Abstract
Bakgrunn
epidemiologisk sammenslutning av hode og nakke kreft med snus (ST) understreker behovet for å avdekke molekylære mekanismer involvert i kreftutvikling, og identifisere farmakologisk trygge agenter for tidlig intervensjon og forebygging av tilbakefall av sykdommen. Guggulsterone (GS), en BIOSAFE nutraceutical, hemmer PI3K /Akt sti som spiller en avgjørende rolle i HNSCC utvikling. Men til potensialet i GS undertrykke ST og nikotin (viktig komponent av ST) indusert HNSCC forblir uutforsket. Vi antok GS kan oppheve effekten av ST og nikotin på apoptose i HNSCC celler, blant annet ved aktivering av PI3K /Akt sti og nedstrøms mål, Bax og Bad.
Metoder og resultater
våre resultater viste ST og nikotin behandlingen resulterte i aktivering av PI3K, PDK1, Akt, og nedstrøms-proteiner – Raf, GSK3p og PS6 mens GS-induserte en tidsavhengig reduksjon i aktivering av PI3K /Akt pathway. ST og nikotin behandling også resulterte i induksjon av Bad og Bax fosforylering, økt foreningen Bad med 14-3-3ζresulting i sin håndtering i cytoplasma i hode- og nakkekreftceller, og dermed blokkerer sin pro-apoptotisk funksjon. Spesielt, GS forbehandling hemmet ST /nikotin indusert aktivering av PI3K /Akt vei, og hemmet Akt mediert fosforylering av Bax og Bad.
Konklusjoner
I konklusjonen, GS behandling ikke bare hemmet spredning, men også indusert apoptose ved oppheve effekten av ST /nikotin på PI3K /Akt sti i hode og nakke kreft celler. Disse funnene gir en begrunnelse for utforming av fremtidige studier for å evaluere chemopreventive potensialet i GS i ST /nikotin forbundet hode og nakke kreft
Citation. Macha MA, Matta A, Chauhan SS, Siu KWM, Ralhan R (2011 ) Guggulsterone Targets Smokeless Tobacco Induced PI3K /Akt Pathway i hode og nakke kreft celler. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10,1371 /journal.pone.0014728
Redaktør: Madhuri Kango-Singh, University of Dayton, USA
mottatt: 24 juli 2010; Godkjent: 14 desember 2010; Publisert: 24 februar 2011
Copyright: © 2011 Macha et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Muzafar A . Macha er en mottaker av en seniorforsker Brorskap Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), New Delhi, India. Ajay Matta er mottaker av en MITACS Akselerer Fellowship, Ontario, Canada. Ranju Ralhan erkjenner takknemlig støtte fra Joseph og Mildred Sonshine Senter for Head and Neck sykdommer, Alex og Simona Shnaider Laboratory of Molecular Oncology, Temmy Latner /Dynacare, og Institutt for Øre-Head and Neck Surgery, Mount Sinai Hospital, University of Toronto . M.v. Michael Siu erkjenner midler fra Ontario Institute for Cancer Research (OICR), og infrastrukturell støtte fra Ontario Forskning og Utvikling Challenge Fund og AB SCIEX. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er fortsatt en viktig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden med fem års overlevelse på ca 50%, preget av hyppige tilbakefall eller dannelse av andre primære svulster (10-25% av tilfeller) [1], [2]. På en global skala, er bruk av tobakk den viktigste risikofaktoren, med snus (ST) forbruk er knyttet til den høye forekomsten av HNSCC [3] – [5]. ST er brukt i flere former nemlig naswar, Gutkha, khaini (en blanding av ST med kalk) og har eller med betel pund, blitt klassifisert som en menneskelig karsinogen av International Agency for Research in Cancer (IARC) [6], [7] . Foreningen av røyking med HNSCC er godt kjent, men koblingen mellom ST bruk og hode- og halskreft er voksende. I en fersk rapport, Stepanov
et al.
