Abstract
Ductal adenokarsinom i bukspyttkjertelen er rangering 4 for pasientens død av ondartet sykdom i vestlige land, uten tilfredsstillende behandling. Vi re-undersøkt nærmere bestemt histone deacetylases (
HDAC
) og Sirtuin (
SIRT
) genuttrykksmønster i bukspyttkjertelkreft med flere bukspyttkjertelsvulster og normalt vev. Vi examinedthe også mulig sammenheng mellom
HDAC
genuttrykk nivåer og lang sikt sykdom utfall. Videre har vi vurdert ved hjelp av en
in vitro
modellsystem for menneskelig bukspyttkjertelen tumor cellelinje om HDAC7 knockdown kan påvirke celle atferd. Vi analyserte 29 pankreatisk adenokarsinom (PA), 9 kronisk pankreatitt (CP), 8 godartet pankreatisk (BP) og 11 normale bukspyttkjertelvev. Angå bukspyttkjertelen adenokarsinom, var vi i stand til å samle biopsier på svulsten periferien. For å vurdere mulig involvering av HDAC7 i celleproliferasjon kapasitet, har vi generert rekombinant humant Panc-en svulst som underexpressed eller uttrykt HDAC7. Uttrykket av
HDAC1,2,3,4,7 og Nur77
økt i PA prøver på nivåer betydelig høyere enn det som ble observert i CP-gruppen (
p
= 0,0160, 0,0114, 0,0227; 0,0440, 0,0136, 0,0004, henholdsvis). Uttrykket av HDAC7, var betydelig større i PA sammenlignet med BP vevsprøver (
p
= 0,05). Mean mRNA transkripsjon nivåer av PA for
HDAC7 Hotell og
HDAC2
var høyere i forhold til sin kollega biopsier tatt på svulsten periferien (
p
= 0,0346, 0,0053, henholdsvis) . Videre er data oppnådd ved hjelp av konfokal mikroskopi og en kvantitativ metode for immunofluorescens flekker sterkt støtte HDAC7 overekspresjon i PA-kirurgiske prøver. Antallet dødsfall og tilbakefall på slutten av oppfølging var signifikant større hos pasienter med overekspresjon av
HDAC7
. Interessant, veksthastigheten ble signifikant redusert i tilfellet av cellen som bærer shRNA-konstruksjonen rettet mot HDAC7 kodende gen i forhold til foreldre Panc-1 tumorceller (p = 0,0015) ved 48 timer og 96 timer (p = 0,0021). Denne studien støtter sterkt ideen om at HDAC7play en rolle i bukspyttkjertelen adenokarsinom progresjon
Citation. Ouaïssi M, Silvy F, Loncle C, Ferraz da Silva D, Martins Abreu C, Martinez E et al. (2014) Ytterligere karakterisering av
HDAC Hotell og
sirt
genuttrykksmønster i bukspyttkjertelkreft og deres relasjon til sykdomsforløp. PLoS ONE 9 (10): e108520. doi: 10,1371 /journal.pone.0108520
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 17 mars 2014; Godkjent: 24 juni 2014; Publisert: 02.10.2014
Copyright: © 2014 Ouaïssi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Kliniske data er gruppert på: SIRIC- Side INTEGRE de Recherche en Cancérologie, med tittelen program: Alternative strategier i bukspyttkjertelen kreft terapi. Forespørsler kan sendes til sjefen for avdelingen, Dominique Lombardo (tlf +33 (0) 491 324 402)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av institusjonell støtte fra INSERM (Paris, Frankrike) og Aix -Marseille Université (Marseille, Frankrike) og ved en bevilgning Inca-DGSO-INSERM 6038 fra nettsteder de Recherche Intégrée sur le Cancer (SIRIC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ductal adenokarsinom i bukspyttkjertelen er rangering 4 for pasientens død av ondartet sykdom i vestlige land [1]. Aggressivitet av denne kreft er demonstrert av en