var: følelse 5′-CTG TGT AAC CTC TGC TGT TCC-3 «og antisense 5′-CCA CAC TACCTG AGT CTA CC-3». p-aktin mRNA-nivåer ble anvendt som en intern kontroll. P-aktin-primere som ble anvendt var: forstand 5′-GAC TAC CTC AAG ATC CT-3 «og antisense 5′-CCA CTG CTG CAT GAA GGT GG-3». HT-29 celler ble sådd ut på 6-cm skåler. Etter å ha nådd konferansen, ble mediet aspirert og erstattet med basalmedium blottet for FBS over natten, hvoretter cellene ble stimulert med EGF for ulike tidsintervaller. Total RNA ble renset ved anvendelse av TRI reagens (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA), og en RT-PCR utført ved anvendelse av et RT-PCR-kit (Epicentre, Madison, WI, USA), ifølge produsentens instruksjoner, ved hjelp 10 ul av total-RNA som et templat. Like mengder (10 pg cDNA) av hver PCR-produkt ble PCR-amplifisert med Tag-polymerase i 35 sykluser bestående av 30 sekunder ved 95 ° C, 30 s ved 58 ° C, og 1 min ved 72 ° C. Det amplifiserte cDNA ble kjørt på 2% agarosegeler og visualisert med etidiumbromid. RT Prøvene ble også brukt for å generere β-aktin PCR-produktene og deres mengde ble anvendt som en intern kontroll.
Transfeksjon og den kB-luciferase-assay
HT-29-celler (2 x 10
5) ble sådd ut på 12-brønners plater, og cellene ble transfektert ved å bruke den følgende dag Lipofectamine Plus reagens inneholdende 0,5 ug pGL2-ELAM-Luc og 0,5 ug av pBK-CMV-Lac Z. Etter 24 timer ble mediet ble aspirert og erstattet med friskt RPMI 1640 uten FCS, og deretter ble cellene stimulert med EGF (0.3~10 ng /ml) i ytterligere 24 timer før den ble høstet. For å vurdere virkningene av de angitte inhibitorer, ble legemidler tilsatt til cellene 20 minutter før tilsetning av EGF. For å vurdere virkningene av c-Src og DN DN Akt, ble celler transfektert med pGL2-ELAM-Luc og PBK-CMV-Lac Z. Luciferase-aktivitet ble bestemt med en luciferase-analysesystemet (Promega, Madison, WI, USA), og ble normalisert på basis av Lac Z uttrykk. Nivået av induksjon av luciferase aktivitet ble sammenlignet som et forhold mellom celler med og uten stimulering.
Analyse av P47
phox
trans
For å oppdage P47
phox
trans, cytosoliske og membran fraksjoner ble separert som beskrevet tidligere [25]. I korthet, HT-29 celler ble behandlet med EGF for de angitte konsentrasjoner, eller for de forskjellige tidsintervaller. Etter inkubering ble cellene plassert på is, vasket med PBS, resuspendert i homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, og 10 ug /ml leupeptin (pH 7,5) ) og ultralydbehandlet. Lysatet ble separert i cytosoliske og membranfraksjoner ved sentrifugering ved 40.000 x
g
i 45 minutter. Nivåer av P47
phox
protein i cytosoliske og membranfraksjoner ble bestemt ved en Western blot-analyse. α-tubulin og Na
+ /K
+ ATPase ble henholdsvis brukt som interne kontroller av cytosoliske og membranfraksjoner.
Analyse av p65 trans
For å oppdage p65 trans , HT-29 celler ble behandlet med EGF for de angitte konsentrasjoner, eller for de forskjellige tidsintervaller. De cytosoliske og kjerneproteinfraksjoner ble så separert som tidligere beskrevet [25]. Kort sagt ble HT-29-celler ble vasket med iskald PBS og pelletert. Cellepelletene ble resuspendert i hypotonisk buffer (10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 10 mM aprotinin, 10 mM leupeptin, og 20 mM PMSF) i 15 minutter på is, og vortex-blandet i 10 sek. Kjerner ble pelletert ved sentrifugering ved 15.000 x
g
i 1 min. Supernatanter inneholdende cytosoliske proteiner ble oppsamlet. En pellet inneholdende kjerner ble resuspendert i hypertonisk buffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 25% glycerol, 1,5 mM MgCl
2, 4 mM EDTA, 0,05 mM DTT, 10 mM aprotinin, 10 mM leupeptin, og 20 mM PMSF ) i 30 minutter på is. Supernatanter inneholdende nukleære proteiner ble oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 x
g
i 2 min. Protein nivåer av p65 i den cytosoliske og atom fraksjoner ble bestemt ved Western blot-analyse. α-tubulin og Lamin A /C ble henholdsvis brukt som cytosol og atom internkontroll.