[8] identifisert 23 polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i ST i tillegg til nitrosaminer og nikotin som rapportert i tidligere studier [7]. Nikotin forbedrer spredning, akselererer tumorvekst og inhiberer apoptose i visse typer av humane kreftcellelinjer og induserer angiogenese in vivo ved vedvarende aktivering av de mitogene veier [9] – [11]. Nikotin er blitt rapportert å inhibere apoptose indusert av opioider og genotoksiske spenning indusert av etoposid, cisplatin, eller UV-bestråling i lungekreftceller [12], [13]. I tillegg aktiverer nikotin PI3K /Akt sti og hemmer de pro-apoptotiske funksjoner av Bax og Bad gjennom fosforylering [14], [15]. Disse funnene bedt oss om å undersøke om ST (khaini) induserer PI3K /Akt sti aktivering i hode og nakke kreft celler.
Videre identifikasjon av farmakologisk trygge chemopreventive agenter som kan undertrykke ST /nikotin indusert PI3K /Akt sti i HNSCC er sannsynlig å ha potensial til å hindre ST induserte hode- og nakkekreftutvikling. Guggulsterone (GS), (4,17 (20) -pregnadien- 3,16-dion), en bestanddel av indisk ayurvedisk medisinsk plante
commiphora mukul
er en BIOSAFE nutraceutical med antineoplastiske egenskaper [16] – [18]. GS er blitt rapportert å indusere apoptose, undertrykke proliferasjon, invasjon, angiogenese, metastase og omvendt medikamentresistens, slik at det er en potensiell komplementært middel mot kreft [19] – [24]. GS bindes til farnesoid X-reseptoren og er blitt vist å modulere ekspresjon av proteiner involvert i apoptose (IAP1, XIAP, Bfl-1 /A1, Bcl-2, cFLIP, Survivin), celleproliferasjon (cyklin D1, c-Myc), angiogenese og metastase (MMP-9, COX-2, VEGF) [25]. Dette sterol utøver sine biologiske effekter av reguleringen av transkripsjonsfaktorer – nukleær faktor kappa B (NFkB), STAT-3 og C /EBP alpha, og steroidreseptorer – glukokortikoidreseptorer og androgen reseptor. Vår gruppe og andre nylig demonstrerte anticancer aktivitet av GS i HNSCC og myelomcellelinjer ved å hemme NFkB og STAT3; påfølgende studier rapportert lignende effekter i andre kreftcellelinjer og i dyremodeller av tykktarm og hudkreft [19], [24], [26].
I denne studien undersøkte vi aktivering av PI3K /Akt sti i hode og nakke kreft celler på behandling med ST /nikotin og dens inaktivering av GS. Videre utfordret vi aktivering av Akt og nedstrøms mål (PS6, GSK3p og Raf), ved ST /nikotin i hode og hals kreftceller (SCC4) ved forbehandling med GS.
Resultater
Effekt av ST og nikotin aktivere PI3K /Akt sti i hode og nakke kreft celler
dosen og tidskinetikk SCC4 ST og nikotin (avhengighetsskapende komponenten i tobakk) behandling i hode- og nakkekreftceller (og HSC2 ), ble bestemt ved MTT-analysen (figur 1A og 1B). Lignende kinetikk ble observert i begge cellelinjene og resultatene for SCC4 celler er vist i figur 1. Eksponering for ST og nikotin økt celleformering i både hode- og halskreft cellelinjer på en doseavhengig måte med en optimal dose på 20 ug /ml for ST og 10 mikrometer for nikotin. Disse optimale doser er blitt brukt i alle etterfølgende eksperimenter. For å undersøke effekten av ST eller nikotin på Akt reaksjonsveien i HNSCC-celler, ble begge SCC4 og HSC2-celler behandlet med 20 ug /ml ST eller med nikotin (10 uM) for forskjellige tidsintervaller eller holdt ubehandlet, og Akt aktivering (Akt fosforylering i Ser-473 og Ser-309) ble bestemt i proteinekstrakter ved hjelp av western blotting. Både ST og nikotin raskt økt Akt fosforylering uten å påvirke den totale Akt nivåer i både HSC2 og SCC4 celler (henholdsvis figur 2a og 2b). Disse studiene viser at ST og nikotin aktivere Akt ved doser som kan være fysiologisk relevant. Videre vår western blot-analyse viste at både ST og nikotin induserte en tidsavhengig økning i fosforylering av både oppstrøms kinaser, PI3K og PDK1, samt nedstrøms mål, Raf, GSK3P, og PS6 i SCC4 celler (figur 2A og 2B ), som reflektert raskt innsettende økt Akt fosforylering. Lignende funn ble observert i begge cellelinjene (SCC4 og HSC2) derfor data for bare SCC4 cellene er blitt vist her.