sykdomsrelatert dødelighet tett tilnærmet forekomsten [2]. Kreft diffusjon og metastase utgjør om lag 90% av alle kreftrelaterte dødsfall [2]. Metastase følger en flertrinns komplekse prosesser hvor nabo friskt vev er invadert av primær tumorceller, som aksesserer den systemiske sirkulasjon og til slutt sprer ved fjerntliggende områder til makroskopiske sekundære tumorer via perivaskulær og /eller perilymphatic vev [3]. I tilfelle av kreft i bukspyttkjertelen, de fleste av de pasienter som allerede har metastaser på diagnosetidspunktet. En rekke undersøkelser har fokusert på identifisering av mulige markører som kan tillate for tidlig diagnose av kreft i bukspyttkjertelen. Spesifikke hendelser som fremmer tumordannelse og kreft progresjon er knyttet til komplekse molekylære endringer som DNA metylering, histon acetylering, fosforylering, ubiquitylation og ADP ribosylering. For tiden er resultatene fra grunnforskning understreker betydningen av acetylering og deacetylering på nivået av ikke bare histon lysinrester, men også andre cellulære faktorer som er ment å forstyrre reguleringen av genekspresjon. Faktisk er steady-sate av acetylering av kjerne histoner kontrollert av motstridende handlinger histone actetyltransferases (hatt) og histone deacetylases (HDACs) hvis virksomhet er korrelert med genaktivering og gen undertrykkelse eller stanse [4]. Økende kunnskap om HDACs viser at de er regulatorer av vekst, differensiering og celledød (apoptose). Dysfunksjon i transkripsjonen undertrykkelse formidles av HDACs kan føre til kreftutvikling. Faktisk, modulering av ekspresjonsnivåene av gener som koder for HDACs (over- og /eller under-ekspresjon) er blitt rapportert for forskjellige typer av kreft [5], [6], [7], [8]. Karakterisering av viktige gener som spiller en rolle i bukspyttkjertelen svulst utvikling kan ikke bare tillate å avdekke nye biomarkører, som vil bli fokus for intensiv forskning interesse, men vil også belyse mulige genprodukter å bli utnyttet for utformingen av selektive midler å forstyrre tumor progresjon. Nyere studier har vist [9], [10] som HDAC2 ble overuttrykt i bukspyttkjertelen adenokarsinom vevsprøver. For å gi innsikt i biologiske oppførsel av kreft i bukspyttkjertelen og identifisere nye potensielle biomarkører, har vi de siste årene iverksatt en studie med formål å undersøke nivåene av
HDAC Kjøpe og
SIRT
gener ekspresjon i et sett av kirurgisk reseksjon pankreatiske vev inkludert 11 pankreas adenokarsinom prøver og en normal pankreas vev. Til tross for forholdsvis lite antall prøver som ble undersøkt, fant vi økt ekspresjon av HDAC7, en klasse IIa-deacetylase, i 9 av 11 prøvene [11], [12]. Men selv om vi har brukt en normal bukspyttkjertelen som kalibrator for genekspresjon måling og andre prøver i nærheten eller langt unna svulsten som kontroller, tenkte vi at ytterligere undersøkelser ved hjelp av et større antall normale bukspyttkjertelen vev og tumorprøver for å revurdere mer presist
HDAC Hotell og
SIRTs
genutrykksmønster i bukspyttkjertelkreft. Videre forsøk ble gjort for å undersøke den mulige forhold mellom HDAC-genekspresjon, og den sykdomsforløp. Vi vurderer også ved å bruke en
in vitro
modellsystem for menneskelig bukspyttkjertelen tumor cellelinje om HDAC7 knockdown kan påvirke celle atferd.