Fastsettelse av ROS produksjon
ROS ble bestemt som beskrevet tidligere [26]. Kort sagt ble HT-29-celler sådd ut på 96-brønners plater i RPMI 1640 inneholdende 10% FCS over natten. Den neste dag ble mediet aspirert og erstattet med friskt RPMI 1640 blottet for FCS. Etter 24 timer ble cellene behandlet med den ROS-sensitive DCF i 15 minutter, og deretter stimulert med EGF for indikerte konsentrasjoner eller i forskjellige tidsintervaller. Å analysere effekten av DPI (10 pM), ble medikamentet satt til cellene 20 minutter før tilsetning av EGF. Fluorescens ble bestemt med en Varioskan Flash fluorescens plateleser (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, USA) med eksitasjon ved 485 nm og emisjon ved 528 nm.
BrdU celleproliferasjon analysen
HT -29-celler (7,5 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut på 96-brønners plater i RPMI 1640 inneholdende 10% FCS. Den neste dag ble mediet aspirert og erstattet med friskt RPMI 1640 blottet for FCS over natten. Celler ble forbehandlet med SNPP (3 uM) i 20 minutter, og deretter stimulert med EGF (10 ng /ml) i en annen 48 timer. BrdU ble tilsatt til cellene i løpet av de siste 2 timers inkubering. Etter fjerning av merking medium, ble cellene fiksert og DNA ble denaturized. Den inkorporerte BrdU ble merket med et monoklonalt anti-BrdU-antistoff og et geite-anti-muse antistoff konjugert med peroksydase. Immunkompleksene ble påvist ved etterfølgende reaksjon substratet og kvantifisert ved å måle absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser.
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet ( SEM) fra minst tre uavhengige eksperimenter. En enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av, når det passer, ble Dunnetfs multiple sammenligninger-test benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellen mellom middel. En
p
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
EGF induserer HO-1 uttrykk i HT-29 celler
Mange studier viser at HO-1 uttrykk spille en viktig beskytte aganist kreftcelledød. Menneske HT-29 tykktarm kreft celler ble valgt å undersøke signalveier av EGF i HO-1 uttrykk. Behandling med EGF (1~10 ng /ml) i 18 timer induserte HO-1-protein ekspresjon i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1A.); denne induksjon forekom også i en tidsavhengig måte, begynnende ved 8 timer og nådde et maksimum ved 12~18 h (fig. 1B). Etter 18 timers behandling med 10 ng /ml EGF, hadde HO-1-protein har økt med 185 ± 11% (fig. 1B). Deretter fant vi ut om EGF kan indusere HO-1 mRNA uttrykk. Etter behandling hadde induksjon av HO-1 mRNA påbegynt i 2 timer og nådde et maksimum ved 4 timer etter EGF (10 ng /ml) behandling (Fig. 1C). Som tidligere nevnt, er nødvendig for EGF responser EGFR. For å undersøke hvorvidt den EGFR er involvert i EGF-indusert HO-1-ekspresjon, ble AG1478 anvendt. Figur 1D viser at forbehandling av HT-29 celler med AG4178 (10 mm) fullstendig hemmet EGF-indusert HO-1 uttrykk (
n =
3). For å bekrefte rollen til EGFR i EGF-indusert HO-1-ekspresjonen ytterligere, ble EGFR siRNA anvendt. Som vist på fig. 1E, transfeksjon med EGFR siRNA (25 nM) også fullstendig inhiberte EGF-indusert HO-1-ekspresjonen (
n
= 3) (fig. 1E). For å bekrefte resultatene av EGFR siRNA eksperiment, vi også brukt EGFR siRNA å undertrykke EGFR protein uttrykk i HT-29 celler. Vi fant at det EGFR siRNA markert inhibert EGFR-proteinet uttrykket (fig. 1F). Disse resultatene tyder på at EGFR er involvert i EGF-indusert HO-1-ekspresjon i HT-29 celler.
