Abstract
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen i verden. β-catenin, den sentrale orchestrator av kanoniske Wnt sti og et kjent onkogen er avgjørende i HCC patogenesen. Tilførsel av fenobarbital (PB) inneholdende vann (0,05% w /v) som tumor-promoteren etter innledende injisert intraperitonealt (IP) diethylnitrosamine (DEN) injeksjon (5 ug /g kroppsvekt) som en svulst induser er vanlig brukt modell for å studere HCC i mus. Heri ni femten dager mannlig β-catenin knockout mus (KO) og femten villtype kull kontroller (WT) gjennomgikk DEN /PB behandling og ble undersøkt for lever- tumorigenesis på åtte måneder. Paradoksalt nok ble en signifikant høyere tumorbyrde observert i KO (p 0,05). Svulster i KO var β-catenin og glutamin syntetase negativ og HGF /Met, EGFR IGFR signale var dagligdags. En betydelig økning i PDGFRα og dens ligand PDGF-CC fører til økt fosfotyrosin-720-PDGFRα ble observert i tumorbærende KO-mus (p 0,05). Samtidig er disse leveren viste økt celledød, stelcelleaktivering, hepatisk fibrose og celleproliferasjon. Videre PDGF-CC betydelig indusert hepatomcelle spredning spesielt etter β-catenin undertrykkelse. Våre studier viser også at den benyttede DEN /PB protokoll i WT C57BL /6 mus ikke velge for β-catenin genmutasjoner under hepatocarcinogenesis. Således DEN /PB forbedret HCC i mus som mangler β-catenin i leveren kan være på grunn av deres ineptness på å regulere celleoverlevelse, som fører til økt fibrose og regenerering gjennom PDGFRα aktivering. β-catenin downregulation også gjort hepatomceller mer sensitive til reseptor tyrosin kinaser og dermed kan utnyttes for legemiddel
Citation. Awuah PK, Rhieu BH, Singh S, Misse A, Monga SPS (2012) β-catenin tap i Hepatocytter Fremmer Hepatocellulær Cancer etter Diethylnitrosamine og fenobarbital Administration til Mus. PLoS ONE 7 (6): e39771. doi: 10,1371 /journal.pone.0039771
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 27 april 2012; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 25 juni 2012
Copyright: © 2012 Awuah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir 1R01DK62277 (National Institute of Digestive Diseases og nyre) og 1R01CA124414 (National Cancer Institute) til SPSM og etter Rango fond for styrking av patologi Research. P.K.A. ble finansiert delvis av T32 EB001026 (National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen og den tredje årsaken til kreftdød på verdensbasis [1]. Det er et sterkt behov for å avgrense de molekylære modifikasjoner som er ansvarlige for initiering og forverring av sykdommen. For å studere cellulære og molekyl forstyrrelsene i HCC, mange prekliniske strategier ansette bruk av genetiske og kjemiske modeller for kreftutvikling. Administrering av diethylnitrosamine (DEN) alene eller i forbindelse med fenobarbital (PB) i mus blir ofte brukt for å indusere HCC i mus.
En bane av avgjørende betydning i HCC er Wnt /β-catenin signalering. β-catenin er den sentrale effektor av den kanoniske Wnt signalering, som er et sterkt konservert sti regulerer viktige cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering, overlevelse og selvfornyelse [2], [3], [4], [5]. I fravær av Wnt, er β-catenin fosforylert ved aminoterminale serin og treonin-rester og målrettet for ubiquitinering [6]. Ved binding av Wnt protein til dens celleoverflatereseptor frizzled og ko-reseptor lav tetthet lipoprotein- relatert protein 5/6 (LRP5 /6), blir et signal omformes gjennom samtidig var som gjør det mulig for inaktivering av degradering kompleks som består av glykogen syntase kinase 3β (GSK3P), adenomatøs polyposis coli genprodukt (APC) og kasein kinase Iα, som tillater β-catenin å dissosiere og translocate til kjernen til å bindes til lymfoid enhancer-bindende faktor /T-cellefaktor (LEF /TCF) familie av proteiner transactivate målgener. Wnt /β-catenin veien har vært implisert i en undergruppe av HCC hvor aktiverende mutasjoner i β-catenin genet (
CTNNB1
) har blitt rapportert i 20% -40% av pasientene [7], [8 ]. Knockdown av β-catenin i hepatomceller fører til redusert vekst og overlevelse. For de nevnte grunner, er β-catenin en godt anerkjent onkogen og regnes som en verdifull terapeutisk mål.