Materialer og metoder
Subject befolkningen
Fra mai 2007 til august 2012, 29 bukspyttkjertelen adenokarsinom (PA), 9 kronisk pankreatitt (CP), 8 godartede pankreastumorer inkludert serøs cystadenoma (SC) n = 2, mucinous cystadenoma (n = 2), godartet IMPN ( n = 2), godartet cyste (retentional cyste, n = 1), og bukspyttkjertelen endokrine tumor (n = 1), ble tatt ansvaret i avdeling for kirurgi på la Timone Hospital (Marseille, Frankrike). Alle pasientene gjennomgikk kontrastforsterket thorax og abdominal CT, ultralyd abdomen, magnetic resonance imaging og blod testing. PA hadde ingen preoperativ behandling før operasjonen. Tjueto pancreaticoduodenectomies (PD), og 7 venstre pancreatectomies ble utført for pankreatisk adenokarsinom, respektivt. To PD, 4SP og tre Frey prosedyrer [13] ble utført for CP. Fire PD, 2 SP og 2 mediale pancreatectomies ble utført for godartede lesjoner. Fire vanlige bukspyttkjertelen (NP) biopsier ble oppnådd i løpet av levertransplantasjon på donor hepatectomy, ble 7others innhentet under susmesocolic kirurgi når radikal gastrektomi nødvendig venstre pancreatectomy: 3 ampulloma (AP1-3), 2 kolangiokarsinom av hovedgallegangen (BD1-2) , 1 gastrinoma i tolvfingertarmen (G), 1 normale tilstøtende vev prøvene etter mage-reseksjon for gastrisk adenokarsinom. I tillegg, 11 prøver av kontroll vev tatt ved periferien av de kirurgiske prøver fra forskjellige pasienter med PA ble også inkludert i denne studien. Data ble prospektivt samlet og et standardisert spørreskjema ble gjennomført på tidspunktet for oppfølging og studie vurdering. Før operasjonen alle pasienter hadde undertegnet et informert samtykkeskjema som hadde blitt godkjent av lokale etikkomité. Beskyttelse komité befolkningen i Sør Middel II, godkjent av Minister Bestill datert 31.05.2012, utgjorde under ordre fra helsedirektør Agency Region Provence Alpes Côte d’Azur av 13. juni 2012, består av: L. BOYER, V. PRADEL, B. DUSSOL, C. Sichel, M. CAILLOL, F. VINCENT, G. NAURAYE, JP. VIDAL, O. SCHWEITZER, J. ACCIARO, diskutert i plenum erklæring fillagring og forberedelse til vitenskapelige elementer i menneskekroppen identifisert av departementet for høyere utdanning og forskning under henvisning DC-2013-1857 og som vitenskapelig leder den er Mr Dominique LOMBARDO, ga en gunstig ekspertråd (filer S1, S2).
kirurgi
Alle kirurgiske prosedyrer ble utført av tre erfarne bukspyttkjertelen kirurger (BS, YPLT, IS, MO). Erfarne senior kirurger utført alle bukspyttkjertelen hodet resections. PD ble utført ved anvendelse av en pylorus bevare eller Whipple prosedyre, og en ende-til-ende pancreaticojejunostomy (PJA) ble konstruert med et enkelt lag anastomose av avbrutte 5-0 PDS (Ethicon kirurgi) absorberbare suturer. Valg av kirurgisk teknikk ble besluttet per-operativt bundet til kirurgens avgjørelse. Anterior SMA tilnærming ble deretter rutinemessig brukt siden år 2001 for å standardisere radikalitet av reseksjon på stedet av retroperitoneal margin. Standard lymphadenectomy ble utført før år 2001 og utvidet lymphadenectomy siden den gang [14]. Frosne delen eksamener i bukspyttkjertelen trans-seksjonen linje, ble utført i alle tilfeller, og ble ikke invadert for alle PA. Standard lymphadenectomy ble utført langs hepatoduodenal ligament og felles leverpulsåren [15]. Alle reseksjoner ble utført via laparotomi. I tilfelle av venstre pancreatectomy: teknikken ifølge distale pancreatectomy begynner med delingen av pankreatisk hals før kontroll av milt-fartøyer ble anvendt [16]. Tidlig hals divisjon gir tryggere vaskulær kontroll. For distal pancreatectomy, primære delen av halsen og milt fartøy ligering, sammen med divisjon av venstre gastro-Kjertel og korte gastrisk fartøy, forut for mobilisering av en devascularized prøven, avtar operativ blødning, og virker mest egnet fra et carcinologic synspunkt. Etter kirurgi pasienter fikk adjuvant kjemoterapi i funksjon av deres allmenntilstand, og ved skjønn av onkolog. To myke avløp (Peters) eller venstre bukspyttkjertelen seksjon for venstre pancreatectomy ble rutinemessig plassert i nærheten av pancreaticojejunal anastomose. Operativ tid ble spilt inn. I fravær av en fistel, ble avløp fjernet etter 7 dager.