Celler ble behandlet med (A) ST (1-500 mg /ml), ( B) nikotin (1-100 mm) for 24-96 timer. Figur viser gjennomsnittet av tre forsøk gjøres uavhengig av hverandre.
SCC4 celler (2-3 × 10
6) ble behandlet med (A) ST (20 mikrogram /ml) eller (B) nikotin ( 10 uM), for de angitte tidsintervaller og hel-celle-ekstrakter ble fremstilt. Hel-celle-ekstrakter (60 ug protein) ble løst i 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran og ikke-spesifikk binding ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk over natten. Protein ble bestemt ved sondering med phospho-spesifikke antistoffer for Pakt (THR-309), Pakt (Ser-473). pGSKβ3, pRaf, pPDK1 og Akt med utvidet chemiluminescence metode. Western blotting for α-tubulin ble gjort for å vise lik protein lasting.
Effekt av guggulsterone på ST og nikotin indusert aktivering av PI3K /Akt sti
Både ST og nikotin indusert stimulering av Akt vei, derfor, undersøkte vi effekten av GS på ST og nikotin indusert aktivering av Akt veien. SCC4 celler ble behandlet med GS (50 uM) for forskjellige tidsintervaller, og deres proteinekstrakter ble testet for Akt aktivering. Som vist i figur 3A, GS inhiberte aktiveringen av Akt, oppstrøms kinaser PI3K, PDK1, samt nedstrøms proteiner, Raf, GSK3P, og PS6. Dosen standardisering av PI3K /Akt inhibitor, LY294002, ble utført ved å behandle SCC4 cellene med forskjellige konsentrasjoner av inhibitor (0,5-10 pM) i 1 time. Som vist i figur 3B, LY294002 (10 pM) fullstendig hemmet ekspresjon av aktivert Akt; mens ingen virkning ble observert på de totale Akt ekspresjonsnivåer. SCC4 celler ble forbehandlet med GS i 4 timer eller LY294002 (10 uM) i 60 minutter, fulgt av (20 ug /ml) i 6 timer eller nikotin (10 uM) i 4 timer ST. Resultatene indikerer at GS samt LY294002 blokkert nikotin-indusert aktivering Akt bane (figur 3C) og ST, men ingen virkning ble observert på ekspresjonen av total Akt og GSK3P på følgende tidspunkter.
SCC4 celler ( 2-3 x 10
6) ble behandlet med (A) GS (50 um) for de angitte tidsintervaller og /eller (B) med LY294002 ved forskjellige konsentrasjoner i 1 time. (C) SCC4 celler (2-3 x 10
6) ble for-behandlet med 50 uM GS i 4 timer eller med LY294002 (10 pM) i 1 time og stimulert med (20 ug /ml) i 6 timer ST eller med nikotin (10 uM) i 4 timer. Seksti mikrogram protein fra hel-celle-ekstrakter ble løst i 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran, etterfulgt av blokkering med 5% fettfri melk over natten. Protein ble bestemt ved sondering med spesifikke antistoffer ved hjelp av forbedret chemiluminescence metode.
Guggulsterone og PI3K-spesifikk hemmer LY294002 blokk ST og nikotin indusert Bad og Bax fosforylering
Både ST og nikotin potent stimulert serin fosforylering av Bax og Bad i en tidsavhengig måte (figur 4A og 4B) som resulterer i oppheving av sine pro-apoptotiske funksjon. For å demonstrere en funksjonell rolle Akt som fysiologiske ST og nikotin aktivert Bax og Bad kinase, LY294002, en PI3K spesifikk hemmer som kan blokkere PI3K /Akt signalveien, ble brukt. SCC4 celler ble forbehandlet med LY294002 (10 uM) i 60 minutter eller 50 uM GS i 4 timer fulgt av (20 ug /ml) ST i 6 timer eller med nikotin (10 uM) i 4 timer. GS samt LY294002 blokkert ST og nikotin indusert Bax og Bad fosforylering (figur 4A og 4B). Ingen virkning på ekspresjon av total Bad og Bax ble observert ved disse tidspunkter. Disse funnene tyder på at hemming av ST og nikotin indusert Bax og Bad fosforylering av GS kan gjenopprette den pro-apoptotiske funksjon av disse molekylene.