A, HT-29-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av EGF i 18 timer, og deretter HO-1 og a-tubulin protein nivåer ble bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. B, Celler ble inkubert i forskjellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml), og deretter HO-1 og a-tubulin proteinnivåer ble bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. C, Cellene ble behandlet i forskjellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml). Totalt RNA ble fremstilt, og en RT-PCR ble utført som beskrevet i «Materialer og metoder». Taces representerer resultater fra tre uavhengige eksperimenter. D, Celler ble forbehandlet i 30 minutter med 10 uM AG1478 og deretter stimulert med 10 ng /ml EGF i ytterligere 18 timer. Etter inkubering ble HO-1 og a-tubulin protein nivåer bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
* p
0,05, sammenlignet med EGF behandling. E, Cellene ble transient transfektert med 25 nM av kontroll siRNA (con siRNA) eller 25 nM av EGFR siRNA i 24 timer og deretter stimulert med EGF (10 ng /ml) i ytterligere 18 timer. Celler lysatene ble forberedt og deretter immunoblottet med antistoffer for HO-1 eller α-tubulin. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M.
* p
0,05, sammenlignet med EGF behandling. F, Cellene ble transient transfektert med 25 nM av kontroll siRNA (con siRNA) eller 25 nM av EGFR siRNA i 24 timer. Hel-cellelysater ble forberedt og deretter immunoblottet med antistoffer for EGFR eller α-tubulin. Spor representerer resultater fra tre uavhengige eksperimenter.
c-Src er involvert i EGF-indusert HO-1 uttrykk i HT-29 celler
For å undersøke om c-Src, en nedstrøms protein av EGFR [12], kan spille en avgjørende rolle i EGF-indusert HO-1-ekspresjon, ble en c-Src DN plasmid brukt. Som vist på fig. 2A, transfeksjon av HT-29 celler med c-Src DN (0,5 mikrogram) hemmet EGF-indusert økning i HO-1 uttrykk ved 91 ± 6% (
n
= 3). Videre er nivået av c-Src-protein ble sterkt uttrykt i c-Src DN plasmid-transfekterte HT-29-celler sammenlignet med pcDNA plasmid-transfekterte HT-29-celler (Fig. 2B). Regulering av c-Src-aktivering oppstår som et resultat av fosforyleringen av flere steder på spesifikke rester, inkludert Tyr416 [25]. Neste, vi videre undersøkt c-Src fosforylering på Tyr416 av EGF stimulering i HT-29 celler med anti-fosfor-c-Src-antistoff ved Tyr416. Figur 2C viser at behandling av HT-29 celler med 10 ng /ml EGF induserte en økning i fosforylering av c-Src ved Tyr416 i en tidsavhengig måte. Fosforylering av c-Src på Tyr416 begynte på 0,5 min og ble opprettholdt inntil 30 minutter etter EGF stimulering (Fig. 2C, topp panel). Proteininnholdet av c-Src ble ikke påvirket av EGF stimulering (fig. 2C, nedre panel). Disse resultater antyder at c-Src-aktivering er nødvendig for EGF-indusert HO-1-ekspresjon.
A, HT-29-celler ble transient transfektert med 0,5 ug av pcDNA eller 0,5 ug av en dominant negativ mutant av c- src (c-src DN) i 24 timer. Celler ble behandlet med EGF (10 ng /ml) i ytterligere 18 timer. Etter inkubering ble HO-1 og a-tubulin protein nivåer bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
* p
0,05, sammenlignet med EGF behandling. B, Cellene ble transient transfektert med enten 0,5 ug av pcDNA eller 0,5 ug av c-Src DN i 24 timer. Nivåer av c-Src eller a-tubulin protein uttrykk ble bestemt ved en Western blot-analyse. Spor representerer resultater fra tre uavhengige eksperimenter. C, HT-29-celler ble inkubert med 10 ng /ml EGF i 0~30 min. Cellelysater ble fremstilt, og c-Src Tyr416 fosforylering ble bestemt ved immunoblotting ved anvendelse av en fosfo-c-Src-Tyr416-antistoff. Immunoblotter er representative for tre forsøk med lignende resultater.
