Abstract
Bakgrunn
For å etablere, karakterisere og belyse mulige mekanismer for ervervet bleomycin (BLM) motstand ved hjelp av humane kreftcellelinjer. Syv BLM-resistente cellelinjer ble etablert ved å utsettes for økende konsentrasjoner BLM over en periode på 16-24 måneder. IC
50 verdier og celle dobling ganger ble kvantifisert ved hjelp av en sanntid cytotoksisitet analysen. COMET og γ-H2AX analyser, cellesyklusanalyse og apoptose vurderings ytterligere undersøkt mekanismene for BLM motstand i disse cellelinjene.
Resultater
I forhold til foreldrecellelinjer, sanntid cytotoksisitetsassayer avslørt 7 til 49 gangers økning i IC
50 og en gjennomsnittlig dobling tid økning på 147% (fra 64% -352 %) i BLM-resistente kloner sub-(p 0,05 for begge). Høyere vedlikeholds BLM konsentrasjoner ble assosiert med høyere IC
50 og økt dobling ganger (p 0,05). Betydelig redusert DNA-skade (COMET og γ-H2AX assays), G2 /M arrest, og apoptose (p 0,05 for hvert sett av sammenlignings) etter høy-dose akutt BLM eksponering ble observert i resistente sub-kloner, sammenlignet med deres BLM- sensitive foreldre kolleger. Tre uker med BLM-fri dyrking resulterte i en delvis tilbakeføring til BLM følsomhet i 3/7 BLM fast under kloner (p 0,05).
Konklusjon
Bleomycin motstand kan være assosiert med redusert DNA skade etter bleomycin eksponering, noe som resulterer i redusert G2 /M arrest, og redusert apoptose
Citation. Wang Q, Cui K, Espin-Garcia O, Cheng D, Qiu X, Chen Z, et al. (2013) Motstand mot bleomycin i kreftcellelinjer er preget av langvarig Dobling Time, Redusert DNA Damage og Evasion av G2 /M og apoptose. PLoS ONE 8 (12): e82363. doi: 10,1371 /journal.pone.0082363
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 7 juli 2013, Akseptert: 23. oktober 2013, Publisert: 04.12.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Princess Margaret Hospital Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bleomycin (BLM) er en glykopeptidantibiotikumet isolert fra
Streptomyces verticillis product: [1,2]. Som et kjemoterapeutisk middel, er det brukt i behandlingen av flere svulster, inkludert men ikke begrenset til testikkel karsinomer, lymfomer og hode og nakke kreft [3,4]. Selv om den fullstendige passasje i stoffets virkningsmekanismen ikke er klarlagt, ikke BLM bindes til jern og oksygen for å fremstille reaktive oksygenarter (ROS) [5] som induserer enkelt- og dobbeltkjedet DNA bryter, med den sistnevnte er først og fremst ansvarlig for sin anti-tumoreffekter [6,7]. Det fører også lipidperoksidasjon og mitokondrie DNA skade [8]. Utvidet cellesyklus-stans /senescence, apoptose og mitotisk celledød er de mest vanlige cellulære responser til BLM behandling [9].
BLM ble funnet å indusere G2 /M cellesyklus arrest i kreftcellelinjer [10,11]. Dette kan forklares med en G2 /M sjekkpunkt svar på DNA-skader. G2 /M sjekkpunkt er viktig for genomisk stabilitet, for det sikrer at kromosomer er intakt og klar for separasjon før celler inn mitose [12]. I motsetning til G1 sjekkpunkt, er G2 /M sjekkpunkt gener ofte ikke mutert i kreftceller [13].
Motstand mot BLM er en klinisk bekymring, og vanligvis oppstår under tilbakefall i bakterie celle svulster, hvor BLM er mest brukt klinisk. Selv om mekanismen for BLM-resistens er uklar, er det flere muligheter foreligger, inkludert: (a) endret BLM inntak og effluks [14,15]; (B) forhøyet antioksidant nivå [5,11]; (C) forbedret reparasjon evne for BLM-indusert DNA skade [14,16,17]; og (d) økt metabolisme (inaktivering) av BLM [17-19].