Vevsprøver
Alle kirurgiske prøver ble anmeldt av en senior patolog. Klinisk og patologisk iscenesettelse (tabell S1) ble revurdert i henhold til amerikanske Joint Committee on Cancer TNM staging for kreft i bukspyttkjertelen om PA. Tumorene hadde vært hurtigfrosset i RNA senere og flytende nitrogen i løpet av 15 sekunder, og umiddelbart lagret ved -80 ° C. Svulster egenskaper ble registrert i alle pasienter (Tabell S1). Dette inkluderte sin beliggenhet, median størrelse ved diagnose, UICC iscenesettelse, forlengelse av neoplastisk sykdom ved diagnose, antall metastase nettsteder når nåtid og lymfeknutestatus. Alle prøvene ble gradert i henhold til klassifiseringsreglene 6
th utgaven (2002) av den amerikanske Joint Committee on Cancer Staging Manuel (AJCC) [17]. Den radikalitet av reseksjon ble gradert i henhold til R-klassifisering av International Union mot Kreft (R0: ingen gjenværende tumor, R1: mikroskopisk resttumor, R2: makroskopisk resttumor
in situ
) [18]. Den retroperitoneal margin ble gradert R1 hvis rest mikroskopisk tumor ble identifisert innen 1 mm av trans-seksjonen linje [19]. Siden år 2002 ble patologisk undersøkelse av kirurgisk prøven standardisert i henhold til Luttges
et al.
Protokollen [20], ved hjelp av rutine blekk merking av retroperitoneale trans-seksjonen linje. I tilfeller av vaskulær reseksjon ble fullstendig vaskulær segmentet innebygd og begge endene ble undersøkt separat som ekstra reseksjonskanten.
Tissue Behandling og immunfluorescens histologisk Study
Vevsprøver (21 PA og 6 NP prøver ) ble rutinemessig fiksert i 10% formalin, innstøpt i parafin og ytterligere kutt i 5 mm seksjoner umiddelbart lagret ved 4 ° C eller farget med hematoksylin-phloxine-safran (HPS).
Reagenser og mAbs
i tilfelle av Western blot-analyse, et monoklonalt muse anti-actin-antistoff og POD-merket anti-mus-antistoff {fra Sigma (St. Louis, MO)}, ble anvendt. Et polyklonalt kanin anti-HDAC7 antistoff var fra Euromedex (Souffelweyersheim, Frankrike), POD-merket anti-kanin-antistoff var fra Cell Signaling (Beverly, MA). DMEM cellekulturmedier, penicillin, streptomycin, trypsin-EDTA, hygromycin B og neomycin var fra Invitrogen (Carlsbad, NM) For å gjennomføre farging, muse-monoklonalt antistoff (mAb) mot HDAC7 (20 ug /ml, Sigma-Aldrich, Frankrike ), og et kanin-anti-Nur77 antistoff (Ab) (5 ug /ml, Thermo Scientific, CergyPontoise, Frankrike) ble anvendt. Biotin-konjugert F (ab «) 2-fragmentet av geite-antistoffer mot muse-IgG (Beckman Coulter, CDG Terminal, Frankrike) eller biotin-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Sigma-Aldrich) for HDAC7 og Nur77 immunofarging henholdsvis ble anvendt.
immunfluorescens
formalinfiksert, parafininnstøpte vevssnitt (5 mikrometer) ble deparaffinized og behandlet med et antigen gjenfinning løsning. Vevssnitt ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur (RT) med anti-HDAC7 eller anti-Nur77 og vasket i PBS. Snittene ble deretter vasket i PBS og inkubert i 1 time ved RT med 1:50 fortynning av biotin-konjugert F (ab «) 2-fragment av geit-antistoffer mot muse-IgG eller biotin-konjugert geit-anti-kanin IgG for HDAC7 og Nur77 immunofarging respektivt. Seksjonene ble vasket i PBS, behandlet 1 time ved RT med 1:50 fortynning av streptavidin-fluorescein (Beckman Coulter). Alle seksjonene ble montert i Dako vandig permanent monteringsmedium.
Snittene ble observert ved hjelp av et Zeiss Axiovert 200 M invertert mikroskop med 20 objektiv og en konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) (Leica TCS SP5) med en 60 mål. En argon laser med en eksitasjon av 488 nm ble brukt til å aktivere grønn fluorescens.
