Abstract
makrofagkolonistimulerende faktor (MCSF) regulerer vekst, spredning og differensiering av hematopoietiske celle linjene. Mange krefttyper er kjent for å utskille høyt nivå av MCSF, som rekruttere makrofager inn i tumoren mikro-miljø, som støtter tumorvekst. Heri, rapporterer vi kloning av MCSF og påfølgende generasjon U87MG uttrykke MCSF stabil cellelinje (U87-MCSF). Cytotoksisiteten av anti-kreft legemiddel 5-fluorouracil (5-FU) ble evaluert på begge U87MG og U87-MCSF celler. Interessant, spredning av U87-celler MCSF var mindre (p 0,001) enn for U87MG-celler alene, etter behandling med 5-FU. Betydelig reduksjon i ekspresjonsnivåene av cyklin E og A2 kvantifisert av sanntids-PCR-analyse bekreftet den redusert spredning av 5-FU behandlet U87-MCSF celler. Men gjorde JC-1 flekker ikke avsløre noen apoptose på 5-FU behandling. Notch-en oppregulering induserte en mulig epitelial-mesenchymale overgang i U87-MCSF celler, som utgjorde en økning i andelen av CD24
høy /CD44
mindre kreftstamceller i U87-MCSF celler etter 5-FU behandling . Den høye motstanden i U87-MCSF celler mot 5-FU var på grunn av økningen i uttrykkene (10,2 og 6 ganger) av ABCB1 og MDM2 hhv. Videre økning i uttrykk for ABCG1, MDM2 og CD24 ble også observert i U87MG-celler etter langvarig inkubering med 5-FU. Våre studier gitt mekanistiske innsikt i legemiddelresistens av U87MG celler og også beskrevet den sentrale rollen MCSF i å forsterke motstanden U87MG celler til 5-FU
Citation. Chockalingam S, Ghosh SS (2013) Forbedring av Cancer stamceller i makrofagkolonistimulerende Factor-uttrykke U87MG-human Glioblastoma ved 5-Fluorouracil Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83877. doi: 10,1371 /journal.pone.0083877
Redaktør: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 19 september 2013; Godkjent: 08.11.2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Chockalingam, Ghosh. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt ved Institutt for bioteknologi No. BT /49 /NE /TBP /2010 og BT /01 /NE /PS /08. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
makrofag-kolonistimulerende faktor (MCSF), også referert til som kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1), er en vekstfaktor ansvarlig for overlevelse, proliferasjon og differensiering av celler av hematopoetiske linjer [1]. Utenfor det hematopoetiske system, har MCSF en viktig rolle i utvikling og regulering av placenta, brystkjertel, hjerne og benfysiologi [2] – [4]. MCSF kodes for av et unikt gen, men gjennom alternative mRNA-spleising og differensial post-translasjonell modifikasjon, i tre forskjellige former for MCSF, for eksempel, et utskilt glykoprotein, et utskilt proteoglykan og en kort membranbundet isoform er funnet [1]. MCSF virker gjennom en type III-tyrosin-kinase-reseptor, kolonistimulerende faktor 1 reseptor (CSF1R), som er produktet av c-fms proto-onkogen.
MCSF er kjent for å infiltrere områder av skade og inflammasjon med mononukleære fagocytter . Homozygot null mutasjon av CSF-1 i mus viser en utarmet makrofag befolkningen i brystkreft, noe som resulterer i redusert malignitet og metastase [5]. Tilstedeværelsen av monocytter og makrofager fremmer angiogenese og metastase i tumor ved å øke nivået av sekresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). MCSF virker som en transkripsjonsregulator for produksjon av VEGF [6]. Ikke desto mindre har MCSF en potensiell rolle i å frambringe antitumorrespons. Monocytter og makrofager har blitt rapportert å drepe kreftceller ved paraptosis, med overekspresjon av membranform av MCSF [7], [8]. Tilsetning av renset MCSF til de menneskelige eggstokkreft celler er dokumentert å indusere konsentrasjonsavhengig veksthemming in vitro [9]. Derfor slike rapporter som viser anti-svulst aktiviteter MCSF kjøre hånd i hånd med alternative rapporter som viser de pro-tumor egenskaper MCSF.