Med denne bakgrunnen vi en hypotese om at mangel på β-catenin i hepatocytter kan beskytte mot kjemisk indusert karsinogenese spesielt i en modell der HCC er unnfanget gjennom svulst induksjon ved dEN og tumorvekst gjennom kontinuerlig bruk av PB [9], [10]. Vi brukte mannlige betinget hepatocytter spesifikke β-catenin knockout (KO) mus og sex-matchet vill type kull kontroller (WT) for å studere tumorigenesis svar på DEN /PB. Vi rapporterer en paradoksal økning i lever tumorigenesis i fravær av β-catenin som skyldtes økt skade, fibrose og påfølgende regenerasjon, som ser ut til å være drevet av en heller ikke-klassisk epithelial reseptor tyrosin kinase reseptoren PDGFRα. Vi viser også at bruk av de som vanligvis anvendes DEN /PB-protokollen i C57BL /6 mus, ikke tumorigenesis ikke skje gjennom β-catenin mutasjoner som er observert i C3H mus. Til slutt, β-catenin hemming fører til PDGFRα aktivering og dermed kan gjøre hepatomceller mer mottagelig for reseptor tyrosin kinaser hemming for terapi.
Resultater
β-catenin tap i hepatocytter skaper økt hepatocarcinogenesis i mus som svar på DEN /PB
WT og KO hannmus (C57BL /6) ble gitt en enkelt dose (5 mikrogram /gram) av DEN injeksjon ved postnatal dag 14 dager og to uker senere lov til
ad libitum adgang til
PB inneholdende drikkevann i 8 måneder, hvoretter musene ble undersøkt for leversvulster (fig. 1A). Forbløffende nok musene mangler β-catenin i hepatocytter viste betydelig forbedret tumorigenesis enn WT mus som var grovt merkbar som større og større antall svulster (Fig. 1B). H E farging ble anvendt for å bestemme den også mikroskopisk tumor foci i begge grupper av dyr (figur 1C.). Det totale antall foci ble tellet i representative seksjoner fra fire lober fra KO og WT, som viser signifikant flere tumorer in KO sammenlignet med WT (p 0,05) (Fig. 1D).
Experimental strategi oppsummerer DEN /PB behandling i KO og WT mus. A. Representative fotografier av tumorbærende lever i DEN /PB behandlet KO og WT mus på tidspunktet for innhøsting 8 måneders alder. B. DEN /PB indusert mikroskopisk tumor foci (skissert av pilspisser) visualisert ved H E i WT og KO lever ved 8 måneders alder. C. En betydelig økning i mikroskopisk tumor foci i KO sammenlignet med WT (p 0,05). Svulster ble talt fra H E farget seksjoner som representerer 4 leverlappene fra hver KO og WT dyr på DEN /PB protokollen
β-catenin KO lever etter DEN /PB behandling viser økt celledød, stel. celle aktivering og fibrose og tumor spredning
Deretter adressert vi de cellulære mekanismene som kan være grunnlaget for økt tumorigenesis i KO. Vi identifiserer høyere antall TUNEL-positive hepatocytter i KO på 8 måneder etter DEN /PB i forhold til tilsvarende behandlet WT, noe som tyder på større celledød (Fig. 2A). Det var en medfølgende økning i parenkymatøs levercellevekst i KO som overskredet som WT (Fig. 2A). I tillegg KO mus viste en dramatisk økning i antallet α-glatt muskel aktin, som identifiserer aktiverte stel celler som er ansvarlig for kollagen avsetning og fibrose (fig. 2A). Samtidig til stelcelleaktivering, observerte vi forbedret fibrose av Masson Trichrome farging i den KO sammenlignet med WT (Fig. 2B). Faktisk er bare en av de 15 WT dyrene etter DEN /PB utfordring viste fibrose, som var sammenlignbare med fibrose i KO. Alle sammen, våre resultater tyder på at større tumorigenesis i KO lever var assosiert med signifikant større celledød og spredning (Fig. 2C), og leverfibrose også.
