Abstract
Mål
Grape seed procyanidins (PC) er flavan-3-ol oligomerer og polymerer som er kjent for sin biologiske aktivitet i tarmen. Druekjerneekstrakt (GSE) er rapportert å redusere intestinal skade i en rottemodell av mukositt. Vi har søkt å undersøke effektene av rensede PC-fraksjoner som har forskjellig midlere polymerisasjonsgrad (MDP) kombinert med 5-fluorouracil (5-FU) kjemoterapi på levedyktigheten av tykktarmskreftceller (Caco-2).
utforming
SixPC fraksjoner (F1-F6) ble isolert fra Cabernet Sauvignon frø på to modenhet stadier: pre-Veraison umodne (umoden) og moden (modne), utnytte skritt gradient, lavtrykk kromatografi på en Sephadex LH-20 harpiks. Fraksjonene ble testet på Caco-2-celler, alene og i kombinasjon med 5-FU. Eluerte fraksjoner ble karakterisert ved phloroglucinolysis og gelpermeasjonskromatografi. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) assay.
Resultater
Alle isolerte fraksjonene betydelig redusert Caco-2 cellelevedyktighet sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05), men F2 og F3 (MDP 2-6) var de mest aktive fraksjoner (umoden F2 = 32% MDP 2,4, F3 = 35% MDP 5,8 og modnes F2 = 13 % MDP 3,6 og F3 = 17% MDP 5,9, prosentandel av gjenværende levedyktige celler) på Caco-2-celler. Når det kombineres med 5-FU, umodne fraksjoner F1-F3 forbedret celle giftvirkninger av 5-FU med 27-73% (
P
0,05). Modne frø PC fraksjoner (F1-F4) betydelig forbedret toksisitet av 5-FU med 60-83% mot Caco-2 celler (
P
0,05). Dessuten, noen fraksjoner alene var mer potent på avtagende levedyktighet i Caco-2 celler (
P
0,05; umodne fraksjoner = 65-68% og modne fraksjoner = 83-87%) sammenlignet med 5-FU alene ( 37%).
Konklusjoner
PCer MDP 2-6 (umodne F1-F3 og moden F1 og F4) ikke bare styrket effekten av 5-FU i å drepe Caco-2 celler, men også overgått standard 5-FU kjemoterapi som en anti-kreft agent.The bioaktivitet av PC-en er derfor skyldes i hovedsak lavere molekylvekt PCer
Citation. Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy JA, Bastian september (2014) lavmolekylært procyanidins fra Drue Frø forsterke virkningen av 5-fluorouracil Kjemoterapi på
Caco-2
menneske Colon kreft celler. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10,1371 /journal.pone.0098921
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 17 november 2013; Godkjent: 07.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Cheah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Professor Gordon Howarth er støttet av en South Australian Helse og medisin Research Institute Cancer Council seniorforsker Fellowship. Den aktuelle studien ble utført under samarbeidet mellom Wine Science and Business Group, The University of Adelaide og Australian Wine Research Institute (AWRI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP har den nest høyest dødelighet, og er den fjerde mest diagnostisert form for kreft i USA [1]. Den primære behandling av kreft i tykktarmen involverer kirurgisk tarmreseksjon og kjemoterapi, oftest av 5-fluorouracil (5-FU) [2]. Dessverre, kjemoterapi kan ikke skille mellom normale og kreftceller, og det er rettet mot områder hvor cellene er erstattet med en høy hastighet, for eksempel i munnen og tarmen [3]. Dette fører til utvikling av mukositt (gastrointestinal toksisitet). Nåværende mukositt behandlinger er stort sett ineffektive som de målet bare symptomene, men ikke patogenesen av tilstanden [3]. Derfor er det viktig å søke nye alternative behandlinger som ikke bare retter seg mot mukositt, men også forbedre kjemoterapeutisk handling uten at det går utover trivsel for pasientene.