Utviklingen av BLM motstand fungerer som en viktig mekanisme for unndragelse av kjemoterapeutiske utrydding i kreftceller. Men de mekanismene som er ansvarlig for ervervet BLM resistens i humane tumorceller har ikke blitt godt undersøkt. I denne studien vi etablert BLM-resistens i syv humane kreftcellelinjer, inkludert linjer av tumortyper behandlet med BLM og andre som er kjent for å være enten sensitiv eller resistent overfor BLM. Videre preges vi disse cellelinjer med hensyn til deres nivå av BLM-motstand, skade BLM-indusert DNA, dobling tid, cellesyklus distribusjon, og graden av apoptose (før og etter BLM behandling) for å øke vår forståelse av de potensielle mekanismer motstand.
Materialer og metoder
Celler og cellekultur
Syv kommersielt tilgjengelige menneskelige kreftcellelinjer med store forskjeller i medfødt følsomhet /resistens mot BLM (HOP62, ACHN, NT2 /D1, SF-295, NCCIT, NCI-H322M, og MBA-MB-231) ble valgt fra National Cancer Institute (NCI) eller American Type Culture Collection (ATCC) [20]. To (NT2 /D1, NCCIT) var testikkelcellelinjer (tabell 1).
Cell linje
forkortelse (foreldre /Resistant)
Avledet fra hvilken krefttype
Foreldre IC
50 (mikrogram /ml) *
ACHNACHN
0Renal celle carcinoma0.009ACHN
0.25HOP-62HOP
0Lung adenocarcinoma0.11HOP
0.05SF-295SF
0CNS glioblastom 0.14SF
0.4NT2 /D1NT2
0Germ celle carcinomaN /ANT2
0.1NCCITNCCIT
0Germ celle carcinomaN /ANCCIT
1.5NCI-H322MH322M
0Lung adenocarcinoma25.8H322M
2.5MDA-MB-231MB231
0Breast adenocarcinoma27.9MB231
3.0Table 1. Beskrivelse av cellelinjer.
Merk: Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP med senket «0» indikerer foreldre (kontroll) linjer (f.eks HOP
0). De resistente under kloner har en indeks som identifiserer vedlikehold BLM konsentrasjonen, i mikrogram /ml (f.eks HOP
0,05). * Data hentet fra NCI-60 narkotika screening panel [20]. CSV Last ned CSV
NT2 /D1 ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Andre linjer ble dyrket i RPMI 1640. Betingelsene var 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2. Cellene ble dyrket som monolag i 75 cm
2 cellekultur kolber med mindre annet er oppgitt. Alle cellelinjer testet negativt for mykoplasmaforurensning ved Polymer (PCR) metoder [21]. Cellelinjer ble autentisert bruker Short Tandem Gjentar (STR) testing [22].
Etablering av bleomycin-resistente kloner sub-fra foreldre (kontroll) cellelinjer
Å utvikle BLM-resistens, cellene ble kontinuerlig utsatt for trinnvise økninger i konsentrasjonen av BLM over en periode på 16 til 24 måneder. I korthet ble cellene sådd ut ved en tetthet på ~ 5 x 10
5 /ml i en T75 cellekulturflaske med 10 ml komplett vekstmedium. Etter 4-6 timers inkubering, forholdsvis lave konsentrasjoner av BLM (som varierer fra 0,01 til 0,1 ug /ml, avhengig av medfødt BLM-følsomhet), oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS) uten Ca
2 + og Mg
2+, ble tilsatt til mediet. Celler ble forlatt i BLM i 2 til 4 uker eller inntil en stabil celle re-populasjonen dannet. Regelmessig medium fylling ble utført i hele denne perioden. BLM konsentrasjonen ble deretter økt med 0,5 til 2 ganger. Denne trinnvise doseeskalerings fortsatt i 16 til 24 måneder før BLM konsentrasjonen nådde minst ti ganger utgangskonsentrasjonen. Deretter ble alle BLM-resistente cellelinjer ( «BLM-resistente under kloner») opprettholdes i sin høyeste oppnådde BLM konsentrasjon ( «vedlikeholdsdose»). På samme tid, ble regelmessig passasje av foreldrecellelinjer utføres parallelt med den BLM-motstand etablering prosess.