A. Representative tumorbærende KO lever viser økt parenchymal celledød (TUNEL), større stelcelleaktivering (α-SMA) og øket parenkymal celleproliferasjon (PCNA) sammenlignet med WT. B. Økt hepatisk fibrose (blå) i tumorbærende KO lever er tydelig av Masson Trichrome farging sammenlignet med kontroll. C. PCNA- og TUNEL-positive celler ble talt opp i 4 tilfeldige deler av fem representative KO og WT lever. En betydelig økning i både PCNA og tunel positiv parenkymceller var tydelig i KO lever i forhold til WT etter DEN /PB behandling.
Svulster i KO lever etter DEN /PB ikke er sammensatt av β-catenin -positive hepatocytter
Siden det har vært rapporter fra vårt laboratorium og andre som svar på spesifikke skader, det er press på hepatocytter som kan ha rømt CRE-mediert sletting, vårt første mål var å finne ut om lever utsatt for dEN /PB fra KO gruppen viste noen opptreden av β-catenin spesielt sammenlignet med WT. En representant WB viste at alle KO lever fra DEN /PB utsatt mus uttrykt dramatisk lavere nivåer av β-catenin sammenlignet med WT av vestlige blotter (fig. 3A). Dette ble også bekreftet ved en detaljert immunohistokjemisk analyse som inngår i en forestående avsnitt (tabell 1 og fig. 4). Det lave nivået av β-catenin in KO lever representerer dets nærvær i de ikke-parenchymale celler av leveren som ikke viser noen albumin cre-mediert rekombinasjon. Tilsvarende analyse presentert fra representative KO og WT leveren viste også fravær av glutaminsyntetase, et surrogat målgen av β-catenin signalering i KO (fig. 3A). Cyclin-D1, en annen fremtredende Målet β-catenin i lever og andre steder ble øket i de fleste WT, mens 8/9 KO viste svært lav eller fraværende cyclin-D1 som reaksjon på DEN /PB (Fig. 3A og ikke vist). C-myc, et annet mål for β-catenin, var Ironisk høyere i KO sammenlignet med WT mus etter DEN /PB eksponering som er vist i en representativ Western blot (Fig. 3A). Dermed KO lever etter DEN /PB fortsette å være negativ for β-catenin etter 8 måneder.
A. Representant western blot analyse fra 5 WT og 4 KO tumorbærende lever viser lav β-catenin, fraværende GS og dramatisk lavere cyclin-D1 i KO mens c-myc nivåene økte. Actin bekrefter lik belastning. B. Undersøkelse av RTK i samme sett av dyr viser særlig lavere fosfor-Met og fosfor-IGFR og bare marginalt lavere fosfor-EGFR, i KO enn WT lever etter vestlige blotter. GAPDH bekrefter sammenlign lasting.
Svulster i WT var heterogene og var enten positivt for både β-catenin og PDGFRα, eller for noen av dem. I KO, nesten alle svulster manglet noen β-catenin og viste intens PDGFRα-positivitet.
Svulster i KO lever etter DEN /PB ikke er forbundet med aktivering av tradisjonelle HCC forbundet reseptortyrosinkinaser.
grunn av en paradoksal økning i DEN /PB-indusert tumordannelse i KO, vi neste utforsket mulige molekylære mekanismer. Begge epidermal vekstfaktor (EGF) signal- og hepatocytt-vekstfaktor (HGF) signalering er kritisk spillere i utvikling og forverring av HCC [11]. Vi utforsket både totalt og fosforylert status av reseptorer for disse reseptor tyrosin kinaser (RTK) i lever fra DEN /PB-behandlede KO og WT mus. Interessant vi registrert en nedgang i totale og fosforylerte nivåer av c-Met, HGF reseptor i KO dyr sammenlignet med WT (Fig. 3B). Både totalt og fosforylerte nivåer av EGFR mellom WT og KO dyr forbli uendret (fig. 3B). Vi undersøkte også insulinlignende vekstfaktor-reseptor, en annen signalveien implisert i HCC [11]. Vi bemerket høyere nivåer av dets fosforylering i WT sammenlignet med KO (Fig. 3B). Dermed trenger klassiske RTK ikke ut til å være ansvarlig for økt HCC i KO, men p-Met og P-IGFR er tydelig indusert i tumorbærende WT mus indikerer deres viktige rolle i HCC.