Involvering av NADPH oksidase og ROS i EGF-indusert HO-1 uttrykk i HT-29 celler
c-Src kan aktivere en antall signalveier, inklusive NADPH oksidase [27]. En tidligere studie viste at HT-29 celler overveiende uttrykt NADPH oksidase 1 [28]. For å avgjøre om NADPH oksidase spiller en avgjørende rolle i EGF-indusert HO-1 uttrykk, NADPH oksidase inhibitor, DPI [29], ble brukt. Figur 3A viser at EGF-indusert HO-1-ekspresjon ble hemmet av DPI (3 og 10 mm) på en konsentrasjonsavhengig måte. Når HT-29 celler ble behandlet med 10 uM DPI, EGF-indusert HO-1-ekspresjonen ble inhibert med 86 ± 13% (
n =
3) (fig. 3A). En tidligere studie viste at induksjon av P47
phox
trans fra cytosol til membraner resulterte i en økning i NADPH oksidase aktivitet [27]. Vi ved siden forsøkt å finne ut om EGF aktiverer NADPH oksidase ved å undersøke translokasjon av P47
phox
fra cytosol til membranen brøk med Western blot analyse. Stimulering av celler med 10 ng /ml EGF i 0~30 minutter resulterte i translokasjon av P47
phox
fra cytosoliske fraksjonen til membranfraksjonen begynner på 3 min, den effekten ble opprettholdt i 10 min, og gikk ned med 30 min (fig. 3B). Videre har vi funnet at inkubasjon av celler med EGF (1~10 ng /ml) ga en konsentrasjonsavhengig økning i translokasjon av P47
phox
fra cytosoliske fraksjonen til membranfraksjonen (fig. 3C). En tidligere studie antydet at NADPH oksidase-genererte ROS produksjon deltar i signalveien som fører til induksjon av HO-1-ekspresjonen ved behandling med en sigarett røykekstrakt [29]. For å undersøke om ROS kan mekle EGF-indusert HO-1 uttrykk, glutation ble brukt. Som vist på fig. 3D, behandling av celler med glutation (3~10 mM) markert hemmet EGF-indusert HO-1 uttrykk. Når cellene ble behandlet med 10 mM glutation, ble EGF-indusert HO-1-ekspresjonen dempes med 91 ± 6% (
n
= 3). (Fig. 3D). Disse resultatene tyder på at NADPH oksidase og ROS er involvert i EGF-indusert HO-1-ekspresjon i humane tarmkreftceller.
HT-29-celler ble forbehandlet i 30 minutter med 3~10 uM DPI (A) og 3 -10 mM glutation (D) og deretter stimulert med 10 ng /ml EGF. Etter en 18 timer inkubasjon ble HO-1 og a-tubulin protein nivåer bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
* p
0,05, sammenlignet med EGF behandling. HT-29 celler ble behandlet med 10 ng /ml EGF i de angitte tidsintervaller (B) eller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av EGF (C). De cytosoliske og membranfraksjoner ble deretter isolert, og proteinnivåer av P47
phox
de cytosoliske og membranfraksjoner ble bestemt ved en Western blot-analyse. Na
+ /K
+ ATPase og α-tubulin ble henholdsvis anvendt som membranen og cytosoliske interne kontroller. Typiske spor representerer tre eksperimenter med lignende resultater.
NADPH oksidase er involvert i EGF-indusert ROS produksjon i HT-29 celler
En tidligere rapport viste at EGF indusert en økning i ROS generasjon i HT-29-celler [30]. Deretter undersøkte vi rolle NADPH oksidase i EGF-indusert ROS produksjon. Figur 4A og 4B viser at behandling av HT-29 celler med EGF induserte en økning i ROS generering i tids- og konsentrasjonsavhengig oppførsel (fig. 4A, 4B). Etter 20 min ved behandling med 10 ng /ml EGF, hadde ROS produksjonen økte med 62 ± 5% (
n
= 3) (Fig. 4B). Videre forbehandling av celler med DPI (10 pM) markert hemmet EGF-indusert ROS generasjon ved 85 ± 8% (
n
= 3) (fig. 4C). Disse resultatene tyder på at NADPH oksidase medierer EGF-indusert ROS produksjon i HT-29-celler.
HT-29-celler ble inkubert i forskjellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml) (A) eller inkubert med EGF ( 1~10 ng /ml) i 20 minutter, og deretter ROS-produksjon ble bestemt. Dataene er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. C, HT-29-celler ble forbehandlet i 30 minutter med 10 uM DPI og deretter stimulert med 10 ng /ml EGF. Etter 20 minutter med inkubasjon, ble ROS-produksjon bestemt. Dataene er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M.