BLM sensitivitetstesten og fordoblingstiden analyse
Før BLM motstand /sensitivitetsvurderingen (cytotoksisitet assay), en celle proliferasjonsanalyse ble utført på xCELLigence systemet (Roche, USA) for å identifisere optimale forhold under hvilke sanntid cytotoksisitet analysen bør være i gang. Nærmere bestemt ble det proliferasjonsanalyse utført: a) for å identifisere den optimale seeding tetthet for cytotoksisitet assay for hver av de cellelinjer; og b) for å bestemme varigheten av cytotoksisitet analysen.
proliferasjonsanalyse ble utført ved poding ulike antall celler i en 96-brønns plate (E-plate 96, Roche, USA) i fire eksemplarer, etterfulgt av sanntids overvåkning av cellevekst i opp til 7 dager . Tjuefire timer etter såing, ble halvparten av brønnene på platen behandlet med BLM for å bestemme den cellulære respons. Den proliferasjonsanalyse ble gjentatt to ganger for hver cellelinje. Optimale seeding densiteter for hver linje ble valgt på grunnlag av dramatiske endringer i proliferasjon ved 72-96 timer etter BLM behandling og små variasjoner på tvers av replikate brønner.
For cytotoksisitetsanalyser, celletallet ble først utført, og celler ble deretter sådd ut triplikate brønner med 180μl av BLM-fritt celledyrkningsmedium på en 96-brønns plate. Tjuefire timer etter innledende plating, ble 20 ul av cellekulturmedium inneholdende seriefortynnet BLM i området fra 0 til 800 pg /ml tilsatt til hver brønn. Antall levedyktige levende celler ble overvåket hvert 15. minutt, for en total på minst 120 timer. IC
50 (integrert programvare, xCELLigence system) og brett forskjeller i IC
50 mellom BLM-resistente og foreldre (kontroll) cellelinjer (IC
50 BLM-resistent /IC
50 kontroll) var deretter beregnet. Den raskeste vekstperioden ble observert for hver av cellelinjene i proliferasjonsanalyse ble isolert for dobling tid bestemmelse og dens endring i prosent ble beregnet ved bruk av xCELLigence systemprogramvare.
Comet assay vurdering av BLM-indusert DNA skade
BLM er kjent for å forårsake DNA-skader i cellene [6,7]. For å bestemme innledende (baseline) og DNA trådbrudd etter høy dose BLM avsløre, ble alkaliske Comet analyser (encellede gel elektroforese) utføres [23] for hver av foreldre og resistente under kloner. Olive Tail Moment (OTM) verdier av ett hundre celler ble scoret tilfeldig per lysbilde med fluorescens mikroskop med KOMET 5.0-programvaren (Kinetic Imagine).
BLM-indusert γ-H2AX foci formasjon
DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) utløser cellulære dannelsen av γ-H2AX foci (fosforylert H2AX protein) [24]. For å bekrefte den cellulære DNA-skade som reaksjon på BLM gjennom Comet analysen ble utført kvantitativ analyse av γ-H2AX foci formasjon følgende høy dose BLM eksponering på et undersett av fire sperre /motstandsdyktig parene (HOP, ACHN, NCCIT, og H322M) [25 ] med phospho-Histone H2AX pSer139 monoklonalt antistoff og Alexa Mel 488-konjugert anti-fosfor-H2AX (BioLegend, San Diego, CA, USA). Et minimum på 10.000 hendelser ble tellet på strømningscytometer for hver måling; intensiteten av γ-H2AX, som direkte korrelerer med Cytometry teller, ble analysert ved hjelp av Cell quest programvare (BD, USA).
cellesyklusfordeling analyse
Cell cycle fordelingene for hver av par syv foreldre og resistente sub-kloner ble testet for- og etter 24 timer med høy dose BLM eksponering til ti ganger de resistente sub-kloner «vedlikehold konsentrasjon. Deretter ble cellene i mono-dispergert suspensjon fiksert med etanol, etterfulgt av propidiumjodid (PI) farging (PI, Sigma, USA) og analysert ved hjelp av FACSCalibur strømningscytometer (BD, USA). Prosenter av cellene hvile i G1, S og G2 /M fase ble bestemt (Cellquest programvare, BD, USA og ModFit LT programvare, Verity Software House). Cellesyklus distribusjon ble målt i hver foreldre /BLM-resistente par ved baseline og ved ulike tidspunkt opptil 24 timer med BLM behandling. Sammenhenger mellom cellesyklus distribusjon, IC
50 verdier, og cellelinje dobling ganger ble analysert.