I denne studien har vi belyst den rollen MCSF i å øke narkotika resistive egenskaper av menneskelig glioblastoma cellelinje, U87MG. Vi har også funnet mekanismen av 5-FU motstand i U87MG celler. Våre resultater viste at Notch-1-ekspresjon ble forbedret hos ubehandlede U87-MCSF celler, noe som induserte epitel-mesenchymale overgang. En økning i CD24
høy /CD44
lave kreftstamceller og oppregulering av nøkkel ABC transporter gener (ABCG1 og ABCB1) formidles motstand til 5-FU i U87-MCSF celler. Våre data gir bevis for legemiddelresistente fenotype voksende gjennom dannelsen av kreftstamceller i MCSF uttrykker glioblastom.
Materialer og metoder
Cellelinjer
ACHN, human nyrekreft og U87MG, menneskelige glioblastom cellelinjer anskaffet fra Nasjonalt senter for Cell Science, Pune ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, Penicillin (50 U /ml) -Streptomycin (50 mg /ml) ved 5% CO
2 i en fuktet inkubator ved 37 ° C.
RNA isolering og RT-PCR
RNA fra dyrkede pattedyrceller ble isolert ved hjelp av GenElute pattedyr total RNA isolasjonskit ( sigma) i henhold til produsentens anvisninger. Total RNA (1 pg) ble reverstranskribert ved bruk av cDNA syntese kit (Fermentas). Forsterkning av genekspresjon ble utført med respektive genet spesifikke primere (Tabell S1 i File S1).
Western blotting
Celler dyrket til 70-80% konfluens ble lysert ved RIPA buffer som inneholder 1 mM PMSF . Totalt proteininnhold i cellelysatene ble kvantifisert ved Lowry-metoden for protein estimering ved bruk av BSA som standard. SDS-PAGE ble utført lasting lik mengde protein i hver brønn. Prøvene ble blottet på PVDF-membran og påvist ved anvendelse av antistoffer for β-aktin (BD Transduction Laboratories) og MCSF (Sigma). Blottene ble utviklet ved hjelp av kjemiluminescens peroxydasesubstrat-en kit (Sigma) og avbildes med gel dokumentasjonssystem (Molecular imager ChemiDoc XRS + bildesystem, Bio-Rad).
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble målt ved hjelp av in vitro-assay kit Toxicology, XTT-basert (Sigma). -Celler utsådd i 96 brønns mikroplate i en tetthet på 1,5 x 10
3-celler per brønn ble tillatt å vokse over natten og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU for forskjellige tidsintervaller. XTT (2, 3-bis [2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl] -2H- tetrazolium-5-karboksyanilid indre salt) Analysen ble utført ved slutten av behandlingsperioden ved bruk av produsentens protokoll. Den løselige oransje formazanprodukt ble målt ved hjelp av multiplate leser (Tecan, Infinite M200) ved 450 nm og bakgrunnen måling ved 690 nm. Cellenes levedyktighet (%) ble beregnet i forhold til ubehandlede 100% levedyktige celler.
MCSF Lokalisering studie
I korthet ble cellene vasket med PBS og fiksert med 3,7% paraformaldehyd-oppløsning (med eller uten 0,1% Triton X-100) ved 37 ° C i 30 minutter. Etter vasking med PBS tre ganger, ble cellene blokkert med 1% BSA blokkeringsløsning i 30 minutter. Deretter ble cellene inkubert med anti-MCSF (Sigma) primært antistoff og deretter med FITC-merket sekundært antistoff (BD Transduction Laboratories). Etter farging med FITC-merket sekundært antistoff, ble cellene inkubert med media inneholdende 300 nM DAPI i 3 minutter, og til slutt vasket og visualisert under fluorescens mikroskop (Nikon ECLIPSE T
i
-U, Japan) med en eksitasjon på 480 filter /15 nm (for FITC) og 360/20 nm (for DAPI).
Trypan blått fargestoff utelukkelse analysen
Celler i seks brønns plate ble behandlet med 5-FU i 120 timer. Etter behandling ble cellene høstet, blandet med like stort volum av 0,4% trypanblått (Invitrogen) og lastet over et tellekammer. Den sunne og levedyktige celler med intakt membran ekskludert fargestoff, mens svekket celler farget med fargestoff, og ble regnet som døde. Den prosentvise (%) av cellenes levedyktighet ble beregnet ved hjelp av Countess-automatisert celleteller (Invitrogen).