Immunhistokjemisk karakterisering av KO og WT leversvulster for β-catenin og PDGFRα
neste preget svulstene observert i WT og KO ved immunhistokjemi for β-catenin lokalisering. Rundt 31% av den totale tumor foci i WT mus viste atom β-catenin (tabell 1, fig. 4). Ut av 63 observerte foci i 9 KO mus, bare to ble satt sammen av β-catenin-positive tumorceller som viste sitt atom /cytoplasma lokalisering (data ikke vist) mens andre var negative (Fig. 4). Dette begrunnes observasjonene i fig. 3A og viser også at nesten alle tumorer i denne gruppen var består av β-catenin-negative hepatocytter og kan ikke være på grunn av ekspansjon av celler, noe som kan ha beholdt β-catenin på grunn av ufullstendig albumin-cre rekombinasjon.
Vi undersøkte neste PDGFRα signalering, som har vært implisert i HCC og er involvert i tumorvekst, angiogenese, og vedlikehold av tumor mikromiljøet [12], [13], [14]. 54,5% av alle tumor foci i WT mus viste cytoplasmisk PDGFRα ekspresjon (Tabell 1). Vi har funnet rundt 94% av tumor foci i KO å være sterkt positiv for PDGFRα i cytoplasma av tumorceller (tabell 1, fig. 4). Bare fire foci var negative for PDGFRα. De to svulst foci som var β-catenin-positive i KO lever var samtidig positivt for PDGFRα.
I en tilleggsanalyse, 9 av de 55 svulster observert i WT var samtidig positivt for både PDGFRα og kjernefysisk β -catenin, mens andre var positive for det ene av de to (tabell 1, fig. 4). En liten fraksjon av tumorer var negative for begge disse proteinene. De to tumorer som var sammensatt av β-catenin-positive hepatocytter i KO var også positive for PDGFRα signalering (tabell 1). Totalt sett PDGFRα uttrykk var høyere og også i større antall svulst foci i KO sammenlignet med WT 8 måneder etter DEN /PB eksponering.
DEN /PB indusert økt tumorigenesis er forbundet med aktivering av PDGFRα signalering.
For å bekrefte PDGFRα økning i KO løpet WT etter dEN /PB, vi utnyttet western blot analyse ytterligere. PDGFRα proteinnivåer var høyere i den KO enn WT leveren (fig. 5A), og denne forskjellen var statistisk signifikant (fig. 5B). Det var en beskjeden økning i PDGFRp nivåer i KO leveren (Fig. 5A). Vi identifiserte også en bemerkelsesverdig økning i totale proteinnivåer selektiv PDGFRα ligand PDGF-CC mens PDGF-AA eller PDGF-BB forble uendret mellom de to gruppene (Fig. 5C).
A. Representative western blots fra 8 KO og 9 vekt- viser en dramatisk økning i totale nivåer av PDGFRα og beskjeden økning i PDGFRp i KO. Actin lasting bekrefter lik belastning. B. Gjennomsnitt integrert optisk tetthet (IOD) erholdt fra skannede autoradiografer som er vist på fig. 5A avdekket betydelig høyere PDGFRα nivåer i KO (p = 0,002). C. Western blot fra representative prøver viser en dramatisk økning i PDGF-CC, en ligand for PDGFRα i KO mens PDGF-AA og BB forble unremarkable mellom de to gruppene. D. Bar graf viser en betydelig økning i Tyr720-PDGFRα in KO sammenlignet med WT (p 0,05). E. Ubetydelige forskjeller var tydelig i Tyr-849-PDGFRα mellom WT og KO.