Stadig druekjerneekstrakter (GSEs) blir undersøkt på grunn av deres rapporterte helsemessige fordeler for en rekke lidelser så som kreft [4], kardiovaskulær sykdom [5], [6] og ulcerøs kolitt [7], [8]. Den gode effekten av GSEs har blitt tilskrevet polyphenolic procyanidins (PC) [9], bestående flavan-3-ol subenheter. Polymeren Lengden av PC er beskrevet av graden av polymerisering (DP). På grunn av deres struktur polymerisert, er cellulær absorpsjonen begrenset til oligomerer med lavere DP, slik at de større DP molekyler for adsorpsjon i tarmkanalen etter oral administrasjon [10], [11]. En rekke studier har rapportert polymerisasjon og galloylation av PCer for å være ansvarlig for sine anti-proliferative effekter på transformerte celler [9], [12], [13].
Det er økende bevis som tyder GSEs er effektive ved å redusere spredning av kreftceller uten å være cytotoksisk for normale celler [14]. I tillegg har GSE vist delvis forbedring av tarmskade i en rottemodell av tarm mukositt og har redusert gastrointestinal celle forgiftning etter cellegiftbehandling i normale IEC-6 tarmceller [15]. Imidlertid bioaktive komponenter i GSE er imidlertid ukjent. Hovedmålet med denne studien var å identifisere den kjemiske sammensetningen av de bioaktive PC fraksjoner, og undersøke deres potensial i kombinasjon med 5-FU kjemoterapi, for deres effekt på levedyktigheten av tykktarmskreftceller. Når du er i kombinasjon med 5-FU, enkelte PC fraksjoner ytterligere forsterket toksisitet i tykktarm kreft celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelser
Cabernet Sauvignon druer prøver ble innhentet fra kommersiell vingårder, Accolade Wines (Orlando) i Langhorne Creek voksende regionen i Sør-Australia, som har en breddegrad 35 ° 16’11.56 «S og lengdegrad 139 ° 00’14.47» E, med en høyde ca 28 m over havet. Ingen tillatelser var nødvendig for den beskrevne studien, som overholdt alle relevante forskrifter
Grape prøvetaking og klargjøring
Drue prøver ble samlet inn på ulike stadier av modenhet:. Umodent (preveraison, grønne frø) og moden (25-26 ° Brix, brune frø) i løpet av 2009 vekstsesongen. Drue bær ble fremstilt i henhold til en tidligere beskrevet metode [16] hvori druer ble oppsamlet og holdt frosset ved -20 ° C. Mens han fortsatt frosset, ble frøene fjernet fra kjøttet med en skalpell. Frø ble deretter tørkes av kjøtt med et papirhåndkle og re-frosset ved -20 ° C før ekstraksjon.
Utarbeidelse og utvinning av frø procyanidins (PC)
PC utvinning påbegynt ved å trekke ut frø (100 g) over natten i 18 timer i 70% aceton (200 ml, v /v) og askorbinsyre (1 g /l). Ekstraktet ble konsentrert under redusert trykk ved 35 ° C (HeidolphLaborota 4011 rotasjonsfordamper, John Morris Scientific, Adelaide, Australia), og lyofilisert til et tørt pulver (Dynavac FD3 frysetørker, Dynavac Pty Ltd, Sydney, Australia). Rentene for hver prøvene var: umoden 6,31 g og moden 10,29 g. PC frø pulver (5 g) ble oppløst i 50 ml metanol (60%, v /v) inneholdende trifluoreddiksyre (TFA) (0,05%, volum /volum) og deretter påført (~18.3 ml /min) til en 300 mm x 21 mm glasskolonne (Michel-Miller, Vineland, NJ, USA) inneholdende Sephadex LH20 kromatografi harpiks (Amersham, Uppsala, Sverige) til en omtrentlig sjiktvolum på 93 ml, og vasket ut i 250 ml metanol (60%, vol /v) inneholdende TFA (0,05%, volum /volum) for å fjerne lavmolekylære monomerer. PC ble deretter utvunnet i 150 ml vandig aceton (70%, v /v), og ekstraktene ble konsentrert i en rotasjonsfordamper ved 35 ° C for å fjerne aceton. Den vandige løsning ble ekstrahert med heksan for å fjerne gjenværende lipofilt materiale ved hjelp av en skilletrakt. Det vandige ekstrakt ble frysetørket til pulver og gjenvunnet mengde for to ekstrakter ble; umoden, 2,5 g og moden, 0,9 g henholdsvis. Pulvere ble holdt under nitrogen og ved -20 ° C før fraksjoneringen.