* p
. 0,05, sammenlignet med EGF behandling
PI3K /Akt er involvert i EGF-indusert HO-1 uttrykk i HT-29 celler
en tidligere studie viste at PI3K /Akt spiller en viktig rolle i HO-1-ekspresjon [31]. For å forstå sammenhengen mellom HO-1-ekspresjonen av EGF og dens PI3K /Akt signalveien, den PI3K inhibitor (LY 294002) og en Akt DN, ble anvendt. Som vist i figur 5A, EGF-indusert HO-1-ekspresjonen ble inhibert med 10 uM LY 294002 ved 85 ± 8% (Fig. 5A). Videre transfeksjon av HT-29-celler med 0,5 ug av den Akt DN også inhiberte EGF-indusert HO-1-ekspresjon ved 78 ± 8% (Fig. 5B). Videre er nivået av Akt-protein ble sterkt uttrykt i Akt DN plasmid-transfekterte HT-29-celler sammenlignet med pcDNA plasmid-transfekterte HT-29-celler (fig. 5C). Disse resultater antyder at den PI3K /Akt signalveien er nødvendige for EGF-indusert HO-1-ekspresjon. Ser473 rest fosforylering av Akt av et PI3K-avhengig signalveien bevirker enzymatisk aktivering [32]. For å bekrefte den viktige rollen PI3K /Akt i HO-1 uttrykk, bestemt vi Akt Ser473 fosforylering som respons på EGF. Som vist i figur 5D, behandling av HT-29 celler med 10 ng /ml EGF resulterte i tidsavhengig fosforylering av Akt Ser473. Akt Ser473 fosforylering nådde 5~10 min, og da hadde falt med 20 min etter EGF behandling (Fig. 5D, øvre panel). Proteinnivåer av akt1 /2 var ikke påvirket av EGF-behandling (fig. 5D, nedre panel).
HT-29-celler ble forbehandlet i 30 minutter med 10 uM LY 294002 (A) eller ble transient transfektert med 0,5 ug av pcDNA eller 0,5 ug av en dominant negativ mutant av Akt (Akt DN) (B) i 24 timer. Cellene ble deretter stimulert med EGF (10 ng /ml) i ytterligere 18 timer. Etter inkubering ble HO-1 og a-tubulin protein nivåer bestemt. Immunoblot er representative for tre forsøk, som er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
* p
0,05, sammenlignet med EGF behandling. C, Cellene ble transient transfektert med enten 0,5 ug av pcDNA eller 0,5 ug av den Akt DN i 24 timer. Nivåer av Akt eller a-tubulin protein uttrykk ble bestemt ved en Western blot-analyse. Spor representerer resultater fra tre uavhengige eksperimenter. D, HT-29-celler ble inkubert med 10 ng /ml EGF i 0~60 min. Cellelysater ble fremstilt, og Akt Ser473 fosforylering ble bestemt ved immunoblotting ved bruk av fosfo-Akt Ser473 antistoff. Immunoblotter er representative for tre forsøk med lignende resultater.
c-Src, NADPH oksidase, og PI3K mekle EGF-indusert Akt fosforylering på Ser473 i HT-29 celler
Neste, vi undersøkt rollene til c-Src, NADPH oksidase, og PI3K i EGF-indusert Akt Ser473 fosforylering. Som vist på fig. 6, transfeksjon av HT-29-celler med en c-Src DN (0,5 ug) attenuert EGF-indusert Akt Ser473 fosforylering (Fig. 6A). Vi videre undersøkt om NADPH oksidase og PI3K megle Akt fosforylering. Vi fant at EGF-indusert Akt Ser473 fosforylering ble også hemmet av DPI (10 pM) (Fig. 6B). Tilsvarende EGF-indusert Akt Ser473 phosphohrylation ble også hemmet av LY294002 (10 pM) (Fig. 6C). Disse resultater antyder at aktivering av c-Src, NADPH oksidase, og PI3K oppstår oppstrøms for Akt i den EGF-induserte signalveien.
HT-29-celler ble transient transfektert med 0,5 ug av pcDNA eller 0,5 ug av et Som vist på fig.