Bildebehandling
Bilder ble behandlet som tidligere beskrevet [11]. For hvert primært antistoff, var fargingen beregnet som forholdet mellom den totale fluorescens av området (total spesifikk fluorescens) og overflaten på dette området (bety spesifikk fluorescens, MSF). Middelverdiene for seks fargede områder for hver biopsi ble deretter beregnet.
Oppfølging
Postoperativ oppfølging omfatter klinisk, biokjemisk, og radiologisk vurdering hver 3. måned i løpet av den første postoperative året, da, hver 6 måneder og opp til en postoperativ forsinkelse på 5 år og etterpå hvert år opp til 10 års oppfølging. Ingen pasient ble mistet av oppfølging. De overlevende pasienter ble vurdert for tilbakefall av sykdommen og åsted for tilbakefall. Oppfølging informasjonen ble hentet fra medisinske poster og direkte pasientkonsultasjon. Følge opp ble videreført for alle pasientene i denne kohorten til juni 2013 uten å inkludere nye pasienter. Langsiktig oppfølging var tilgjengelig for alle pasienter. Gjennomsnittlig varighet av oppfølging var 16 måneder (median: 18 måneder, range: 2-53). Lengden på overlevelse ble beregnet fra datoen for operasjonen før dødsdato eller datoen som denne studien ble avsluttet.
Cell vekst og spredning
Panc-1 celler (ATCC, CRL-1469) stammer fra human pankreatisk karsinom ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% FCS, 1% penicillin (100 U /ml), 1% streptomycin (100 ug /ml) og glutamin (1 mM). Celler ble sådd med 4000 celler
per
brønn i en 96-brønner plate og cellevekst ble bestemt ved 24, 48, 72 og 96 h ved 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2 , 5-difenyl (MTT) assay. Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± SD (n = 8) og er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter.
Cells transfeksjon
stanse av HDAC7 genet ble utført ved stabil transfeksjon av Panc-1 celler med SureSilencing shRNA Plasmid for menneske HDAC7 (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike), som gir hygromycin motstand mot transfekterte celler. Over uttrykk for HDAC7 ble utført ved stabil transfeksjon hjelp pcDNA3-HDAC7-Flag plasmid (plasmid Addgene 13824, Eric Verdin, J. David Gladstone Institutes, San Francisco, CA, [21]), som gir neomycin motstand mot transfekterte celler. Panc-1 celler på 50-80% samløpet ble transfektert med Lipofectamine LTX Reagens med PLUS Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter en 6 timers inkubering ved 37 ° C i 5% CO2, ble transfeksjon mediet erstattet med fullstendig DMEM-medium i 48 timer og deretter med friskt medium inneholdende 300 ug /ml hygromycin B (shRNA plasmid) eller 2 mg /ml neomycin (pcDNA3 -HDAC7-Flag plasmid). Etter 1-2weeks, i selektivt medium en grense fortynning ble utført. Utvalgte kloner ble betegnet som SH eller pflag cellekloner, respektivt. Kontrolltransfeksjoner ble utført ved anvendelse av shRNA CTL-vektor eller tom pcDNA3-vektoren.
SDS-PAGE og Western-blotting
Cellene ble vasket tre ganger med iskald PBS, høstet og pelletert ved sentrifugering. Pelletene ble vasket to ganger og lysert ved 4 ° C i 0,1 ml lyseringsbuffer {50 mM Tris /HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, proteasehemmere (Complete TM, Roche Diagnostics)} . Homogenater ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C og klares ved sentrifugering ved 10 000 g i 30 minutter ved 4 ° C og frosset ved -20 ° C. En prøve ble lagret for proteinbestemmelse ved hjelp av Bicinchoninic Acid Kit (Sigma, St. Louis). Like mengder cellelysater (100 mikrogram) i reduserende SDS buffer ble løst på gradient 8-16% Tris-glycin polyakrylamidgeler (Pierce). Etter elektromigrasjon, ble proteinene overført på nitrocellulosemembraner og behandlet for immunblotting ved hjelp av egnede primære og sekundære antistoffer. Etter vask, ble membraner avslørt av chemiluminescence (Roche diagnostisk, Meylan, Frankrike).