For fraksjonering av PC’er, frø PC-pulver (0,5 g) ble oppløst i metanol (60%, v /v) inneholdende TFA (0,05% , v /v) og påføres på samme kolonne under identiske betingelser. PC kjerneekstrakt ble fraksjonert i henhold til en trinn-gradient metode som er beskrevet tidligere [16] for å fremstille 6 fraksjoner med økende midlere polymerisasjonsgrad (MDP) og molekylvektene til PCer betegnet som F1 til F6. De eluerte fraksjoner ble konsentrert under trykk ved 35 ° C for å fjerne organiske oppløsningsmidler og videre inn i frysetørket pulver. De isolerte fraksjonene ble lagret ved -20 ° C før analyse. Druefrøekstrakt var en generøs gave fra Tarac Technologies (GraPex frø tannin, North Adelaide, South Australia) og ble inkludert i studien som en kontroll. GSE (1 g) ble oppløst i metanol (60%, v /v) inneholdende TFA (0,05%, volum /volum) og fraksjoneres deretter.
Acid katalyse av PC i nærvær av overskudd av floroglucinol (Phloroglucinolysis)
Phloroglucinolysis ble benyttet for å bestemme subenhet sammensetning, MDP og galloylation av PC. Pholoroglucinolysis ble utført i henhold til en tidligere beskrevet metode [16]. Seed fraksjoner ble oppløst i metanol (10 mg /ml, v /v) og like store volumer (25 ul) av ekstrakt og floroglucinol-løsning (0,2 N HCl og 100 g /l floroglucinol og 20 g /l askorbinsyre) for å gi en endelig PC-en konsentrasjon på 5 g /l. Den phloroglucinolysis Reaksjonen ble utført ved 50 ° C i 25 minutter og analysert ved hjelp av RP-HPLC ved anvendelse av (-) -. Epicatechin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) som standard kvantitative
gelpermeasjonskromatografi ( GPC)
Gelfiltreringskromatografi ble utført basert på en tidligere beskrevet metode [16]. GPC-teknikk kjennetegner informasjon om størrelsesfordelingen av PC for hver fraksjon. Fraksjonerte prøver (10 mg /ml) ble oppløst i metanol og fortynnes videre med 4 volumer av HPLC mobil fase (
N, N-dimetylformamid
inneholdende iseddik (1%, volum /volum), vann (5 %, v /v) og 0,15 M litiumklorid). Strømningshastigheten ble opprettholdt ved 1 ml /min med kolonnetemperatur på 60 ° C en og eluering ble overvåket ved 280 nm. Den maksimale mengden av PC injisert på kolonnen var 40 ug. PC frø fraksjoner fra en tidligere studie [17] ble brukt som standarder for kalibrering. Kalibreringskurver av fraksjonerte PC-er med sin kumulative massefordeling ble plottet, og den midlere molekylvekt av fraksjonene som ble forutsagt ved 50%.
Ferric reduksjons antioksidant effekt (FRAP) assay
Denne analysen ble utført ut følger en modifisert protokoll [18]. I korthet ble FRAP-reagens fremstilt (300 mM acetatbuffer, pH 3,6, 10 mM 2,4,6-tri [2-pyridyl] -s-triazin (TPTZ) oppløsning i 40 mM HCL, 20 mM toverdig jernklorid; på 10: 01:01 volum /volum) og holdt i mørke ved 37 ° C før analyse. Fraksjoner ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) (0,1 mg /ml) og 15 ul ble tilsatt til 96-brønners plater. 15 ul av FRAP-reagens ble tilsatt til brønnene inneholdende fraksjonene og platen ble avlest ved 593 nm etter 4 min (Multiskan Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finland) ved anvendelse av Skanit programvare 2,2. Ferrosulfat (0,1-1 mM) ble anvendt for å konstruere en standardkurve og FRAP verdier av testforbindelsene ble uttrykt som mMFe (II) /g av prøven. Hver behandling ble testet i triplikat, og hele eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter.