Annexin V /PI analyse for BLM-indusert apoptose
For å bestemme celle apoptose pre- og post- BLM behandling, en representant undergruppe av fire foreldre /motstandsdyktig par (HOP, ACHN, NCCIT, og H322M) ble behandlet med 24 timer med høy dose BLM. Cellene ble deretter farget med Annexin V-FITC og PI, og evaluert for apoptose ved strømningscytometri i henhold til produsentens protokoll (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Både tidlig (Annexin V-positive, PI-negative) og sen apoptotiske celler (Annexin V-positive, PI-positive) ble regnet som apoptotiske celler.
Statistical Analysis
For å vurdere behandling betydning eller forskjell, sammenkoblede T-tester eller uparede T-tester (avhengig av eksperimentelle spesifikasjoner) ble utført med en tosidig signifikansnivå på 0,05. Normalitet forutsetninger ble vurdert via Shapiro-Wilks tester. Når normalitet antakelsen ikke kunne holdes, sammen eller uparede Wilcoxon rank sum testene ble utført i stedet. For Comet assay vurdering mellom foreldre og resistente under kloner etter høydose BLM behandling, ble p-verdier beregnet ved hjelp av en t-statistikken for ikke-likeverdige avvik, teste nullhypotesen om likestilling på logg forholdstall. Logistisk regresjon ble utført for å vurdere baseline G2 /M distribusjons forskjeller mellom foreldrenes og resistente under kloner. For å undersøke sammenhengen mellom ulike tiltak (IC
50 kontroll, IC
50 endringer etter høydose BLM behandling, dobling tid, og cellesyklus distribusjon), ble lineære regresjonsanalyser utført. Alle analyser ble utført ved bruk av SAS versjon 9.2 eller SPSS versjon 13.0.
Resultater
BLM-resistente cellelinjer opprettholdes på BLM vises stabilt høyere IC
50 verdier og langvarig dobling ganger
Alle de syv BLM-resistente under kloner vist større IC
50 enn foreldre kolleger (figur 1). Cytotoksisitetsassayer viste mellom 7-49 gangers økninger av IC
50 i BLM-resistente under kloner. En positiv korrelasjon ble observert mellom vedlikehold BLM konsentrasjon og IC
50-verdier (p 0,001, R
2 = 0,58). Etter langvarig eksponering BLM, cellelinjer med større følsomhet for foreldre BLM (bety IC
50, 0,1 ug /ml) viste en større økning i motstand (gjennomsnittlig 48 ganger) sammenlignet med foreldrelinjer som var mindre følsom (bety IC
50, 9 ug /ml, 15 ganger; p 0,05 sammenligne foreldre følsom for mindre følsomme linjer).
Lineære regresjonsmodeller bestemt at høyere verdier av IC
50 var assosiert med lavere verdier av ganger endring (logaritmen skala skråningen av: -0,11 (standard error: 0,02), P 0,0001, R
2 = 0,58). Hver IC
50 verdi er gjennomsnittet av eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Det ble observert at BLM-resistente under kloner vokste saktere enn sine foreldrecellelinjer. To cellelinjer, når det holdes i høyere konsentrasjoner av BLM, slik som MB231
3,0 og H322M
2,5 (indeksene betegner vedlikehold BLM-konsentrasjon), også oppviste forstørret og avflatet celle morfologi som minner om celle-senescens sammenlignet med foreldrelinjene , men bare etter mange generasjoner. I motsetning til dette ble akutt eksponering for høye doser av BLM ikke føre til morfologiske forandringer. Jo saktere cellevekst ble bekreftet av cellen dobling tid beregnes med xCELLigence system. Alle BLM-resistente kloner sub-viste statistisk signifikant fordoblingstid forlengelse med en midlere fordoblingstid økning på 147% (område: 64% -352%) sammenlignet med foreldrecellelinjer (figur 2, p 0,05). Det var ingen sammenheng mellom mobil dobling tid og IC
50 verdier, og ingen mellom den prosentvise økningen i dobling tid og fold økning i IC
50.