RNA isolering og revers transkripsjon
vev (≈30 mg) ble forstyrret i 600 mL buffer RLT Plus ( Qiagen) ved hjelp av en tilpasset størrelse fartøy for avbrudd og homogenisering med en Tissue Ruptor. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Prep All DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved absorpsjon og RNA integritet ble kontrollert på RNA Nano chips (Agilent, Santa Clara, CA). Revers transkripsjon (RT) reaksjoner ble utført på 1 pg av total RNA ved hjelp av Improm-II kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. D e-celler ble høstet og RNA-pelletene for rensing ble behandlet umiddelbart i RLT lysis buffer (Qiagen). Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. RNA-prøvene ble behandlet med DNase I (kit DNA-fri, Ambion Inc., Austin, Texas) for å fjerne spor av forurensning genomisk DNA. Revers transkripsjon (RT) reaksjoner ble utført på en mikrogram total RNA ved hjelp av tilfeldige heksamer og M-MLV revers transkriptase (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Real-time kvantitativ PCR (Q RT-PCR)
Q RT-PCR reaksjoner ble kjørt i tre eksemplarer på to uavhengige RNA preparater fra cellulære kloner bruker LightCycler480 SYBR Grønn jeg Master mikse og LightCycler real time PCR instrument (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) som beskrevet tidligere [12]. Primerne er oppsummert i Tabell S2. Primere ble konstruert for å amplifisere et tilnærmet 200 bp-fragment i den kodende sekvens av 11 gener som tilhører HDAC /SIR familier. Den 28S RN-genet ble valgt som kontroll. Komparativ analyse av Crossing Point Ct-verdier (gjennomsnittlig
Cp
) av fire NP og de 7 vanlige bukspyttkjertelen biopsier for settet av HDAC og SIRT samt Nur77 gener avslørte at de var av samme verdier uten statistisk signifikant forskjell (figur 1, tabell S3). Derfor ble de 11 biopsier prøvene utformet som en kontrollgruppe (CG) og deres gjennomsnitts
Cp
verdier for alle genene ble bestemt og brukt som kalibratoren. De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å analysere den relative genuttrykket [22]. De gjennomsnittlige Ct (CP verdier) ble beregnet for både målet og 28S genet og ΔCt (C
t,
mål
C
t,
28S
) var fast bestemt. CG ble brukt som kalibrator [for beregning av ΔΔC
t = (C
t,
mål
C
t,
28S
) – (C
t,
mål CG
C
t,
28S CG
)] [22]. For CG, ΔΔC
t er lik null, og 2
0 er lik en, så at folden forandring i gen-ekspresjon i forhold til den CG er lik en. Evaluering av to
-ΔΔCt indikerer ganger endring i genuttrykk i forhold til CG.
Mean Cp av HDACs, SIRTs og Nurr77 gener og 28S transkripsjoner av vevsprøver fra kontrollgruppen. qPCR ble kjørt i tre paralleller på to uavhengige cDNA-preparater fra pankreatiske vev, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Den midlere Cp-verdier Ct (gjennomsnitt av Cp) ble bestemt for de følgende prøver: NP-1 til 4, normal pankreas; BD-1 og 2, normal pankreas prøver fra pasienter bærende gallekanal tumorer. AP-1 til 3: normal tilstøtende vev prøver ampulloma; G-A: normale tilstøtende vev prøver etter gastric reseksjon for adenokarsinom i ventrikkel; Gastrinoma: normal tilstøtende vev prøver for gastrinoma av tolvfingertarmen
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Graph Pad 5 programvare.. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik eller median med interkvartilt område. Forskjellene mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney U-test eller student test t. Enveis variansanalyse eller Kruskal-Wallis test ble utført for å sammenligne mer enn to grupper.
Å sammenligne for kategoriske variabler, chi-kvadrat test eller Fisher eksakt ble brukt. Kaplan-Meier-metoden ble brukt til å beregne samlet og tilbakefall overlevelse. For alle tester ble en p-verdi på mindre enn 0,05 ansett som signifikant.