Cell fremstilling og eksperimentell behandling
human koloncancer cellelinje, Caco-2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) ved 37 ° C og i en 5% CO
2 inkubator. Media ble skiftet to ganger i hver uke. PC-fraksjoner ble oppløst i DMSO og holdt ved -20 ° C før analyse. Caco-2-celler ble sådd ut ved 1000 celler /brønn i 96-brønners vevskulturplater (Grenier Bio-en, Victoria, Australia) og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 i 48 timer for å tillate festing. Etter 48 timers inkubering ble mediet erstattet med forskjellige konsentrasjoner av frø fraksjoner oppløst i DMEM (ug /mL) inneholdende 0,025% (v /v) DMSO og 5-FU (100 pM) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd., Victoria, Australia). Celler ble ytterligere inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 til 24, 48 og 72 timer.
MTT-analysen
(3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl ) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) analyse ble utført på grunnlag av en tidligere beskrevet metode, med ubetydelig modifikasjon [19]. Etter eksponering til de behandlinger (frø ekstrakter og 5-FU), 50 ul av MTT (1 mg /ml i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning) ble tilsatt til hver brønn og ytterligere inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 etter 4 timer. Etter 4 timer ble mediet aspirert og 100 ul DMSO tilsatt for å oppløse det formazanprodukt. Platene ble plassert på en risteinkubator i 15 minutter og avlest ved 570 nm med et UV-spektrofotometer. Hver behandling ble testet i triplikat, og hele eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. Data ble uttrykt som antallet levedyktige celler sammenlignet med prosentandelen av kontroll-celler behandlet med serumfritt DMEM. Kontrollceller representere enten celle behandlet med serumfritt DMEM bare eller celle ble behandlet med 100 uM 5-FU.
Statistisk analyse
Hver celle-baserte forsøk ble utført minst 3 ganger. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av XLSTAT versjon 12.0 for Windows eller PASW statistikk versjon 18. Statistisk analyse ble bestemt av to-veis ANOVA med Tukey sin
post-hoc
test.
En Pearsons korrelasjonskoeffisient ble beregnet for å bestemme forholdet mellom celle viabilities, PC-sammensetningen og antioksidant verdi. Statistisk signifikans ble ansett på
P
. 0,05
Kjemi
Aceton, askorbinsyre, metanol, trifluoreddiksyre (TFA), floroglucinol, (-) – epicatechin, N, N-dimetylformamid, lithium klorid, natrium-acetat (CH3COONa), 2,4,6-tri [2-pyridyl] -s-triazin (TPTZ), ble toverdig jernklorid og metanol innkjøpt fra Sigma Chemical Co Ltd, St Louis , MO. Saltsyre (HCl), iseddik, Folin-reagens ciocalteau og ferrosulfat ble anskaffet fra AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australia. Vevskultur løsninger omfatter Dulbeccos modifiserte Eagles Minimum Essential Medium (DMEM), Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning, dimetylsulfoksid (DMSO) og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) ble kjøpt fra Gibco BRL, Rednings Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. ; Eksporter
Instrumentering
En Agilent modell 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd, Melbourne, Australia) ble brukt sammen med ChemStation programvare for kromatografiske analyser.
Resultater
Karakterisering av PC fraksjoner
GSE ble inkludert i studien som en kontroll. PC-sammensetningen av GSE er vist i tabell 1. Sammenlignet med Cabernet Sauvignon frø ekstrakter, GSE hadde lav masse omdannelse (23,8% vekt /vekt), og også en lavere molekylvekt, målt ved GPC og phloroglucinolysis. PC-kontakten subenheter i GSE var for det meste dominert av (-) – epicatechin-3-
O
-gallate. På grunn av den tilsynelatende lave bidraget av PCer i GSE, isolert vi PCer fra fersk Cabernet Sauvignon frø høstet på ulike stadier som tidligere rapporter viste en høymesse konvertering i ubehandlet drue frø [16].