For å finne ut konsekvensene av økt PDGF-CC /PDGFRα nivåer i KO vi vurderte nivåene av PDGFRα fosforylering på flere spesifikke tyrosin rester som bruker antistoffer som er oppført i metoder. Som vist i densitometriske analyser, en betydelig økning i Tyr720-PDGFRα (p 0,05) (Fig. 5D), men ikke i Tyr849-PDGFRα (figur 5E.) Eller Tyr572 /574- og Tyr754-PDGFRα (ikke vist) som ble observert hos KO. Disse observasjonene viser PDGFRα aktivering i KO, som kan spille en viktig rolle i hepatocarcinogenesis.
PDGFRα ligand stimulerer hepatomcelle spredning bare ved β-catenin undertrykkelse
For ytterligere å fastslå relevansen av PDGFRα signale i fravær av β-catenin, benyttet vi humane hepatomceller. PDGF-CC var ute av stand til å fremkalle noen signifikant økning i Hep3B celle DNA-syntesen i forhold til HCI, som ble benyttet for å rekonstituere PDGF i nesten sammenflytende cellekulturer (fig. 6). β-catenin knockdown i forhold til å kontrollere siRNA transfeksjon, betydelig senket thymidine i Hep3B celler (p 0,0005) (fig 6.). Bare ved β-catenin stanse, var PDGF-CC behandling i stand til å indusere betydelige DNA-syntese i Hep3B celler sammenlignet med HCl (p 0,005). Således β-catenin undertrykkelse aktiverte PDGF-CC å være mitogent for Hep3B celler.
PDGF-CC (10 ng /ml) behandling øker ikke DNA-syntese i forhold til HCl-behandling av Hep3B celler. β-catenin knockdown førte til betydelig reduksjon i tymidininkorporering sammenlignet med kontroll siRNA (p 0,0005). Men PDGF-CC behandling førte til en betydelig økning i thymidine i β-catenin undertrykt i forhold til å kontrollere siRNA-transfekterte celler (p 0,005).
Diskusjoner
Å forstå den molekylære og cellulære grunnlaget for HCC hos pasienter, flere prekliniske modeller er i bruk, inkludert dEN eller dEN /PB regimer hos gnagere. DEN er et vanlig kreftfremkallende for å indusere HCC i gnagermodeller, men den har høy belastning spesifisitet. I C57BL /129Sv × C3H /He-mus, en stamme mer utsatt for hepatocarcinogenesis, DEN injeksjon på rundt 6 ukers alder i en dose på 90 ug /g kroppsvekt, fremkaller HCC gjennom Ha-Ras mutasjoner, mens inkludering av PB i drikke vann etter 3 uker med DEN, fremmer tumorigenesis grunn av
CTNNB1
mutasjoner. [15]. Men en annen studie med hann B6C3F1 mus, oppnådd ved kryssing kvinnelige C57BL /6J og mannlige C3H /HeJ mus injisert DEN på 10 mikrogram /g kroppsvekt ved 3 ukers alder uten PB, viste HCC via
CTNNB1
mutasjoner [16]. En annen modell benytter DEN ved en dose på 5 ug /g kropps i C57BL /6 mus, en belastning forholdsvis motstandsdyktig mot HCC. Her, induserer DEN DNA-addukter i hepatocytter som gjennomgår celledeling, og til slutt fører til utvikling av HCC [17], [18]. Inkludering av PB forbedrer tumorigenesis via sin tumor fremme evnen til [9], [10]. I vår studie viser vi at i motsetning til C57BL /129Sv × C3H /He-mus, fikk DEN /PB indusert leversvulster i C57BL /6 mus ikke viser atom /cytoplasma lokalisering av β-catenin og dermed ikke selektivt føre HCC via
CTNNB1
mutasjoner. Dermed musestamme hensynet til å studere tumorigenesis som svar på spesifikke protokoller er svært relevant.
