Abstract
Betennelse spiller en direkte rolle i kolorektal kreft (CRC) progresjon; men de molekylære mekanismer som er ansvarlig for denne effekten er uklare. Den inflammasjon indusert cyklooksygenase 2 (COX-2) enzym som er nødvendig for produksjonen av prostaglandin E2 (PGE
2), kan fremme kolorektal kreft ved å redusere ekspresjon av tumor-suppressor-gen programmert celledød 4 (PDCD4). Som PDCD4 er også en direkte målet for onkogen mikroRNA-21 (MIR-21) vi undersøkt forholdet mellom COX-2 og MIR-21 trasé i kolorektal kreft progresjon. Genekspresjon profil i tumor og sammenkoblet normal slimhinne fra 45 pasienter CRC viste at oppregulering av COX-2 og MIR-21 i tumorvev korrelerer med dårligere Dukes fase. In vitro studier i colonic adenokarcinomceller viste at behandling med selektive COX-2-hemmer NS398 betydelig redusert MIR-21 nivåer (p = 0,0067) og økt PDCD4 proteinnivåer (p 0,001), mens behandling med PGE
2 opp- regulert MIR-21 uttrykk (p = 0,019) og nedregulert PDCD4 protein (p 0,05). Disse funnene tyder på at MIR-21 er en komponent av COX-2 betennelse vei, og at denne veien fremmer forverring av sykdommen stadium i kolorektal cancer ved å indusere akkumulering av PGE
2 og økt ekspresjon av MIR-21 med derav følgende nedregulering av tumorsuppressorgenet PDCD4
Citation. Peacock O, Lee AC, Cameron F, Tarbox R, Vafadar-Isfahani N, Tufarelli C, et al. (2014) Inflammasjon og MiR-21 Pathways Funksjonelt Interact å nedregulere PDCD4 i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10,1371 /journal.pone.0110267
Redaktør: Kalpana Ghoshal, The Ohio State University, USA
mottatt: 15 juli 2014; Godkjent: 10 september 2014; Publisert: 13 oktober 2014
Copyright: © 2014 Peacock et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av en donasjon fra Derby Colorectal Cancer Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Omtrent halvparten av alle pasienter diagnostisert med kolorektal kreft til slutt dø av tilstanden [2]. De fem års overlevelse har økt til ca 50-55%, noe som skyldes hovedsakelig en tidligere diagnose og bedre tilpasning av behandlinger [3]. Død av kolorektal kreft kan forebygges ved sykdom oppdagelse tidlig stadium, men dessverre er det ofte oppdages på et avansert stadium når prognosen er verre [4]. Prognosen i pasienter med kolorektal kreft er assosiert med sykdom scenen på diagnosetidspunktet.
Den nøyaktige «trigger» for utvikling av tykktarmskreft er fortsatt ukjent. I 1990 ble en rekke morfologiske skritt kjent som normal slimhinne-adenom-adenokarsinom sekvens i kolorektal kreft på grunn av genetiske endringer foreslått [5]. Men mange genetiske hendelser fører til utvikling av sporadiske kolorektal kreft; ingen enkelthendelser forekommer i alle typer kreft, og derfor ingen enkelt mønster er aktuelt for hver svulst [6]. Derfor kan forstå spesifikke genetiske hendelser som oppstår i kolorektal kreftutvikling har betydelige implikasjoner for diagnose, prognose og potensielt genterapi i fremtiden.