Sammenligning av renset PC fra begge frøprøver, umodne frø hadde høyere masse konvertering (87%) sammenlignet med modne frø (71%) (tabell 2). De rensede PCer ble videre fraksjonert i 6 fraksjoner med økende MDP eller molekylvekt. Massen omdanningsutbytte for omdannelse av PC til kjente PC var 49%, med unntak av den høyeste MDP F6 (ca. 37%). De store forskjellene mellom umodne og modne frø fraksjoner var at modne fraksjoner hadde en høyere andel av (-) – epicatechin terminal subenheter (9-30%) i forhold til de umodne fraksjoner (2-11%). Både modne og umodne frø fraksjoner viste et lignende mønster av avtagende (-) – epicatechin terminal subenheter med økende MDP. Interessant, økninger i polymerisasjon eller molekylvekt ble i hovedsak styrt av (-) – epicatechin-3-
O
-gallate skjøte subenheter. Den galloylation av umodne fraksjoner varierte 15-35% og modne fraksjoner varierer 9-24%. Umodne F2 hadde høyest galloylation (35%), hovedsakelig drevet av en høy andel av (-) -. Epicatechin-3-
O
-gallate (88%)
Antioxidant kapasitet på frø fraksjoner
den antioksidantkapasitet av frø fraksjoner ble målt ved FRAP analysen (figur 1). GSE, som inneholdt en blanding av oligomerer og polymerer av PC-er, ble inkludert som en positiv kontroll for å bestemme den antioksidantaktiviteten av frø fraksjoner. Sammenlignet med GSE (5 mM /g), alle fraksjonene hadde høyere FRAP-verdier, som strekker seg 5,4 til 8,8 mM /g. Den antioksidant kapasitet av fraksjonene ble redusert i de mer polymeriserte PC-fraksjoner. De FRAP-verdiene ble negativt korrelert med MDP (R «> 2 = -0,81,
P
0,05).
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble bestemt ved enveis ANOVA med Tukey sin
post-hoc
test. Verdier med ulike bokstaver (a, b, c) i hver kolonne er statistisk forskjellig på P . 0,05
Effekter av frø fraksjoner på levedyktigheten til Caco-2 celler
cytotoksiske virkninger av frø fraksjoner på Caco-2-celler ble bestemt ved MTT-analysen (figur 2). Caco-2-celler ble eksponert til frø fraksjoner i 72 timer og dataene er uttrykt som IC
50, definert som den dose av hver forbindelse som inhiberte cellelevedyktigheten til 50%, som representerer den midlere verdi av tre uavhengige eksperimenter. Alle fraksjoner som viste en grad av toksisitet som vist ved redusert absorbans-verdier. IC
50value (gjennomsnitt av de tre uavhengige eksperimenter) for umodne frø fraksjoner (F1-F6) varierte 17,7 til 70,2 mg /ml (Figur 2A). Antall levedyktige celler ble positivt korrelert med MDP av umodne frø fraksjoner (r
2 = 0,48,
P
0,05) dvs. fraksjonene med høyest MDP (F5 og F6) var mindre giftige til Caco-2 celler. Lignende trender i form av cytotoksiske effekter ble også observert ved anvendelse av modne frø fraksjoner (figur 2B), hvor antallet levedyktige celler ble likeledes korrelert med MDP av fraksjonene (R «> 2 = 0,50,
P
0,05). Modne frø fraksjoner oppviste sterkere cytotoksisitet i forhold til umodne frø fraksjoner (figur 2A og 2B).