SCC4 celler (2-3 × 10
6) ble behandlet med ( A) (20 ug /ml) eller (B) Nikotin (10 uM) for de angitte tidsintervaller ST. SCC4 celler ble forbehandlet med LY294002 (10 uM) i 60 minutter, eller 50 uM GS til 4 timer, etterfulgt av (20 ug /ml) ST i 4 timer, eller med nikotin (10 uM) i 4 timer, og hele -celle ekstrakter ble forberedt. Seksti mikrogram proteiner fra hel-celle-ekstrakter ble løst i 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran, etterfulgt av blokkering med 5% fettfri melk over natten. Protein ble bestemt ved hjelp av forbedret chemiluminescence metode og analysert av antistoffer mot pBad og PBAX. Blottene ble strippet og reprobed for Bax og dårlige proteiner.
Akt er samlokalisert med Bax i cytoplasma
For å vurdere en potensiell direkte rolle for Akt som en fysiologisk Bax kinase, sub-cellulære fordeling av Akt og Bax ble vurdert ved immunofluorescens farging. Bax var først og fremst samlokalisert med Akt i cytoplasma av SCC4 celler (figur 5A) som tyder på at både ST og nikotin aktivert Akt har potensial til direkte å fosforylere og inaktivere Bax i SCC4 celler.
Fosforylering av Bax og Bad resulterer i oppbevaring av disse proteinene i cytosol og unnlatelse av å målrette mitokondriene
Våre resultater viste at ST og nikotin kan indusere Bax (Ser-184) og Bad (ser-136) fosforylering, og fosforylering på disse stedene resulterte i inaktivering av pro-apoptotisk funksjon av Bax og Bad. Det er vel kjent at den pro-apoptotiske aktivitet av Bax og Bad er avhengig av dets cytosoliske eller mitokondrie lokalisering. For å teste hvorvidt fosforylering av Bax og Uheldige følger dens sub-cellulær lokalisering, SCC4 celler ble holdt ubehandlet eller behandlet med GS (50 uM) i 4 timer, ST (20 ug /ml) i 6 timer og nikotin (10 uM) for fire h. Sub-cellulære fraksjoner ble utført for å isolere mitokondriene og cytosol som beskrevet i materiale og metoder. I ubehandlede SCC4-celler, ble mesteparten av Bax og Bad som finnes i cytosol, og bare en liten mengde av disse proteinene ble lokalisert til mitokondriene (figur 5B). I GS ble observert behandlede celler fleste av disse proteinene i mitokondrie fraksjonen. I motsetning til dette, i både ST og nikotin behandlede celler, Bax og Bad ble hovedsakelig observert i cytosol (figur 5B).
Spesielt, forbehandling av SCC4 celler med GS (50 uM) i 4 timer, etterfulgt ved (20 ug /ml) behandling i 6 timer eller nikotin (10 uM) i 4 timer ST, viste en forskyvning i lokalisering av Bax og Bad og mesteparten av disse proteiner ble observert i mitokondrie fraksjonen (figur 5B). For å bekrefte renheten av subcellulære fraksjoner oppnådd, suksinat-dehydrogenase, et protein eksklusivt til mitokondriene, ble vurdert ved Western blotting. Succinatdehydrogenase, ble påvist bare i mitokondrie fraksjonen og ikke i cytosol (figur 5B), noe som bekrefter renheten av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner. β-aktin ble benyttet som kontroll for å sikre lik protein lasting i alle baner.