Mange veier grovt kategoriseres i Ras /MAPK, PIK3CA /AKT, og Wnt /β-catenin signalering, har vist seg å være av betydning i HCC [11], [19]. β-catenin, den sentrale orchestrator av Wnt signalering, er en kjent onkogen på grunn av sine virkninger i en rekke krefttyper, inkludert 20% -40% av alle HCCs [20]. Intriguingly skjønt, er overekspresjon av enten villtype eller mutant form av β-catenin i murine lever ute av stand til å fremkalle spontan HCC [21], [22], [23], [24]. Men i nærvær av en annen «hit» i form av en transgen eller en kjemisk kreftfremkallende, viser disse forskjellige mus forbedret tumorigenesis [23], [25], [26]. Paradoksalt betinget tap av β-catenin i hepatocytter i C57BL /6 mus førte til en uventet høyere mottakelighet for den-indusert HCC [27]. En annen gruppe også nylig viste vist økte tumorigenesis i KO mus som svar på DEN /PB,
riktignok
i C3H /N mus [28]. I denne studien, gir vi bevis for at β-catenin KO mus i C57BL /6 bakgrunn utsatt for den-mediert tumorinduksjon ved P14 fulgt av tumorvekst 2 uker senere etter PB også ført til en dramatisk høyere tumorbyrde.
DEN eller DEN /PB indusert HCC i noen stamme av mus er vanligvis ikke forbundet med noen leverfibrose. Men i β-catenin betinget null mus DEN /PB eksponering førte til utvikling av HCC, som ble assosiert med leverfibrose og er i tråd med nyere studier av andre og oss [27], [28]. Vi har også en økning i celle-død og fører til en økning i celleproliferasjonen. Faktisk har vi identifisert økt stelcelleaktivering, en beskjeden økning i PDGFRp og påfølgende hepatisk fibrose. Disse data indikerer at β-catenin tap gjør lever mer utsatt for skade genotoksiske og til slutt tumorgenese etterligne den dominerende scenario av human HCC hvor tumorer forekommer ofte i cirrhose bakgrunn [29]. Rollen til β-catenin i regulering av redoks staten har vært antydet i mange nyere studier der interaksjon med HIF1α, FOXO3 og andre kan være kritisk [30], [31]. Det vil derfor være viktig å forstå grunnlaget for slike «svulst undertrykkende roller av β-catenin i HCC som etter hvert kan kreve nøye utvalg av pasienter som skal behandles med anti-β-catenin terapier [32].
for å fastslå den molekylære basis for HCC i fravær av β-catenin, vi er interessert i signalveier som er velkjente i utvikling og forverring av HCC. C-Met og IGFR fosforylering ble økt i WT, men ikke i KO mus mens EGFR aktivisering var bare mildt forhøyet i WT. Dermed mens disse RTK oss kan spille en viktig rolle i tumordannelse i WT utsatt for DEN /PB, er neppe deres deltakelse i KO. Basert på våre tidligere funn i DEN-indusert tumordannelse i KO [27] og uavhengige studier som viser en viktig rolle PDGFR signalering i HCC [12], [13], [14], undersøkte vi uttrykket og aktivering i DEN /PB studier . PDGFRα nivåene var signifikant oppregulert i KO etter DEN /PB-eksponering. I tillegg har PDGF-CC en selektiv ligand av PDGFRα, hvis overekspresjon i leveren-spesifikke transgene mus vist seg å indusere cirrhose og HCC [33], ble også øket i KO. Faktisk PDGF-CC ble lokalisert til hepatocytter i KO utsatt for DEN /PB (data ikke vist) tyder på en autokrin løkke av signalering. Resultatene fra tymidin inkorporering analysen i Hep3B cellene resultater, bekrefter
in vivo
funn. Mens nedsatt celleformering ble observert i hepatomceller etter β-catenin knockdown [34], PDGF-CC fremmet deres mitogenese mer robuste bare etter β-catenin undertrykkelse som fører til oppregulering PDGFRα [27]. Dette bekrefter også PDGFRα signaliserer som et middel til å flykte fra β-catenin terapeutisk hemming.