Midlere doblings tid ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM, n = 3) ble rapportert. Den midlere dobling tid (målt i timer) av foreldrelinjene var kortere enn den for BLM-resistente kloner sub-i alle de syv cellelinjer. * P 0,05 i forhold til foreldre.
For å teste stabiliteten av BLM motstand i BLM-resistente under kloner, sammenligninger i IC
50 verdier og doblingstidene ble gjort mellom normalt vedlikeholdt BLM-resistente under kloner og samme motstandsdyktig sub-kloner som var deretter dyrket i BLM-fritt medium i tre uker. Etter tre uker med BLM-fri dyrkning, tre av de opprinnelig resistente sub-kloner (inkludert både testikulære cellelinjer NT2
0,1, NCCIT
1,5 og lungekreft cellelinjen HOP
0,05) viste en betydelig IC
50 reduksjon (figur 3) og dobling tid reduksjon (figur 4), sammenlignet med jevnlig vedlikeholdt BLM-resistente under kloner. Det var ingen statistisk signifikante endringer i IC
50 og fordoblingstiden i de resterende fire linjer.
Eksperimenter ble utført in triplo. Logg IC
50 sammenligninger ble utført. Tre (HOP
0,05, NT2
0,1, og NCCIT
1,5) av de syv cellelinjer hadde betydelige reduksjoner i IC
50-verdier etter tre uker med BLM fritt vedlikehold. * P 0,05 for sammenligninger mellom BLM resistente under kloner og deres tilsvarende kolleger med tre ukers behandling pause.
Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer. Tre (HOP
0,05, NT2
0,1, NCCIT
1,5) av de syv celle BLM-resistente linjer viste signifikant reduksjon i dobling tid etter tre uker med BLM-fri behandling. * P. 0,05 sammenlignet med etter fjerning BLM for 3 uker cellelinjer
BLM resistens kan være doseavhengig
Gitt at en generell korrelasjon mellom IC
50-verdier og vedlikeholds BLM konsentrasjoner over 7 cellelinjer (figur 1), er muligheten for doseavhengig BLM resistens ble testet. For enkeltcellelinje ACHN, IC
50 verdier ble innhentet fra ACHN
0 (foreldre linje), og de to resistente under kloner, ACHN
0,1 og ACHN
0,25. En positiv korrelasjon ble funnet mellom vedlikehold BLM konsentrasjoner (0, 0,1 og 0.25μg /ml) og deres IC
50 verdier (0,01, 0,29, og 0.74μg /ml, p 0,05). Videre er en positiv korrelasjon ble også observert mellom BLM vedlikeholds konsentrasjoner og dobling ganger (0μg /ml-12 timer, 0,1 ug /ml-16.5hrs, 0.25μg /ml-23.5hrs, p 0,05). Dette funnet ble ikke testet eller bekreftet i noen av de andre cellelinjer.
BLM-resistente under kloner hadde mindre BLM-indusert DNA-skader i Comet analyser
Kvantifisering av DNA-skade i alt sju foreldre /motstandsdyktig parene bruker Comet assay (målt i OTM) viste at før BLM behandling, seks av de sju resistente cellelinjer hadde høyere basal DNA-skader sammenlignet med kontroll (unntaket var HOP
0,05, p 0,05). Dette generelt korrelert med forlenget basalcelle doblingstiden observert i disse resistente sub-kloner. Etter høye doser BLM behandling, fem av syv resistente under kloner (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) hadde lavere DNA-skader enn foreldrelinjene. Ingen økning i DNA skader etter BLM eksponering ble observert i fem av syv resistente linjer (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, og MB231
3,0). I motsetning til dette alle foreldrecellelinjer hadde større DNA-skade etter BLM enn pre- BLM (p 0,05 for hver sammenligning, figur 5). Videre er alle de syv foreldrelinjene vises betydelig større DNA-skade øke etter BLM behandling når sammenlignet med sine motparter resistente (p 0,05).