SCC4-celler (5 x 10
3) ble sådd ut på dekkglass og inkubert med et muse-antistoff mot human Bax og en kanin antistoff mot menneske AKT antistoffer. Alexa flour®594 -konjugert anti-kanin (rød) og Fluorescein isotiocyanat-konjugert (grønn) anti-muse sekundære antistoffer ble brukt til å visualisere Akt (rød) og Bax (grønn) lokaliserings mønstre ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Panel (i) DAPI farget kjerner i blå farge; (Ii) cytoplasmisk ekspresjon av Bax; (Iii) cytoplasmisk ekspresjon av Akt-protein; og (iv) fusjonerte fotomikrografi (ii) og (iii) viser ko-lokalisering av Bax og Akt. (B) Fosforylering av Bax på (Ser-184) og Bad (Ser-136) resulterer i oppbevaring av Bax og Bad i cytosol. SCC4 celler ble holdt ubehandlet eller behandlet med 50 uM GS i 4 timer, ST (20 ug /ml) i 6 timer, 10 uM nikotin i 4 timer. SCC4 celler ble forbehandlet med 50 uM GS i 4 timer, etterfulgt av ST i 6 timer eller med nikotin i 4 timer. Cytoplasmatiske (C) og Mitokondriell (M) ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i materialer og metoder, og separert på 10% SDS-PAGE. Proteiner ble deretter elektro-overført på PVDF-membran, etterfulgt av blokkering med 5% fettfri melk over natten. Blottene ble inkubert med spesifikke antistoffer mot Bax og Bad. Protein ble bestemt ved hjelp av forbedret chemiluminescence metode. Renheten av subcellulære fraksjoner oppnådd, ble bestemt ved hjelp av western blot for mitokondrie protein, suksinat-dehydrogenase. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
ST og nikotin indusert Bad fosforylering forbedrer samhandling med 14-3-3ζ
Bad fosforylering (ser-136) fremmer sin trans fra mitokondrier i cytosol og samhandling med scaffoldprotein 14-3-3. For å vurdere om ST eller nikotin påvirke Bad krets, ble SCC4-celler behandlet med (20 ug /ml) ST eller nikotin (10 uM) for forskjellige tidsintervaller. Co-immunoprecipitation av 14-3-3ζ og Bad viste en tidsavhengig økning i bundet pBad i immunkomplekser (IP) av 14-3-3ζ indikerer sammenheng mellom 14-3-3ζ og pBad (Figur 6A og 6B), på behandling med henholdsvis ST og nikotin. Lignende resultater ble observert i revers immunoutfellingsstudier analyser, ble western blotting utført for 14-3-3ζ i immunokomplekser oppnådd ved anvendelse av pBad spesifikt antistoff, noe som bekrefter interaksjonen av 14-3-3ζ med pBad (figur 6A og 6B). Disse resultatene tyder på ST og nikotin indusert fosforylering Bad ført binde Bad i cytoplasma, funksjonelt blokkere dens pro-apoptotiske funksjon.
SCC4 ble behandlet med (A) ST (20 ug /ml) eller (B) med nikotin (10 uM) for forskjellige tidsintervaller og immunoutfellingsstudier analyser ble utført ved anvendelse av helcellelysater og analysert ved western blotting som beskrevet i Materialer og Metoder. 14-3-3ζ ble immunpresipitert ved hjelp av spesifikt antistoff og det bundne protein pBad ko-utfelt med 14-3-3ζ ble bestemt ved western blot-analyse. Omvendt immunoutfellingsstudier analyser ble utført hvor pBad ble immunopresipitert, etterfulgt av western-blotting-analyse av 14-3-3ζ ved bruk av et spesifikt antistoff mot dette protein. (C) Figur viser hypotetisk modell for inhibering av ST /nikotin-indusert aktivering av PI3K /Akt veien ved GS. Våre resultater viste behandling med ST og /eller nikotin aktiverer Akt (fosforylert ved Ser-473 og Ser-309) som resulterer i fosforylering av nedstrøms mål Raf, GSK3p, og PS6, mens GS behandling hemmer aktiveringen av Akt veien. Interessant, forbehandling av hode og nakke kreft celler med GS hemmer aktiveringen av Akt og nedstrøms mål (Raf, GSK3p, og PS6) ved eksponering for ST /nikotin. GS forbehandling også utgivelser Bad fra hemmende virkning av 14-3-3ζ, og dermed aktivere indre vei av apoptose. Dermed våre resultater viste GS som en potensiell terapeutisk middel for ST-indusert hode og hals kreftutvikling.