PDGFRα overekspresjon i nærvær av økt PDGF-CC ført til økt Tyr720-PDGFRα i tumorbærende KO men ikke WT lever etter DEN /PB. Fosforylering ved tyrosin-720 er kjent for å aktivere fosfatase SHP2, som i sin tur dephosphorylates Src, som fører til aktivering [35]. Src-aktivering har vist seg å indusere c-Myc, en viktig proto-onkogen [36], som ble samtidig forhøyet i KO. Andre tyrosin steder i PDGFRα viste iøynefallende endringer i fosforylering mellom KO og WT og dermed kan være av mindre relevans i dagens tumorigenesis modell.
Bare rundt 3% av alle svulster i 9 KO er på 8 måneder etter dEN /PB regime var β-catenin-positive svulster som kan skyldes «lekk» cre-recombinase. P-catenin-negative tumorer var også negativ for GS og det meste negativt for cyclin-D1. Vi har ikke fulgt noen dyr i denne studien utover 8 måneder. Andre har nylig rapportert omfattende spontan repopulation i KO lever
riktignok
på 18-20 måneders alder [37]. En gruppe har rapportert en mer robust spontan repopulation og lever adenomatosis i KO, som ikke har blitt rapportert av noen annen gruppe som jobber med β-catenin betinget knockout mus [38]. Den eneste forekomst av omfattende repopulation i KO mus i vår erfaring ble observert etter kontinuerlig administrering av diett som inneholdt 0,1% 3,5-Dietoksykarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) for 5 måneder [39]. Faktisk KO mus har blitt studert etter en delvis hepatectomy, metionin-kolin mangelfullt kosthold, alkohol diett eller DEN og har utstilt mangel på lever repopulation med β-catenin-positive hepatocytter [27], [31], [40], [41] .
Materialer og metoder
dyre~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene av National Institutes of Health og Institutional Animal bruk og vedlikehold Utvalget ved Universitetet i Pittsburgh. De som utføres i dagens rapport studiene ble godkjent av Institutional Animal bruk og vedlikehold Utvalget ved University of Pittsburgh. Mus med betinget sletting av β-catenin i hepatocytter med genotype- Ctnnb1
loxP /loxP; Alb-Cre
+/- blir referert til som knockout mus (KO) og har blitt beskrevet tidligere [41]. Kullsøsken med noe av det følgende genotypes- Ctnnb1
loxP /loxP; Alb-Cre
– /-, Ctnnb1
loxP /WT, Alb-Cre
+/-, Ctnnb1
loxP /WT; Alb-Cre
– /- er referert til som vill-type eller WT. Disse musene er i C57BL /6 bakgrunn.
Male KO (n = 9) og WT (n = 15) mus ble injisert intraperitonealt med DEN (Sigma-Aldrich, Inc.) ved en dose på 5 ug /gram kroppsvekt ved postnatal dag 14 og fra dag 28 og utover drikkevann tilgjengelig
ad libitum
inneholdt fenobarbital (PB) (0,05% vekt /volum). Vann inneholdende fersk PB ble fremstilt hver uke i løpet av studiene. Mus ble ofret på 8 måneder og lever samlet for histologi og protein analyse
Western blot analyse:.
Samlede vev lysates utarbeidet i radio immuno-nedbør analysen (RIPA) buffer som inneholder 1% IGEPAL CA -630, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS i 1 x PBS sammen med protease fosfat inhibitor (1:100) (Thermo Scientific). Proteinene ble gjenoppløst på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese i 4-15% geler og deretter overført til Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA) i overføringsbuffer inneholdende 10% metanol. Membranene ble probet med primære antistoffer (se nedenfor) i Tris-bufret saltvann med Tween-20 som inneholdt 5% fettfri melk eller BSA. Pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer ble brukt på 1:50,000 fortynning og signal vurderes med Super Signal West Pico chemiluminescence substrat (Pierce, Rockford, IL) og autoradiografi. Filmene (Molecular Technology Sales, St. Louise, MI) ble skannet for å få integrert optisk densitomery (IOD) med NIH Imager programvare. Den gjennomsnittlige IOD for et protein ble sammenlignet mellom KO og WT grupper og vurderes for statistisk signifikans av student
t
test og p .. 0,05 ble betraktet som signifikant
Antistoffer
Primære antistoffer som brukes for Western blotting inkludert: c-Met (1:500), fosfor-Met Tyr1234 /1235 (1:1000), EGFR (1:1000), fosfor-PDGFRα Tyr849 (1:1000), fosfor-IGFR (1:1000) alle fra Cell Signaling Technology; β-catenin (1:1000) fra BD Biosciences; PDGFRα (1:180), PDGFRp (1:500), fosfor-EGFR (1:500), fosfor-PDGFRα Tyr720 (1:200), c-myc (1:200), PDGFA (1:200), PDGFB (1:200), PDGFC (1:200), fosfor-PDGFRα Tyr754 (1:200), Glutamin Synthethase (1:200), og GAPDH (1:1000) alle fra Santa Cruz Biotechnology; fosfor-PDGFRα Tyr572 /574 (1:800, Invitrogen); Cyclin D1 (1:200, Neomarkers); alpha glatt muskulatur aktin (1:300, Abcam); og β-aktin (1:2000, Millipore).