Forsøk ble kjørt i tre paralleller. Cellene ble utsatt for høy dose BLM eksponering (svarende til ti ganger deres respektive vedlikeholds konsentrasjoner) i 24 timer. OTM ble brukt til DNA-fragmentering (skade) kvantifisering, og ble beregnet som: OTM = (Tail.mean – Head.mean) × (Tail% DNA) /100. Komet analyse avslørte større økning i DNA-fragmentering (uttrykt i OTM nivåer) etter BLM behandling i alle foreldrelinjene * P . 0,05 for sammenligningen mellom cellelinjer før og etter høydose BLM behandling. Alle foreldrelinjer oppviste vesentlig økning i DNA-skade. # P 0,05 for sammenligningen mellom foreldre og resistente cellelinjer i utgangspunktet (før behandling). Alle BLM-resistente linjer unntatt for HOP
0,05 utstilt økt skade DNA ved baseline sammenlignet med foreldrelinjene. P 0,05 for sammenligning mellom resistente cellelinjer og foreldrecellelinje post BLM behandling. Mindre DNA-skader (i forhold til foreldre linjer) post- BLM behandling ble funnet i fem av syv BLM-resistente cellelinjer (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, og H322M
2,5).
BLM-resistente under kloner hadde redusert γ-H2AX nivåer i forhold til foreldrelinjer etter høydose BLM behandling
Som andre mål på cellulær respons til DNA-skader, γ- H2AX ble også vurdert i en undergruppe av fire cellelinjer (HOP, ACHN, NCCIT og H322M). Etter 24 timer med høydose BLM behandling, γ-H2AX intensiteter økte i alle foreldrecellelinjer. I de resistente under kloner, økt γ-H2AX intensiteter ble bare observert i to av fire linjer (ACHN
0,25 og HOP
0,05, figur 6). Dette er i overensstemmelse med Comet analyser. Tre (HOP
0,05, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) av de fire resistente sub-kloner som utviste signifikant mindre endring i γ-H2AX intensitet (γ-H2AX intensitet etter behandling minus før behandling) sammenlignet med foreldreunder kloner post- BLM behandling (p 0,05). Denne trenden var border betydelig i fjerde linje (H322M
2,5, p = 0,054).
Forsøk ble kjørt i tre eksemplarer. Cellene ble utsatt for høy dose BLM eksponering (svarende til ti ganger deres respektive vedlikeholds konsentrasjoner) i 24 timer. Flowcytometrisk påvisning av BLM-indusert γ-H2AX foci dannelse ble deretter innhentet i en undergruppe av fire cellelinjer (ACHN, HOP, NCCIT og H322M). * P 0,05 for sammenligningen mellom cellelinjer før og etter høydose BLM behandling. Alle foreldrelinjer viste betydelig økning i dannelsen av γ-H2AX. # P 0,05 for sammenligningen mellom foreldre og resistente cellelinjer i utgangspunktet (før behandling). En av fire BLM-resistente cellelinjer (NCCIT
1,5) hadde større γ-H2AX formasjon enn sin foreldre motstykke ved baseline. P 0,05 for sammenligning mellom resistente og foreldrecellelinjer følgende BLM behandling. To av fire BLM-resistente cellelinjer (HOP
0,1 og NCCIT1.
5.) Viste signifikant mindre γ-H2AX formasjon enn foreldre kolleger legge BLM behandling, med en tredje linje (H322M
2,5) er border signifikant (p = 0,054).
BLM-resistente cellelinjer hadde en lavere prosentandel av G2 /M arrest etter høy dose BLM eksponering
Siden cellesyklus arrest i G2 /M fase var en karakteristisk generell cellulær respons overfor BLM eksponering, evne til BLM-resistente kloner sub-å undertrykke BLM-fremkalt G2 /M rest ble evaluert. Som vist i figur 7, tre av syv BLM-resistente sub-kloner (HOP
0,05, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) viste større G2 /M-fase distribusjon ved grunnlinjen, sammenlignet med foreldrelinjene (p 0,05). Tilsvarende for de andre fire cellelinjer, de resistente under kloner også utstilt større G2 /M distribusjonsfase i utgangspunktet, men ikke-signifikant. Etter 24 timer med høy dose BLM eksponering, fem (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, og MB231
3,0) av syv BLM-resistente under kloner oppviste en lavere G2 /M fordeling enn i de tilsvarende foreldrelinjer (p 0,05). Sammenligning av% G2 /M fordeling før og etter 24 timer med høydose BLM behandling, alle foreldrecellelinjer oppviste økninger i G2 /M fordeling etter behandlingen (p 0,05) sikret samme trend ble observert i alle resistente sub-kloner, selv om to (NT2
0,1 og MB231
3,0) var ikke-signifikant. Omfanget av% G2 /M fordeling økning (beregnet som% G2 /M
etterbehandling minus% G2 /M
forbehandling) var mindre for alle resistente sub-kloner enn deres tilsvarende foreldrelinjer (p 0,05).