Diskusjoner
Tobakk i ulike former er en av de viktigste etiologiske faktorer for utvikling og progresjon av HNSCC. Avvikende uttrykket av gener som er involvert i cellevekst, overlevelse, angiogenese, invasjon og metastasering i ST forbundet hode og hals kreftutvikling har vært rapportert av vår gruppe og andre [27] – [31]. I denne studien demonstrerte vi aktivering av Akt i HNSCC-celler behandlet med ST /nikotin, dokumentert av vedvarende fosforylering av Akt ved serin 473 og treonin 308, så vel som dens nedstrøms substrater (PS6, GSK3P, pRaf), i en tidsavhengig måte. Både ST og nikotin også indusert fosforylering av oppstrøms kinase PDK1 (Ser241), og P85-subenheten av en annen oppstrøms kinase, PI3K i SCC4 celler. Disse observasjonene er støttet av de tidligere rapporter som viser aktiveringen av PI3K /Akt i dyrkede kortikale neuroner, normal human bronkial og liten luftveis epitel-celler i respons til nikotin behandling [11], [32] – [34]. Videre viste vi både ST og nikotin aktivert Akt, indusert Bad (Ser136) og Bax fosforylering (Ser184) resulterer i cytoplasmatiske oppbevaring av disse proteinene. Men behandling med LY294002, et PI3K /Akt-hemmer, potent hemmet ST og nikotin indusert fosforylering av Bad (Ser-136) og Bax (Ser-184) som resulterer i mitokondrielle relocalization av disse proteinene, ytterligere styrke vår observasjon at ST og nikotin indusert fosforylering av Bad (Ser-136) og Bax (Ser-184) ved aktivering av PI3K /Akt. Interessant, både ST og nikotin indusert fosforylering av Bad (Ser-136) i SCC4 celler økte sin tilknytning 14-3-3ζ som avslørt av co-IP-analyser. Dette resulterer i lagring av Bad i cytoplasma, noe som hemmer den indre vei av apoptose. Tidligere rapporter har vist fosforylering på enten Ser112 eller Ser136 muliggjør dannelsen av et kompleks mellom Bad og 14-3-3s i cytosol, blokkere deres interaksjon med BCL2 /BCL-XL i mitokondriene [35], [36].
Nylig demonstrerte vi overekspresjon av PI syntase, PI3-K og cyclin D1 i ST behandlede celler fra munnsår og munnhulekreft [37]. Videre analyse av kliniske prøver fra muntlige leukoplakic lesjoner uten dysplasi, med dysplasi og muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs), vi ga den første bevis for økt uttrykk av PI syntase i forstadier til munnhule forstadium og kreft og dens korrelasjon med svulst dedifferentiation og tobakk forbruk [37]. Her i utvidet vi disse funnene for å demonstrere GS kunne hemme induksjon av PI3K /Akt ved ST og nikotin.
Dermed hemme induksjon av Akt aktivitet ved ST tobakk komponenter kan være en verdifull tilnærming for å dempe virkningene av tobakk i forbrukere i fare for utvikling av HNSCC, og /eller i HNSCC pasienter som fortsetter å røyke eller bruke ST produkter. I dette henseende, observerte vi at GS trykkes fosforylering av Akt (Ser473 og Thr308), PDK1 (Ser241) og P85-subenheten av PI3K, noe som fører til redusert fosforylering av GSK3P, pRaf, PS6, nedstrøms mål for Akt. Spesielt vår studie viste at GS ikke bare hemmet konstituerende PI3K /Akt vei, men forbehandling avskaffet både ST og nikotin indusert aktivering av PI3K /Akt veien. ST og nikotin avskaffet de pro-apoptotiske virkninger av Bax /Bad av fosforylering og sequestering i cytoplasma, men GS forbehandling hemmet effekten av ST og nikotin, målretting Bax og dårlig til mitokondriene, indusere apoptose. Imidlertid er effekten av GS ikke bestemt og begrenset til hode og nakke kreft celler bare. Vi og andre har vist at anti-kreft-effekter av GS i en rekke kreftcelletyper nemlig hode og hals; leukemi, multippelt myelom, lunge, melanom, eggstokk, tarm avledet adenokarsinom, kolorektal, tarm, hud, prostata, spiserør, og bryst [19], [21] – [24], [38] – [43]
.