CFSE celleproliferasjonsanalyse
celler (1 x 10
6 celler /ml) i PBS inneholdende 0,1% BSA ble inkubert med 10 ul av 0,5 mM cfda-SE ved 37 ° C i 10 min og deretter vasket med 5 volumdeler iskald media for å slukke enhver fri fargestoff. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og vasket to ganger med friskt medium. Fargede celler ble analysert umiddelbart etter strømningscytometer (nulltid-punktet) og resten av cellene ble sådd ut for etterfølgende tidsperioder. Dataene ervervet ble analysert i Cell quest Pro-programvaren. Doblingstiden ble beregnet i henhold til formelen T
d = T /log
2 (F
0 /F
T), hvor K
0 er den geometriske middel fluorescensintensitet ved 0 h og F
T er den geometriske gjennomsnittlige fluorescensintensitet ved T h [10]. I våre forsøk T var 72 timer.
Cell syklus analyse
Celler ble sådd i seks brønns plater på tettheten av 5 × 10
4 celler per brønn. Etter over natten festing, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU. På slutten av behandlingsperioden ble cellene trypsinisert, vasket og fiksert med 70% alkohol-løsning i 15 minutter på is. De fikserte celler ble farget med propidiumjodid (PI) fargeløsning (50 ug /ml PI, 0,1 mg /ml RNase A og 0,05% Triton X-100) ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Minst 10000 hendelser per prøve ble kjøpt opp av strømningscytometer og prosentandelen av celler fordelt i ulike faser av cellesyklus ble beregnet ved hjelp ModFit LT programvare.
CD24 /CD44 analyse av flowcytometri
Celler etter behandling ble dissosiert ved trypsinering, vasket to ganger med PBS og inkubert med 10% humant serum i 20 minutter på is for å blokkere Fc-reseptorer. FITC mus anti-human CD24 og PE av mus anti-human CD44 (begge fra BD Pharmingen) antistoffer ble tilsatt og inkubert i 20 minutter på is i mørket. Cellene ble vasket to ganger med PBS, og til slutt resuspendert i PBS og analysert ved hjelp av et strømningscytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, NJ).
Genekspresjon analyse av sanntids-PCR
Kvantitativ sanntid PCR ble utført med SYBR Grønn som reporter fargestoff (Strøm SYBR Grønn PCR Master mix, Applied Biosystems) og 7500 sanntid PCR system (Applied Biosystems). Rådata ble analysert og effektiviteten av hver reaksjon ble beregnet ved LinRegPCR programvare. β-aktin ble benyttet som kontroll endogene og gangers endring i ekspresjon av gener ble beregnet ved ΔΔCt metode.
metylen blå farving
celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU for forskjellige tids intervaller, ble vasket med iskald PBS, fiksert med 50% iskald etanol. 0,2% (vekt /volum) metylen blå fargeløsning ble tilsatt til platen og farging ble utført i 30 sekunder. Oppløsningen ble aspirert og cellene ble vasket tre ganger med iskaldt vann. Prøver ble lufttørket og visualisert under et lysmikroskop.
Actin cytoskjelettet flekker
Celler seeded i seks brønners plater ble behandlet med 5-FU. Ved slutten av behandlingsperioden ble cellene vasket med PBS og fiksert med 3,7% paraformaldehydløsning inneholdende 0,1% Triton X-100 ved 37 ° C i 30 minutter. Etter vasking med PBS tre ganger, ble cellene blokkert med 1% BSA blokkeringsløsning i 30 minutter. Deretter ble cellene inkubert med anti-actin β primære antistoff (BD Transduksjon Laboratories) og deretter med FITC-merket sekundært antistoff (BD Transduction Laboratories). Etter farging med FITC-merket sekundært antistoff, ble cellene vasket tre ganger og inkubert med media inneholdende 300 nM DAPI i 3 min. Celler ble vasket grundig, og til slutt resuspendert i PBS og visualisert under fluorescens mikroskop (Nikon ECLIPSE T
i
-U, Japan) med en eksitasjon filter av 480/15 nm (for FITC) og 360/20 nm (etter DAPI).
Statistisk analyse
verdiene for alle eksperimenter ble uttrykt som gjennomsnitt ± sEM av tre eller flere enkelteksperimenter. Dataene ble analysert ved Students t test eller ANOVA avhengig av hva som gjelder, ved hjelp GraphPad Prism 5.01. Statistisk signifikante verdier er merket med * (p 0,05), ** (p 0,01) og *** (p 0,001).