Høy dose BLM behandling tilsvarer ti ganger det tilsvarende vedlikeholdskonsentrasjonen for hver cellelinje. Gjennomsnitt ± SEM (n = 3) verdier er rapportert. * P 0,05 for sammenligningen mellom cellelinjer før og etter høydose BLM behandling. Alle foreldrelinjer viste betydelige økninger i G2 /M cellesyklusfordeling. # P 0,05 for sammenligningen mellom foreldre og resistente cellelinjer i utgangspunktet (før behandling). Tre av syv BLM-resistente cellelinjer (HOP
0,05, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) viste økt% G2 /M-distribusjon ved baseline sammenlignet med sine foreldrecellelinjer. P 0,05 for sammenligning av% G2 /M fordeling mellom sperre og resistente cellelinjer etter BLM behandling. Mindre% G2 /M fordeling enn foreldrelinjene ble funnet i fem av syv BLM-resistente cellelinjer (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, og MB231
3,0) etter BLM behandling.
G2 /M arrest blir fremtredende etter 8 timer med høy dose BLM behandling
For å vurdere timingen av G2 /M arrest etter høy dose BLM eksponering, fire cellelinjer (den medfødt BLM sensitive HOP og ACHN linjer, NCCIT testiklene linjen og medfødt BLM motstandsdyktig H322M, de samme linjene evaluert for γ-H2AX eksperiment) gjennomgikk et tidsforløp analyse. Selv om det var økende G2 /M arrest i begge foreldrenes og BLM-resistente under kloner (figur 8), denne arrestasjonen ble mest fremtredende sett mellom 8 og 12 timer etter BLM behandling i foreldre celler.
Forsøk ble kjørt i tre eksemplarer. G2 /M fordeling ble funnet å være høyere i paren linjer (i forhold til resistente kloner sub-) 8 timer etter behandling BLM.
Redusert apoptose ble funnet i BLM-resistente under kloner
Ved hjelp av de samme fire sammenkoblede under kloner, undersøkte vi om celler gikk apoptose etter høydose BLM behandling. Etter 24 timers behandling BLM, andelen av apoptotiske celler økte i alle fire foreldrelinjene som ble testet (figur 9). I motsetning til dette ingen resistente sub-kloner oppviste statistisk signifikant økning i apoptose etter behandling BLM. Dette var i samsvar med Comet assay (DNA skade) analyse. I tillegg er tre av fire resistente under kloner (HOP
0,05, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) viste signifikant mindre økning i apoptose (% apoptose etter minus% apoptose før BLM behandling) sammenlignet med foreldre linjer følgende BLM behandling (p 0,05). Dette generelt korrelert med redusert DNA-skade og G2 /M-cellesyklusarrest i BLM-resistente kloner sub-(sammenlignet med foreldrelinjer, etter behandling) som observert tidligere.
* P 0,05 for sammenligningen mellom cellelinjer før og etter høydose BLM behandling. Alle foreldrelinjer, men ingen resistente linjer utstilt betydelige økninger i apoptose post- BLM behandling. P 0,05 for sammenligning mellom motstandsdyktig og foreldrecellelinje følgende BLM behandling. Mindre celle apoptose ble funnet i tre (HOP
0,05, NCCIT
1,5, og H322M
2,5) av fire BLM-resistente linjer, sammenlignet med foreldrelinjene.