i konklusjonen, vår studie viste at både ST og nikotin fremme overlevelse av menneskelige hode og hals kreftceller SCC4, ved å inaktivere de pro-apoptotiske funksjoner av Bax og Bad via sin fosforylering og binde disse proteinene i cytoplasma. GS ikke bare hemmer konstitutivt aktiv PI3K /Akt sti, men også hemmer ST og nikotin indusert aktivering av denne veien og fremmer apoptose signaler i disse cellene (figur 6c). Derfor kan GS bli utforsket som en chemopreventive agent for ST induserte hode- og nakkekreftutvikling.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
z-Guggulsterone (GS), 3 – (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumjodid (PI) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Mouse monoklonalt antistoff mot Bax (sc-7480); kanin polyklonale antistoff mot 14-3-3ζ (sc-1019), pPI3K P85 antistoff (Tyr-508, sc-12929R) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. Rabbit monoklonalt antistoff mot fosfor-Akt (Ser 473, cat-9271), fosfor-Akt (Thr 308, cat-9275), Akt (cat-9272), fosfor-GSK-3β (Ser 9, cat-9336), fosfor -Raf (Ser 259, cat-9421), fosfor-PDK1 (Ser 241, cat-3061), PI3-kinase inhibitor LY294002 (cat-9901) ble alle kjøpt fra Cell Signaling Technology. For samlokalisering studier, geit anti-kanin Alexa Fluor® 594 (Cat ingen A-11012) ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Geit anti-mus FITC (Cat no. F2012) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Protein A-sepharosekuler ble innhentet fra GE Healthcare biovitenskap, (Uppsala, Sverige).
Cell kultur
menneskelige hode og nakke plateepitel karsinom cellelinjer, SCC4 ble innhentet fra American Type Culture Collection ( ATCC) og HSC2 (JCRB0622) ble oppnådd fra Health Science Research Resources Bank (HSRRB), Japan [44], [45]. Begge disse hode og nakke kreft cellelinjer er kjent for å huse mutant p53. SCC4 celler har en punktmutasjon i kodon 51 CCC til TCC og HSC2 celler har en mutasjon i intron 6 [44], [45]. HSC-2 celler Harbor mutert PIK3CA (H1047R) [46]. Både hode- og nakkekreft cellelinjer (SCC4 og HSC2) ble dyrket i monolagkulturer i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma), 1 mM L-glutamin, 1X natriumpyruvat, 1X vitaminer, 1 mM minimum essensielt medium (MEM), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en fuktet inkubator (5% karbon-dioksyd, 95% luft) ved 37 ° C som beskrevet tidligere [47].
Utarbeidelse av Smokeless Tobacco Extract (ST)
Vanligvis brukes merkevare av kurert tobakk (Khaini) ble kjøpt fra det lokale markedet. 25 g tobakk ble finpulverisert og homogenisert i 225 ml destillert vann. Blandingen ble omrørt på en magnetrører i to timer og fikk så stå i 24 timer ved 37 ° C. Deretter ble supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering ved 5000 g i 20 minutter. Ekstraktet ble sterilisert ved å føre den gjennom et 0,22 mikrometer filter og lagret ved 4 ° C inntil bruk. Den endelige konsentrasjonen av tobakk i vandig ekstrakt ble anslått til å være 2,7 g% [48].