Resultater
Uttrykk av HDAC, SIRT og Nurr77 kontroll bukspyttkjertelen vev
Panel av 11 normal bukspyttkjertel kirurgiske prøver ble undersøkt. Disse vev prøver ble evaluert for HDACs, SIRTs og Nur77 mRNA status av kvantitativ real-time PCR. Som vist i Figur 1 og Tabell S3) ved vurdering av krysningspunktet (
Cp
) som avgrenser det punkt hvor fluorescensen stiger vesentlig over ryggen bakken fluorescens, de målte verdiene for hvert gen var ikke statistisk signifikant forskjellige (de p-verdiene varierte 0,13 til 1) tyder på at målet gener ble uttrykt på samme nivå i de kirurgiske prøver undersøkt. Dette tillot oss å definere de 11 kirurgiske prøver som en kontrollgruppe (CG), derfor bruker gjennomsnittsverdiene av deres
Cps
som kalibratoren.
Sammenligning av Q RT-PCR analyse av HDACs , SIRTs og Nur77 expressionbetween kreft i bukspyttkjertelen, kronisk pankreatitt, godartet svulst og kontrollgruppe
i vår forrige rapport [12] har vi vist at HDAC7 er betydelig uttrykt i PA vevsprøver. Gitt at bare 11 PA vevsprøver og en normal bukspyttkjertel biopsi ble brukt, utførte vi qPCR analyse av
HDACs
,
SIRTs Hotell og
Nur77
uttrykk i til sammen 46 vev prøvene består av 29 PA. Videre ble 11 normale bukspyttkjertelen vev biopsi brukes som kalibrator for å definere mer nøyaktig de observer mRNA genuttrykk nivåer blant vev fra PA, CP og B. Mean
Cp
verdier (CT) av
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
, var signifikant lavere i PA gruppen sammenlignet med CG (
p
= 0,0010; 0,040; 0,0420, 0,0366, henholdsvis) (figur 2). Dette resultatet viste at
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
var betydelig over uttrykt i PA prøver enn i CG seg.
Prøvene ble kjørt i tre eksemplarer på to uavhengige cDNA preparater fra bukspyttkjertelen vev som beskrevet i Materialer og metoder. (Cp) krysningspunkt verdier. Sammenligninger ble gjort av Wilcoxon test og forskjeller ble betraktet som signifikant ved p. 0,05
Vi deretter brukte 2
-ΔΔCt metode for å analysere den relative genuttrykk i vevsprøver fra PA, B og PC [22]. Som vist i figur 3A, uttrykk for
HDAC1,2,3,4,7 og Nur77
økt i PA prøver på nivåer betydelig høyere enn det som ble observert i tilfelle av CP gruppe (
p
= 0,0160, 0,0114, 0,0227, 0,0440, 0,0136, 0,0004, henholdsvis). Videre uttrykk for HDAC7, var signifikant høyere i PA forhold til B vevsprøver (
p
= 0,05).
(B) SIRT gener uttrykk i bukspyttkjertelen tumorvev. Vevsprøver fra bukspyttkjertelen adenokarsinom (PA), Benin Tumor (B) og kronisk pankreatitt (CP). Rød linje:. Median av relative RNA transkripsjonsnivåer
Q RT-PCR-analyse viste uttrykk for ulike SIRTs mRNA i vev fra PA, CP, og B (figur 3B). Selv om noen betydelig variasjon på nivå med
SIRT
s gentranskripsjon kan bli dokumentert, gjorde dataene ikke tillater å identifisere en
sirt
genuttrykk nivåer variasjon mellom PA, CP og B-prøvene.
Vi ytterligere sammenlignet nivåene av genuttrykk i noen eksemplarer der vi var i stand til å samle biopsier på svulsten periferien. Som vist i figur 4A, PA prøvene viste statistisk høyere bety mRNA transkripsjonsnivåer for
HDAC7 Hotell og
HDAC2
i forhold til sin kollega biopsier tatt på svulsten periferien (
p
= 0,0346, 0,0053, henholdsvis). Selv om en viss grad av variasjon i
SIRTs
genuttrykk nivåer kan bli dokumentert mellom vevsprøver, ingen slik bemerkelsesverdig forskjell som de som ble observert for
HDAC7 Hotell og
HDAC2
kunne ses. Disse dataene støtter forestillingen om at blant de
HDACs Hotell og
SIRTs
genet undersøkt,
HDAC7 Hotell og
HDAC2
er to gener med høyest potensial til å bli markører for PA.
bukspyttkjertelen adenokarsinom svulster (PA), fjern biopsier vev (RB).