Resultater
Generering av U87-MCSF celler og følsomhet overfor 5-FU
Figur 1A avbildet strategien for generering av U87-MCSF stabil cellelinje. Den 0,771 kb PCR forsterket gen tilsvarende membranbundne isoform av MCSF ble klonet sekvensielt inn pGEMT-enkle og pEGFP-N1 vektorer. Klonene ble kontrollert ved restriksjonsanalyse på figur 1B (kolonne 2 og 4). En stabil cellelinje (U87-MCSF), overekspresjon MCSF ble etablert ved trans U87MG celler med pEGFP-N1-MCSF. En blandet populasjon av kloner av U87-MCSF ble valgt ut ved hjelp av G418 (400 ug /ml) for å utelukke den potensielle rolle av en hvilken som helst annen kompenserende prosess som følge av transfeksjon i en enkelt klonal populasjon. Ekspresjon av transgenet MCSF ble bekreftet ved semi-kvantitativ RT-PCR (figur 1C). Overekspresjon av MCSF protein ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av anti-MCSF antistoff ved hvilken, ble en 1,8 gangers økning i ekspresjon MCSF bemerket i U87-MCSF celler (figur 1D). En reduksjon i ekspresjonen av MCSF reseptoren, ble CSF1R bemerket i U87-celler MCSF (0,16 gangers ekspresjon i U87-MCSF celler sammenlignet med U87MG-celler) (figur 1C).
A. Skjematisk for generasjon av U87-MCSF cellelinje. B. Bekreftelse av kloner ved restriksjonsspalting felt 1 og 3: 1 kb DNA-stige, felt 2: pGEMT-MCSF spaltet med EcoR I, spor 4: pEGFP-N1-MCSF spaltet med EcoR I og Apa IC RT-PCR-analyse for ekspresjon av MCSF og CSF1R i U87MG og U87-MCSF celler. D. Western blot-analyse av MCSF protein. Et 28 kD-båndet bekreftet overekspresjon av membranbundet MCSF i U87-MCSF celler.
Følsomhet av U87-MCSF-celler ble undersøkt ved XTT-assay etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU som strekker seg fra 5- 100 uM, i 72 timer. Spredning av U87-MCSF-celler ble signifikant redusert med 5-FU på over 10 um som fremgår av de reduserte absorbansverdier (figur 2A). Den tilsvarende vekstreduksjon ble ikke observert i U87-GFP cellelinje med 5-FU behandling, hvor proliferasjonen var nesten lik den til behandlede U87MG-celler. I tillegg ble ingen indikasjon på apoptose sett i behandlede U87MG eller behandlede U87-MCSF celler etter JC-1-farging (figur S1 i File S1). Resultatene ble underbygget med kvantitativ trypan blå eksklusjon analyse som viste friske cellepopulasjoner med intakt cellemembran etter 120 timers behandling (figur 2B). Vi undersøkte uttrykk for noen av de pro-apoptotiske og anti-apoptotiske gener som caspase-3, Bax og BCL-XL. Som vist i fig S2 i File S1, ekspresjonen av pro-apoptotiske-genet, ble Bax øket i behandlede prøver av både U87MG (1,90 ganger) og U87-MCSF celler (1,29 fold). Uttrykket av anti-apoptotisk genet, BCL-xL ble også økt i behandlet U87MG og behandlet U87-MCSF celler. Men økningen i Bcl-xL ekspresjon var 2,11 ganger hos behandlede U87-MCSF celler sammenlignet med 1,25 gangers økning i behandlede U87MG-celler. Caspase-3 uttrykk forble uendret i behandlede prøver av U87MG og U87-MCSF celler.
A. Effekt av 5-FU på vekst og levedyktighet av U87MG, U87-MCSF og U87-GFP celler beregnet av XTT analyse etter 72 timer med 5-FU behandling. B. trypanblått fargestoff utelukkelse analysen viste sunne bestander etter 120h av 5-FU behandling. Statistisk signifikans er merket med * (p 0,05), ** (p 0,01) og *** (p 0,001).