Histologi og immunhistokjemi
Fire-mikron deler av parafininnstøpte leveren vev ble brukt for histologi og immunhistokjemisk farging. Hematoxylin og eosin (H 0,05 ansett som signifikant
For immunhistokjemi, antigen gjenfinning ble oppnådd både med damp matlaging eller kokende lysbildene i mikrobølgeovn i citratbuffer i 20 minutter eller 10 minutter, henholdsvis. Seksjonene ble inaktivert endogent for peroksyd, blokkert og inkubert med primært antistoff over natten ved romtemperatur eller i én time ved romtemperatur, vasket og inkubert med passende biotin-konjugert sekundært antistoff i 30 minutter. Seksjoner ble vasket, inkubert med ABC reagens, vasket og inkubert med DAB. Snittene ble neste kontra med Shandon hematoksylin løsning (Sigma) og dekselet gled hjelp Cytoseal fortelle XYL (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI). For negativ kontroll ble det primære antistoff utelatt i protokollen. Lysbilder ble vist under en Axioskop 40 (Zeiss) oppreist forskning mikroskop og digitale bilder oppnådd. Collager ble utarbeidet ved hjelp av Adobe Photoshop CS4. For PCNA og TUNEL, ble antall positive celler telles i fire tilfeldige 400 × felt i fem representative lever fra hver gruppe og gjennomsnitt i forhold til betydningen mellom grupper av student
t
test. P-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. For kvantitativ analyse av β-catenin- og PDGFRα-positivitet i svulster, ble alle mikroskopiske foci i KO og WT lever vurdert. Enhver tumor foci som viser cytoplasmiske og /eller kjernefysiske β-catenin farging ble merket som β-catenin-positive og noen foci som oppviser cytoplasmatisk farge for PDGFRα i forhold til omkringliggende ikke-tumorområdene ble merket som PDGFRα-positiv. Dette gjorde oss i stand til å beregne prosentandel av β-catenin og /eller PDGFRα-positive svulster i hver gruppe etter DEN /PB behandling.
cellekultur og behandlings
Hep3B celler (ATCC) ble dyrket til 100% samløpet i 10% FBS og EMEM media. Cellene ble trypsinisert og sådd ut i 6-brønners plater som inneholdt 2 ml av 10% FBS EMEM-media og serum-sultet over natten. Transfeksjon ble utført ved hjelp av pre-godkjent β-catenin og kontroll siRNA (Ambion) bruker lipofektamin som beskrevet tidligere [34]. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 ng /ml av rekombinant PDGF-CC (R & D Systems) eller HCl (brukes til å rekonstituere PDGF-CC) i 4% media inneholdende tritiert tymidin. Etter 24 timer ble mediet kassert og 1 ml 5% trikloreddiksyre (TCA) ble tilsatt til hver brønn og platene plasseres i 4 ° C i 15 minutter. Cellene ble vasket, tørket og suspendert i 1 ml av 0,33 M NaOH i 20 minutter, og 300 ul totalblanding fra hver brønn ble tilsatt til 3 ml scintillasjonsvæske og deretter plassert i scintillasjonsteller.