Data er uttrykt som IC
50 eller dose (ug /ml) inhibering av cellelevedyktigheten til 50% (gjennomsnitt ± SEM ) av 3 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble bestemt ved enveis ANOVA med Tukey sin
post-hoc
test. Verdier med ulike bokstaver (a, b, c) i hver kolonne var statistisk forskjellig på P . 0,05
Den kombinerte effekten av isolerte frø fraksjoner og 5-FU på levedyktigheten til Caco-2 celler
Den kombinerte effekten av frø fraksjoner og 5-FU på Caco-2 celler ble undersøkt (figur 3). For umodne frø fraksjoner, ble levedyktigheten til Caco-2-celler i betydelig grad hemmet av alle frø fraksjoner (figur 3A). Sammenlignet med GSE (67%), F2 og F3 av umodne kjerneolje ekstrakter var mer toksiske for Caco-2-celler (F2, 32% og F3, 35% av kontrollverdien,
P
0,05). Men når frø fraksjoner var til stede med 5-FU (100 UM), veksthemmende effekten av 5-FU ble betydelig forbedret (
P
0,05) (figur 3A). 5-FU betydelig redusert cellelevedyktigheten til 62% av kontrollverdiene (
P
0,05). F1-F3 forbedret betydelig vekst hemmende aktiviteten av 5-FU (27%, 73% og 56% sammenlignet med 5-FU kontroll;
P
0,05). F2 kan derfor betraktes som en mer potent kjemoterapimiddel enn ufraksjonert kommersielt tilgjengelige GSE, som bare forbedret veksthemmende virkning av 5-FU med 55% (
P
0,05, sammenlignet med 5-FU-kontroll). Videre har vi også funnet at umodne F2 (32%) og F3 (35%) var mer potente enn 5-FU (62% av kontrollverdien;
P
0,05) ved reduksjon av Caco-2-levedyktighet.
data er presentert som prosentandel av cellelevedyktighet i forhold til levedyktigheten av kontrollceller. Data er uttrykt som middelverdi ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble bestemt av to-veis ANOVA med Tukey sin
post-hoc
test. Verdier med forskjellige bokstaver (a, b, c) i hver kolonne var statistisk forskjellige ved P 0,05. * Angir signifikante forskjeller på 5-FU-behandlede gruppen sammenlignet med 5-FU-kontroll.
Modne frø fraksjoner virker på en lignende måte som i umodne frø fraksjoner (figur 3B). Modne frø fraksjoner betydelig redusert celleviabilitet (
P
0,05). F2 og F3 var mer cytotoksisk til Caco-2-celler (13% og 17% henholdsvis,
P
0,05) enn GSE (47%) (figur 3B). Når celler ble eksponert til frø fraksjoner og 5-FU, alle frø fraksjoner forbedret kapasitet av 5-FU til å redusere cellenes levedyktighet. GSE betydelig forbedret veksthemming av 5-FU med 49%. Imidlertid F1-F4 forbedret i betydelig grad den veksthemmende virkning av 5-FU (62%, 83%, 80% og 60% henholdsvis sammenlignet med 5-FU-kontroll;
P
0,05). Videre, F2 (13%), F3 (17%) og F4 (50%) fraksjoner var mer potent enn 5-FU alene (65% av kontrollverdien;
P
0,05) (figur 3B ).
Diskusjoner
Grape seed PCer har blitt rapportert å utøve helsefremmende egenskaper, spesielt i tarmen [14], [15], [20], [21]. I tillegg til sin anti-kreft-effekt, er GSE blitt demonstrert å redusere gastrointestinale bivirkninger etter kjemoterapi behandling i friske dyr og i normale tarmceller [15]. Selv om det er økende bevis for å støtte de kjemoterapeutiske egenskaper GSE i tykktarmskreft, identifisering av bioaktive komponenter ansvarlige forblir udefinert.
I denne studien, PC fraksjoner isolert fra kommersielt tilgjengelig GSE viste forskjellige mDPs og molekylære størrelser. Men disse fraksjonene hadde svært lav konverterings utbytter ( 37%), noe som indikerer at mindre enn 40% av de fraksjoner ble karakterisert ved anvendelse av de valgte analyseteknikker, som var uakseptabel for denne studien. Forklaringen på den lave omdanning i PC fractionsmay har vært på grunn av oksidasjon oppstår under generasjon GSEs fra vinproduksjon prosessen. Dermed ble det besluttet å isolere PC fraksjoner av ferske druer som samles på ulike løpetider: umoden (pre-Veraison) og moden (moden). Denne beslutningen var basert på observasjon at umodne frøene har en høyere konverterings avkastning enn modne frø [22], er underbygget av den aktuelle studien. Videre er fremtidige studier benytte massespektrometri garantert å ytterligere definere renheten av PCer isolert fra drue frø.