Effekt av 5-FU på cellesyklus og sykliner
cellesyklus ved 5-FU behandling ble studert ved propidiumjodidfarging ved hjelp av flow cytometer. Til å begynne med ble begge U87MG og U87-MCSF cellene synkronisert i G0 /G1 fase av serum sult i 48 timer og deretter cellesyklusen mønster ble observert i fullstendig seruminneholdende medium ved regelmessige tidsintervaller. Satsen for progresjon av cellesyklus mellom to cellelinjer var samme (Figur S3 i File S1). Dette ble også bekreftet ved CFSE celleproliferasjonsanalyse (figur 3A) ved hjelp av hvilken doblingstid av begge cellelinjene ble funnet å være 12 timer.
A. CFSE celleproliferasjonsanalyse viste at graden av spredning av ubehandlet U87MG og U87-MCSF celler forble uforandret. B. Celle syklus analyse av U87MG og U87-MCSF-celler etter behandling med 5-FU i 24 timer. Flertallet av celler ble akkumulert i G0 /G1 fase behandlet befolkningen i U87-MCSF celler. Statistisk signifikans er merket med * (p 0,05), ** (p 0,01) og *** (p 0,001).
Deretter pre-synkroniserte celler ble behandlet med 25 mikrometer 5 -FU i seruminneholdende medium i 24 timer. Cellecyklusen fordelingsmønsteret analysert ved flow-cytometer viste signifikant høyere prosentandel (90%) av behandlede U87-MCSF celler i G0 /G1 fase enn den behandlede U87MG (69%)-celler (figur 3B). Dette ble fulgt av en tilsvarende reduksjon i andelen av celler i S og G2 /M-fasene. Relativt, ble 75% av U87-GFP-celler er samlet opp i G0 /G1 fase ved 5-FU behandling (data ikke vist).
Cykliner involvert i G1 fase og G1-S-overgangen ble undersøkt ved hjelp av kvantitativ sanntid PCR analyse etter behandling av synkroniserte celler (i G0 /G1 fase) med 5-FU i 18 timer. Tilsvarende cykliner som er involvert i slutten av S-fasen og G2 /M fase ble kvantifisert etter 24 timer av 5-FU-behandling. Cyclin D1 uttrykk forble uendret mellom behandlet U87MG og behandlet U87-MCSF celler. Etter 18 timer av 5-FU behandling ble cyclin E ekspresjon signifikant redusert i de behandlede U87-MCSF celler, men ikke i behandlede U87MG-celler (figur 4). Men etter 24 timer av 5-FU behandling, nedregulering i cyclin E uttrykk ble sett i behandlede prøver av både U87MG og U87-MCSF celler (Figur S4 i File S1). Dette er betegnet som responsen av U87-celler som MCSF til 5-FU-behandling var raskere enn U87MG-celler. En svak nedgang i ekspresjon av cyclin A2 ble også observert hos 5-FU-behandlede U87-MCSF-celler sammenlignet med 5-FU-behandlede U87MG-celler etter 24 timer av 5-FU-behandling. Uttrykkene av cyklin B1 og B2 cyclin var mindre i både behandlede prøver, å korrelere med det mindre antall celler kommet til et G2 /M-fasen. Ekspresjonen av p21, en cyklin-avhengig kinase inhibitor, ble øket i de behandlede prøver av både U87MG og U87-MCSF celler. Således differensial ekspresjon av cykliner og CDK-inhibitor, p21 på ulike stadier av cellesyklusen bekreftet med celleveksthemming hos 5-FU-behandlede U87-MCSF celler.
En betydelig reduksjon i ekspresjonen av cyclin E og en svak nedgang i ekspresjon av cyclin A2 ble observert i behandlede U87-MCSF celler, noe som korrelerte med forhøyet G0 /G1 akkumulering av celler sett i cellesyklusanalyse. Ekspresjonen av p21, ble cyklinavhengig kinase inhibitor økes i de behandlede prøver av både U87MG og U87-MCSF celler. Statistisk signifikans er merket med * (p 0,05), ** (p 0,01) og *** (p 0,001).