diskusjon
i denne studien har vi opprettet syv BLM-resistente humane kreftcellelinjer fra kommersielt tilgjengelige kreftcellelinjer av ulike organ opprinnelse (lunge, testikkel, bryst, nyre, samt sentralnervesystemet). Etter plutselig akutt, kortvarig eksponering for BLM disse BLM-resistente under kloner utstilt mindre DNA-skader, hadde lengre dobling ganger, hadde en lavere andel av cellene i G2 /M arrest, og hadde redusert apoptose, sammenlignet med sine mer BLM-sensitive foreldrecellelinjer. BLM-resistente cellelinjer ble utviklet ved progressivt å øke inkubere BLM konsentrasjon over et lengre tidsrom på 16-24 måneder. Tidligere studier har kanskje brukt lignende metoder i å dyrke BLM resistente under kloner. Men noen av dem nådd det høye nivået av BLM-motstand observert i denne studien (som var 7-49 ganger økning i IC
50 mellom resistente og sperre sub-kloner, sammenlignet med en 3-20 gangers økning i en annen studie [15]). Videre, gjennom analyse av BLM-indusert DNA-skade, cellesyklusfordeling, og prosenter av apoptose, flere antatte mekanismer for BLM motstand /følsomhet ble evaluert.
BLM er kjent for å forårsake forlenget G2 /M rest og /eller celleapoptose [9] i BLM følsomme celler. Dette kan være mediert av ATM /ATR [26,27], oppstrøms proteiner av en DNA-reparasjon og signalveien som utløser G2 /M arrest eller celle apoptose via en rekke nedstrøms genprodukter som chk1 /2, cdc 25 [28 ], p53 og p21
WAF1 /CIP1, der de to sistnevnte er avgjørende for å opprettholde G2 /M syklus arrest [29]. Videre ble histon H2AX funnet å være nødvendig for aktivering av G2 /M sjekkpunkt [30].
Comet og y-H2AX resultater avslørte mindre BLM-indusert DNA-skade i de resistente linje, noe som antyder at de resistente kloner sub-kan ha en forbedret evne til å forebygge og /eller redusere DNA-skade forårsaket av BLM. Dette kan være på grunn av redusert cellulært opptak av BLM, og /eller forbedret BLM eliminasjon /avgiftning, formidlet av celleoverflatereseptorer eller transportører [31], antioksidanter molekyler /enzymer som reduserer BLM-genererte ROS [11,32]; eller enzymer som inaktiverer BLM [33,34]. Fremtidige studier må videre studere disse mekanismene.
I denne studien BLM motstand også resultert i mindre G2 /M arrest og celle apoptose, i tråd med resultatene fra en tidligere studie på en enkelt BLM-resistent linje [11] . Den svake økning i G2 /M-arrest i utgangspunktet (før høydose BLM behandling) for disse BLM resistente sub-kloner kunne forklares av kronisk eksponering for BLM. Det faktum at BLM-resistente celler var i stand til å spre seg på en BLM konsentrasjon som ikke var levedyktig for foreldrelinjer tyder på at unndragelse av cellesyklus blokkering kan være en annen mekanisme for motstand. Til sammen våre resultater tyder på at BLM resistente celler kan ha ervervet forbedret evne til å hindre /redusere DNA skader forårsaket av BLM. Dette i sin tur, kan ha ført til redusert G2 /M arrest og apoptose.
En trinnvis dose eskalerende metode for BLM resistensutvikling kan resultere i en dose-respons sammenheng mellom BLM vedlikeholds konsentrasjoner, IC
50 verdier og dobling ganger observert i ACHN
0, AHCN
0,1 og AHCN
0,25 celler. Men inntil disse funnene blir bekreftet i andre sett av sub-kloner, vil dette være et interessant funn i behov av validering.
Etter å ha fjernet vedlikehold BLM konsentrasjoner fra alle de sju resistente under kloner, var det delvis reversering av IC
50 verdier og dobling tid i tre av sju cellelinjer. Fraværet av reversibilitet i de andre fire cellelinjer som kan være et resultat av individuelle cellelinje forskjeller, eller kanskje disse cellelinjer for lengre pauser fra BLM eksponering for å utvikle BLM følsomhet igjen. Så vidt vi vet, har litteraturen om rygging BLM-motstand i kreftcellelinjer vært svært begrenset.