Den cytotoksiske effekten av PC-fraksjoner på kreftceller har blitt rapportert tidligere [9], [12], [13 ]. Men om disse effektene oppsto gjennom ekstracellulære signal eller etter opptak av PC-er ble ikke forsøkt. Denne studien viste at de mest aktive fraksjoner som påvirker levedyktigheten til Caco-2 celler inneholdt mindre oligomerer: F2 og F3. De mer potente cytotoksiske effekter observert i Cabernet Sauvignon frø fraksjoner i forhold til GSE kan ha reflektert en lavere PC avkastning i GSE (~24%) sammenlignet med PC isolert fra friske druer (-60%).
Absorpsjon av PC over cellemembraner var i stor grad avhengig av deres mDPs [23], [24]. Bare visse lavere MDP PCer blir absorbert under transporten i tarmen, slik at de større MDP PCer (MDP 7) avsatt i tarmkanalen. Dette resultatet støtter den gjeldende data hvorved F2 og F3 (MDP 2-6) og sannsynlighet for å bli absorbert på tvers av cellemembraner var mer potent enn fraksjoner med en høyere MDP, som utøver et eneste overflatevirkning. Imidlertid, F2 og F3 var mer bioaktive enn F1, muligens på grunn av deres høyere prosentandel av galloylation og andelen av epicatechin-3-
O
-gallate som terminal-subenheter, sammenlignet med F1. Dette resultatet er i tråd med andre studier der PC-fraksjoner med høyere galloylation var mer cytotoksisk enn PC-fraksjoner med lavere galloylation når testet på tykktarmskreftceller [9], [25]. Men selve mekanismen av PCer på cellevekst er fortsatt ukjent. Absorbert PC kan spille en viktig rolle i å forstyrre cellesignalveier. PC-er er rapportert å være inhibitorer av androgen-reseptorer i prostatakreftceller [26], [27] og epidermal vekstfaktor-reseptorer på tykktarmskreftceller [28]. I tillegg er PC-er kjent for å dempe PI3-kinase (serin /treonin proteinkinase) svei [14] som kan føre til induksjon av cellesyklus-stans ved G1 fase [20] og aktivering av apoptose-induserende bane [29]. Fremtidige studier som undersøker endepunktene av cellevekst og apoptose inkludert PI opptak, caspase 3-aktivitet og sub-G1 DNA innhold er garantert.
Tidligere funn har vist at den cytotoksiske effekten av PC-er er avhengig av deres MDP [9] , [1. 3]. Likevel, denne studien viste at fraksjoner med høyere MDP (7-16) mislyktes i å utøve cytotoksiske effekter på tykktarmskreftceller. Men denne studien anvendes et annet løsningsmiddelsystem for å isolere PC-fraksjoner i forhold til andre studier [9], [30]. Denne oppløsningsmiddel-system isolerer PC-fraksjoner med et bredere spekter av molekylvekt (619-6063 g /mol) og MDP (2-9) sammenlignet med andre metoder (molekylvekt på 552-1232 g /mol, MDP 1-4); noe som tyder på at tidligere studier kun målt begrenset PC fraksjoner ( 1200 g /mol). for sine biologiske aktiviteter
Den antioksidantkapasitet på PCer er i stor grad avhengig av deres grad av polymerisering og galloylation [9]. Reduksjonen av metallioner, som målt ved FRAP-analysen, er antatt å være positivt korrelert med antall hydroksylgrupper som er tilstede i molekylene, og at festepunktene til overgangsmetallioner i flavonoid molekylene er ved
o
-catechol gruppe ring B [31]. Imidlertid var dette ikke tilfelle i denne studien. PC-fraksjoner med høyere MDP var svakere antioksidanter, som er i overensstemmelse med tidligere studier [32], [33]. Fraksjoner med større underenheter har en tendens til å selv-aggregering og føre til stereokjemisk hindring [33], [34], for derved å eksponere færre hydroksylgrupper for radikal-fjernende aktiviteter. Fremtidige studier bør utføres for å løse de antioksidantegenskaper av drue frø PCer inkludert virkningen på mobilantioksidantstatus.