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) av U87-MCSF celler
Bortsett fra celleveksthemming, morfologiske endringer var synlige i metylen blå farget U87-MCSF celler behandlet med enda lav dose av 5-FU. Utseendet av langstrakt spindel formet morfologi med omstendelige prosesser som ble sett i U87-MCSF celler med 25 pM 5-FU behandling i 72 timer, men ikke i U87MG-celler (figur 5A). Imidlertid ble avlang morfologi sett i begge celler med 50 pM 5-FU-behandling. Videre ble cytoskjelettet farging av ubehandlede og behandlede prøver av U87MG og U87-celler MCSF utført ved anvendelse av anti β-aktin-antistoff (figur 5B). De oppnådde resultater forsterket morfologiske endringer observert i metylen-blått-farging. Langstrakte og mesenchymale celler ble observert i 25 uM 5-FU behandlet U87-MCSF celler, men ikke i 25 uM 5-FU-behandlede U87MG-celler etter 72 timers behandling. Men, langstrakte cellene ble observert i begge U87MG og U87-MCSF-celler når de ble behandlet med 50 uM 5-FU i 72 timer. I tillegg mikroskopisk undersøkelse av DAPI fargede celler med 25 og 50 mikrometer av 5-FU behandling etter 120 timer viste intakte kjerner, og calceinAM farget celler under de samme forholdene, tillagt langstrakte spindel formet morfologi (Figur S5 i File S1), som var lik til observasjon i metylen-blått-farging. Uttrykk for astrocytic differensiering markør, glial fibrillary surt protein (GFAP) var fraværende og uttrykk for hTERT ble betydelig redusert i begge U87MG og U87-MCSF celler etter 5-FU behandling, rettferdiggjøre undertrykkelse av celleproliferasjon (figur 6C).
A. Metylen blå farging for påvisning av cellemorfologi etter 5-FU-behandling. B. Actin cytoskjelettet farging av behandlede celler ved hjelp av anti β-actin antistoff. De morfologiske Bildene viste tilstedeværelse av langstrakte og mesenchymale celler i U87-MCSF celler behandlet med 25 uM 5-FU, men ikke i U87MG-celler behandlet med 25 uM 5-FU. Ved 50 uM 5-FU behandling ble det langstrakte cellene sees i både behandlede U87MG og behandlet U87-MCSF celler. Skala:. 50 mikrometer
A. Morfologi ubehandlede U87MG og U87-MCSF celler. U87-MCSF celler viste spindel formet, mesenchymale lignende celler (angitt med pilene). B. Mikroskopiske studier ved hjelp av anti-MCSF antistoff avslørte cytoplasma plasseringen av MCSF. Triton X-100 ble anvendt som membran perforering middel i fikseringsoppløsningen. Nucleus farget med DAPI ble også vist. C. Halv kvantitativ RT-PCR-analyse av hTERT, GFAP, N-cadherin, vimentin, Fibronectin og Notch-1. Uttrykk av mesenchymale cellemarkører, N-cadherin, vimentin og Notch-en økt i U87-MCSF celler. Skala: 50 um
Tilstedeværelsen av spindel formet med mer mesenchymale vises celler i ubehandlede U87-MCSF celler (Figur 6A) indikerte mulig forekomst av epitel-mesenchymale overgang.. Ekspresjonen av epitel cellemarkør E-cadherin og mesenchymale celle markører vimentin, N-cadherin, fibronektin ble analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR. E-cadherin-ekspresjon ble ikke sett i ubehandlede og behandlede celler av både U87MG og U87-MCSF-celler (data ikke vist). Imidlertid, var det en betydelig økning i ekspresjonen av mesenchymale cellemarkører vimentin (ca. 2 ganger i både ubehandlede og behandlede prøver) og N-cadherin (1,98 og 3,32 folder i ubehandlede og behandlede prøver, henholdsvis) i U87-MCSF-celler (figur 6C). Ekspresjonsnivået av fibronektin var uforandret i begge behandlede celletyper. Videre ekspresjon av Notch-1, indus av epiteliale-mesenchymale overgang (EMT), ble funnet å være signifikant oppregulert (2,14 ganger) i U87-MCSF celler. Mikroskopisk undersøkelse av U87-celler MCSF, etter fiksering med 3,7% paraformaldehydløsning inneholdende Triton X-100, viste det cytoplasmatiske plasseringen av MCSF (figur 6B). Imidlertid, i fravær av Triton X-100 i fikseringsløsningen ble det ikke observert noen fluorescens (data ikke vist) indikerer fravær av MCSF ved cellemembranen.