Mønstre og uttrykk nivåer av HDAC7 og Nur77
Når du bruker HDAC7 mAb, farging var negative eller svakt positiv i kontrollsaker (NP), mens sterk positiv immun reaktivitet ble funnet i alt PA (figur 5A). For å analysere mer nøyaktig nivået av farging i vevsprøver ble seks farget områder for hver immunfluorescens bilde kvantifisert ved å måle MSF intensiteten av fargede områdene. All PA utstilt statistisk høyere MSF verdier enn kontrollprøver. Gjennomsnittet av Leger Uten Grensers intensitet funnet med mAb til HDAC7 ble betydelig økt i PA (gjennomsnitt = 173,78 ± 4,46) sammenlignet med kontrollprøvene (gjennomsnitt = 54,31 ± 13,26) (figur 5B) (
P
= 0,0004) . Analyse av seks fargede områder for hver immunfluorescens bilde ved å måle MSF intensitet viste at gjennomsnittet av Leger Uten Grensers verdier funnet med mAb til Nur77 ble betydelig økt i PA (gjennomsnitt = 146,50 ± 8,07) sammenlignet med kontrollprøvene (gjennomsnitt = 110,00 ± 4,41 ) (figur 6) (
P
= 0,0225).
En svak farging er funnet i NP. I PA, er en sterk farging finnes i cytoplasma og i assosiasjon med celleplasmamembranen. Original forstørrelse 250x. Kvantitativ bestemmelse av midlere spesifikk fluorescens (MSF) (B). Seks områder i hvert tilfelle ble målt. Medianer av MSF intensitetene oppnådd med PA og NP vev er representert med de horisontale linjer og interkvartilt område er representert ved bokser. (*
P
0,0004)
En moderat farging finnes i cytoplasma i NP.. PA-celler er sterkt farget i cytoplasma og en moderat farging ble observert på celleplasmamembranen. Original forstørrelse 250x. Kvantitativ bestemmelse av midlere spesifikk fluorescens (MSF) (B). Seks områder i hvert tilfelle ble målt. Medianer av MSF intensitetene oppnådd med PA og NP vev er representert med de horisontale linjer og interkvartilt område er representert ved bokser. (*
P
0,0225).
Virkningen av
HDAC7, HDAC2 og Nurr77
uttrykk i utfallet av pasient med bukspyttkjertelen adenokarsinom
Vi undersøkte mulig sammenheng av gentranskripsjon nivåer (
HDAC7
,
HDAC2 Hotell og
Nurr77
) og utfallet av sykdommen. Som vist i figurene 7, 8, 9 og 10, ingen statistisk signifikant forskjell kunne sees mellom grupper i form av generelle og sykdomsfri overlevelse ved vurdering av individer som uttrykker mer av mindre enn 4 ganger grunnlinjen gentranskripsjon nivå. Imidlertid, når vi analyserte antall død og tilbakefall ved slutten av oppfølgings, antall død og tilbakefall var signifikant større i pasienter med overekspresjon
HDAC7 plakater (4 ganger grunnverdien gentranskripsjon nivå) (figur 8) .
Totalt (heltrukket linje) og sykdomsfri overlevelse (stiplet linje)
N:.. grunnlinjen transkripsjon nivå i CG
N .: grunnlinjen transkripsjon nivå i CG
N:. grunnlinjen transkripsjon nivå i CG
Utvikling av stabile menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer under-uttrykker eller overekspresjon HDAC7
for å vurdere mulig involvering av HDAC7 i celleproliferasjon kapasitet, genererte vi rekombinante humane Panc-1 tumorcellekloner ved hjelp av et sett med fire kommersielt tilgjengelige shRNA konstruerer og en tilsvarende kontroll plasmid. Dessuten ble det pcDNA3-HDAC7-Flag-plasmid anvendes for å oppnå overekspresjon av HDAC7 proteinet. Transfections ble også utført med en pcDNA3 tom vektor som kontroll. Transkripsjon av HDAC kodende genet ble analysert ved hjelp av Q-RT-PCR.