Den aktuelle studien ble utført basert på grunnlag av en tidligere studie av GSE og kjemoterapi på levedyktigheten til colon kreftceller [35]. Dosene av druekjerneolje-fraksjoner i denne studien ble valgt ut på grunnlag av denne tidligere studie. 5-FU er en anti-metabolitt medikamenter som blokkerer DNA-syntese via hemming av tymidylatsyntase [3] .Da kjerneekstrakt fraksjoner ble kombinert med 5-FU, de har ikke bare forbedret virkningen av 5-FU i å drepe Caco-2-celler, men også gått 5-FU som et middel mot kreft. I denne studien, ble effekten av PC-fraksjoner og 5-FU på Caco-2 cellelevedyktighet undersøkt i løpet av 24-72 timer. 5-FU (100 uM) signifikant redusert kreftceller levedyktighet til 60-80%, gastrointestinal toksisitet hos kreftpasienter. Eksponering av PC fraksjon og 5-FU til celler i 24-48 timer gjorde viser en trend mot en synergistisk effekt, men var ikke signifikant (data ikke vist). I tillegg kan større tidseksponering (72 timer) til PC-fraksjoner og 5-FU medførte største reduksjon av cellenes levedyktighet. Den aktuelle studien viser også at modne frø fraksjoner var bedre enn umodne frø fraksjoner som kjemoterapeutiske midler mot tykktarmskreft
in vitro
. Den kjemiske profilen av de modne frø fraksjonene viste at disse effektene kan bli drevet av sin høyere andel av (-) – epicatechin som terminal-subenheter i forhold til den umodne kjerneekstrakt. En annen mulig forklaring kunne ha vært innenfor hver fraksjon av en høyere andel av lavmolekylært materiale i de modne frø enn umodne frø.
studien viste at de mest aktive fraksjoner påvirker levedyktigheten av Caco-2- var F2 og F3. Men om disse effektene oppsto gjennom ekstracellulære signal eller etter opptak av PC-er er ikke kjent. Videre studier er garantert for å bestemme den intestinale absorpsjon av PC-fraksjoner i normale tarmcellelinjer. TheMTT assay er et indirekte mål på cellelevedyktighet på grunnlag av metabolsk aktivitet. Reduksjonen av cellelevedyktighet observeres i denne studien kunne tilbakeføres til en effekt på cellesyklusen eller celleproliferasjon. Derfor ytterligere studier undersøker cellesyklus, celleproliferasjon og celledød aktiviteter (Annexin V /PI flekker, LDL utgivelsen analyse, caspase-3 og BCL-2 kvantifisering) kunne dokumentere virkningen av bestemte størrelser av PCer oncell signalering. Testing PC fraksjoner i andre kolon cellelinjer (normale og neoplastiske) kan utelukke generell toksisitet og gi ytterligere bevis på PC potensial.
I konklusjonen, er videre studier garantert å bestemme molekylære mekanismen for F2 og F3 på mobilnettet trasé assosiert med colonic neoplasi. Modne frø PC ekstrakter ikke bare har potensielle bruksområder i menneskers helse, men alsoin turn verdi legge til vinproduserende bransjen, som de modne drue frø er den viktigste biprodukter av vinproduksjon. Våre data gir overbevisende bevis for at kombinerer PC-fraksjoner og 5-FU kan være en potensiell chemopreventative middel i tykktarm kreft behandlingsregimer; imidlertid ytterligere bekreftende
in vitro
studier er nødvendig med ulike klasser av cytostatika etterfulgt av
in vivo
kreft modellforsøk for å bedre definere potensielle rolle druekjerne PCer mot tykktarmskreft.