Utseende of Cancer stilk cellepopulasjon og oppregulering av ABC-transportører
redusert spredning, forandringer i cellemorfologi og indikasjoner for tilstedeværelse av EMT antydet den mulige utvikling av kreft stamceller i U87-MCSF-celler etter behandling med 5-FU. Vi analyserte uttrykket av markører for kreft stamceller, CD24 og CD44 ved flowcytometri og sanntids PCR. Strømningscytometri-analyse viste at ekspresjon av CD24 ble økt med 6,93% og 33,37% i U87MG-celler og U87-celler MCSF henholdsvis, når de ble behandlet med 25 uM 5-FU (figur 7A). Ingen økning i CD44 uttrykk ble notert i behandlede prøver av både U87MG og U87-MCSF celler. Kvantitativ uttrykk analyse av sanntids PCR avslørte også økningen i CD24 uttrykk med rundt fire ganger i behandlede U87-MCSF celler, mens bare to ganger økning i CD24 uttrykk ble sett hos behandlede U87MG celler. CD44 uttrykk forble uendret i behandlede celler av både U87MG og U87-MCSF (figur 7B).
A. Strømningscytometri-analyse for ekspresjon av CD24 og CD44 i behandlede celler. B. Real time PCR-analyse av uttrykk av CD44, CD24, ABCB1, MDM2, ABCG1 og ABCG2. Dataene ble plottet som forholdet av genekspresjon i behandlede prøve med ubehandlet prøve for de respektive celler. Statistisk signifikans er merket med * (p 0,05), ** (p 0,01) og *** (p 0,001).
ABC transporter gener har blitt knyttet til utvisning av narkotika i mange typer kreft. Vi analyserte uttrykk for ABCG1, ABCG2 og ABCB1 av kvantitativ real time PCR. Figur 6B viser at ekspresjon av ABCG1 og ABCB1 ble øket i både behandlede U87MG og behandlet U87-MCSF celler. Imidlertid ble ekspresjonen av ABCB1 økte med 10,2 ganger hos behandlede U87-MCSF celler sammenlignet med de to gangers økning i behandlede U87MG-celler. Tilsvarende ekspresjon av MDM2 onkogenet ble også øket ved 6 ganger hos behandlede U87-MCSF-celler sammenlignet med 3,3 gangers økning funnet i de behandlede U87MG-celler. Vi undersøkte også ekspresjonsnivået av RALBP1gene, et ikke-ABC-transportør assosiert med MDR (multimedikamentresistens). Vi har funnet en marginal økning i ekspresjon av RALBP1 i ubehandlede U87-MCSF celler (1,29 ganger) sammenlignet med den ubehandlede U87MG-celler (figur S6 i File S1). Men ved 5-FU behandling, ble ingen oppregulering i RALBP1 sett i behandlede prøver med hensyn til deres tilsvarende ubehandlede prøvene.
Diskusjoner
Glioblastoma er fortsatt en av de mest utbredte ondartede svulster med dårlig terapeutisk respons [11]. Ekspresjon av forskjellige multilegemiddelresistente proteiner har i hovedsak bidrar til evnen til gliomceller for å utvikle kjemoresistent fenotype [12], [13]. I denne studien, MCSF uttrykker U87MG glioblastom celler viste redusert vekst og betydelig hemming hos celleproliferasjon uten gjennomgår apoptose etter 5-FU administrasjon. En balanse i uttrykket av pro og anti-apoptotiske gener avgjøre skjebnen til cellene i å legge inn apoptotiske sti [14]. Analyse av uttrykk for pro og anti-apoptotiske gener avslørte at oppregulering i uttrykket av pro-apoptotisk genet, er Bax mot balansert med oppregulering i uttrykket av anti-apoptotiske Bcl-xL i både behandlet U87MG og behandlet U87-MCSF celler . Imidlertid behandlede U87-celler som hadde mindre MCSF ekspresjon av pro-apoptotiske genet Bax og høyere ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-xL sammenlignet med behandlede U87MG-celler. Våre resultater viste at selv om behandlede prøver av både U87MG og U87-celler MCSF ikke gjennomgår apoptose, 5-FU behandlet U87-MCSF celler hadde mer motstand mot apoptose enn 5-FU-behandlede U87MG-celler.