Cvtotoksisitetsmålinq
hode og nakke kreft celler (5 × 10
3 /brønn) var utplatet i en 96-brønners plate i 24 timer. Celler ble inkubert in triplo, i nærvær av medium inneholdende ST /nikotin eller 0,02% DMSO som tjente som en bærerkontroll i et sluttvolum på 100 ul i 24-96 timer ved 37 ° C. Celledød ble målt ved tilsetning av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ved 37 ° C i 3-4 timer. De formazankrystaller ble oppløst i 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) og optisk tetthet (OD) ble målt ved bølgelengden 570 nm. Prosenten celledød ble beregnet individuelt for hver dose som følger:. (OD
kontroll-OD
behandlet /OD
kontroll) x 100, som beskrevet tidligere [49]
Western blotting og Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay
Co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser og WB ble utført som beskrevet av oss tidligere [39]. Hel-celle-lysater ble fremstilt fra GS (50 uM) eller nikotin (10 uM) ble behandlet SCC4 celler og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Bradford-reagens (Sigma) og like mengder av protein (50 ug /spor) ble løst i 12% -ig dodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgel. Proteinene ble deretter elektro-overført på polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran. Etter blokkering med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), Blottene ble inkubert med spesifikke antistoffer som per produsentens anbefalte protokoll ved 4 ° C over natten. Protein overflod av α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, California) fungerte som kontrollgruppe for protein lasting i hvert kjørefelt. Membraner ble inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer, (DAKO Cytomation, Glostrup, Danmark), fortynnet i en passende fortynning i 1% BSA, i 2 timer ved romtemperatur. Etter hvert trinn ble blottene vasket tre ganger med Tween (0,1%) – tris-buffer saltoppløsning (TTBS). Proteinbånd ble påvist ved den forbedrede fremgangsmåten kjemiluminescens (ECL, Santa Cruz Biotechnology, California) på XO-MAT film. Co-IP-analyser ble utført som beskrevet tidligere
Sub-cellulær fraksjonering. Isolering av cytoplasma og mitokondrier
hode og hals kreftceller (2 × 10
7) ble behandlet, høstet og vasket en gang med kald 1 x PBS og resuspendert i isotonisk mitokondriell-buffer (210 mM mannitol, 70 mM sukrose, 1 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7,5, 0,1% BSA) inneholdende protease inhibitor cocktail. De resuspenderte celler ble homogenisert med en polytron homogenisator som opererer for fire pakker med 10 s som hver ved en innstilling på 5 og deretter sentrifugert ved 2000 g i 3 minutter for å pelletere kjerner og ubrutte celler. Supernatanten ble sentrifugert ved 13.000 g i 10 min for å pelletere mitokondriene som beskrevet [50]. Supernatanten ble videre sentrifugert ved 15000 g for å pelletere lette membraner. Den resulterende supernatant inneholdt de cytosoliske fraksjoner. Mitokondriene ble vasket med mitokondriell buffer to ganger, resuspendert med 1% Nonidet P-40 lyseringsbuffer, rystet i 60 minutter, og deretter sentrifugert ved 13000 g i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten som inneholdt mitokondrielle proteiner ble oppsamlet. Protein (100 ug) fra hver fraksjon ble underkastet 12% SDS-PAGE og analysert ved western blot-analyse ved anvendelse av anti-cytokrom c antistoff. Renheten av fraksjonene ble bekreftet ved å bestemme lokalisering av fraksjons-spesifikke proteiner, inkludert succinatdehydrogenase for mitokondrier.
Co-lokaliseringsstudier av Akt og Bax i orale cancerceller ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi
hode og hals kreftceller, SCC4 og HSC2, ble dyrket på dekk i DMEM medium supplert med 10% FBS ved 37 ° C og behandlet for konfokal laser skanning mikroskopi som beskrevet av oss tidligere [51]. Celler ble skylt i Dulbeccos PBS (DPBS), fiksert i metanol i 5 minutter ved -20 ° C og inkubert med spesifikke primære antistoffer, muse-monoklonalt anti-Bax og kanin monoklonalt anti-Akt-antistoff, inkuberes som en cocktail ved 4 ° C over natten . Etter skylling i fosfatbuffer saline- 0,1% Tween (PBST, 1X) Dekkglass ble inkubert med anti-muse-FITC-konjugert /anti-kanin Alexa flour®594 konjugert sekundært antistoff i 45 minutter ved 37 ° C i mørket. Dekkglass ble vasket og motfarget med DAPI i 30 sek. En mus-antistoff mot human Bax, et kanin-antistoff mot human Akt, og fluorescein isotiocyanat-konjugert anti-mus (grønn) eller rhodamin-konjugert anti-kanin (rød) sekundære antistoffer ble anvendt slik at cellene kan bli farget samtidig uten kryssreaksjon . I negative kontroller ble de primære antistoffer erstattet med ikke-immun mus-IgG av den samme isotype for å sikre spesifisitet (data ikke vist). Deretter ble platene skyllet og montert i fluorescens monteringsmedium og undersøkt med Lieca TCS SP2 konfokal laser-skanning mikroskopi (CLSM).