Vi observerte at MCSF er lokalisert i cytoplasma og ikke på cellemembran. Videre uttrykk av reseptoren for MCSF, CSF1R ble nedregulert i U87-MCSF celler, som var i overensstemmelse med den forrige rapporten [15] om nedregulering av mRNA av CSF1R av MCSF i grunnskolen makrofager. CSF1R ble antatt å fungere på plasmamembranen, men nyere bevis viste tilstedeværelse av funksjonell reseptor for MCSF ved atom konvolutten av forskjellige kreftceller og makrofager [16]. Dette øker muligheten for at de observerte effektene av MCSF i U87-MCSF celler ved 5-FU behandling kan være mediert gjennom reseptoren lokalisert ved kjernekraft konvolutten.
EMT er en fredet transdifferensiering cellulære prosessen overdragelse funksjonene mesenchymale celler i løpet av de basale epitelceller, øke sine invasive egenskaper og metastasering [17], [18]. MCSF ekspresjon i U87MG-celler førte til fremkomsten av spindelformede, mer mesenchymale typeceller som indikerer forekomsten av EMT. En tilsvarende oppregulering i uttrykket av mesenchymale markører som N-cadherin og vimentin (1,98 og 2,18 ganger respektivt) ble også bemerket i U87-MCSF celler. E-cadherin ekspresjon ble funnet å være fraværende i alle de analyserte prøvene (data ikke vist) som korrelert med de tidligere rapporterte data som viser mangel på E-cadherin ekspresjon i glioblastom [19]. Dessuten ble det observert en økning i ekspresjon av hakk-1 i U87-MCSF celler. Oppregulering av Notch-1 er implisert i å indusere epitelial-mesenkymale overgang (EMT), som tidligere er blitt rapportert å øke invasive egenskaper av kreft i bukspyttkjertelen celler [20].
I 5-FU behandling, ekspresjon av den mesenchymale markør, N-cadherin ble ytterligere økt i behandlede U87-MCSF celler ved 3,32 ganger mens uttrykket av vimentin forble uendret. I behandlede U87MG-celler, ble kun en marginal økning i ekspresjon av N-cadherin og vimentin (1,26 og 1,41 ganger respektivt) noteres. 5-FU behandling induserte mesenchymale egenskaper i begge U87MG og U87-MCSF celler som vist i figur 5 og figur 6. Imidlertid er konsentrasjonen av 5-FU som kreves for å indusere disse endringene varierte mellom U87MG og U87-MCSF celler. Mens langstrakte og spindelformet mesenchymale celler ble observert i behandlede U87-MCSF når de ble behandlet med 25 uM 5-FU i 72 timer, kan mesenchymale morfologi sees hos behandlede U87MG-celler bare når de ble behandlet med 50 uM 5-FU i 72 timer. Men når behandling med 25 mikrometer 5-FU ble forlenget i 120 timer, ble langstrakte mesenchymale typeceller sett i behandlede prøver av både U87MG og U87-MCSF celler (figur S5 i File S1).
Nye rapporter slått fast at EMT kan utløse kjøp av stilk-lignende egenskaper i kreftceller [21]. En sub populasjon av celler i flere svulster utvise kreftstamcelle (CSC) egenskaper med ekstremt langsom spredning, økt uttrykk av multiresistens gener og anses å være den primære årsaken til tilbakefall av svulsten etter behandling [22], [ ,,,0],23]. Utviklingshemmede i spredning, forekomst av EMT og motstand mot medikamentell behandling foreslått tilstedeværelse av cscs eller deres forløpere i behandlede cellepopulasjoner. Analyse av stemness-forbundet overflatemarkører, CD24 og CD44 i de behandlede cellene ved flowcytometri avbildet en økning i CD24
høy /CD44
lav populasjon av celler i både behandlet U87MG og behandlet U87-MCSF celler. Imidlertid behandlede U87-MCSF celler viste høyere prosentandel (33,37%) av CD24
høy /CD44
lave celler sammenlignet med 6,93% i de behandlede U87MG-celler. I tillegg, ekspresjon kvantitativ analyse av sanntids-PCR avslørte at CD44 ekspresjon var ensartet i 5-FU-behandlede prøver av begge celler, men det CD24 ekspresjon var betydelig høyere i behandlede U87-MCSF celler. Tidligere rapporter viste at cscs isolert fra brystkreft var overveiende CD44
høy /CD24
lave celler [21]. I kontrast til dette, brystkreft celler med CD44
lav /CD24
høy fenotype ble også rapportert å ha dårlig prognose med behandling [24]. Tabell S1. Figur S1. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Skala: 50 mikrometer. Figur S6. Tabell S1.