Det har vært en nylig oppblomstring i interessen inn i årsakssammenheng mellom betennelse og kreft. Epidemiologiske studier har vist at kronisk betennelse predisponerer individer til ulike typer kreft [7]. Det er anslått at 15% til 20% av alle kreftdødsfall over hele verden er forbundet med underliggende kroniske infeksjoner og inflammatoriske responser i slike individer [7]. Det er bevis fra dyrestudier og observasjoner på mennesker som en daglig aspirin kan være effektive i å forebygge flere vanlige kreftformer [8], [9]. Dette har blitt bekreftet nylig i oppfølgingsstudier av pasienter rekruttert opprinnelig for randomiserte studier av daglig aspirin versus kontroll i forebygging av vaskulære hendelser [10] – [12]. I disse studiene avsetning til aspirin resulterte i en 40% reduksjon i kreftdødsfall fra 5 år og oppover [11] og en vedvarende reduksjon i kreftrelaterte dødsfall ved 20 års oppfølging [10], [12]. Observasjons studier har også vist at aspirin bruk er forbundet med redusert fjernmetastaser og tilbakefall i vanlige adenokarsinomer [13] -. [15], som tyder på at inflammasjon kan spille en rolle i progresjon, så vel som i utvikling av kreft
en av de mulige årsaker til de observerte chemo preventive effekter av aspirin i kolorektal kreft er dens evne til å redusere svulstutvikling ved inhibering av syklooksygenase 2 (COX-2) [16]. Det er økende bevis knytter den pro-inflammatorisk enzym COX-2 med utvikling og progresjon av tykktarmskreft. COX-2 fremkalles i kolonepitelet i aktiv inflammatorisk tarmsykdom (IBD) [17] og dets opp-reguleringen medfører forhøyede nivåer av prostaglandin (PG), spesielt PGE
2 som er et nedstrøms mediator av COX-2- og fremmer mange kreftfremkallende reaksjonsveier inkludert cellulær proliferasjon, apoptose og inhibisjon av angiogenese [18]. Dette bidrar til kronisk inflammatorisk prosess iscenesetter en svulst bærende mikromiljø, videre knytte betennelse med kreftutvikling.
mekanistisk sammenhengen mellom betennelse og kreft er fortsatt ikke helt klart. Økende bevis tyder på at mikro-RNA (mirnas) er involvert i reguleringen av inflammatoriske prosesser og er dysregulerte inflammatoriske tilstander i [19], inkludert ulcerøs kolitt [20]. Derfor mirnas dysregulation representerer en potensiell molekylære mekanismen for provoserende pathways å megle kreftutvikling og progresjon [21]. Spesielt er ekspresjonsnivåene av MIR-21 økte i aktiv inflammasjon i ulcerøs kolitt, som kan være assosiert med øket risiko for utvikling av kreft med denne tilstanden [22]. Oppregulering av MIR-21 har også blitt rapportert i andre betente tilstander inkludert allergisk luftveisbetennelse [23], inflammatoriske hudsykdommer [19] og
Helicobacter pylori
forbundet magekreft [24]. MIR-21 er nylig blitt vist å være en reell onkogen i pre-B-celle lymfom [25] og ble funnet å være overuttrykt i de fleste tumortyper [26]. MIR-21 er en potent stimulator av vev og vaskulær invasjon i kolorektal cancer, og disse virkningene vises delvis mediert av sin evne til å hindre translasjon av ett av de MIR-21 målgener, programmert celledød 4 (PDCD4) [27]. Mer nylig har et studium også vist betydelig nedregulering av PDCD4 i aktiv IBD sammenlignet med inaktive IBD, som også korrelert med oppregulering av MIR-21 [28], noe som ytterligere støtter koblingen mellom inflammasjon, MIR-21 og karsinogenese.
Vårt mål var å undersøke om et funksjonelt samspill eksisterer mellom COX-2 (pro-inflammatorisk enzym med økt uttrykk i CRC) og Mir-21 (onkogene MIR overexpressed i CRC) veier fører til nedregulering av svulsten lyddemper PDCD4 i kolorektalkreft ikke forbundet med tidligere kronisk inflammatorisk sykdom.
Materialer og metoder
det menneskelig vev
Denne studien fått etisk godkjenning fra Derbyshire forskningsetiske komité for innsamling av kolorektal kreft vev og matchet normal slimhinne fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for kolorektal kreft mellom august og desember 2010 på Royal Derby sykehus, Derby, UK.
Alle pasienter diagnostisert med tykktarmskreft ble diskutert på Royal Derby sykehus kolorektal tverrfaglig team forsamlingen etter radiologisk iscenesettelse, og de som anses egnet for reseksjon med kurativ hensikt var kvalifisert for inkludering.
Cell Culture
HCA-7 cellelinje skriftlig informert samtykke ble tatt og pasienter som ikke eller ikke villig til å gi informert samtykke ble ekskludert fra studien, som var de å trekke samtykket når som helst. ble hentet fra Health Protection Agency Culture Collection (HPACC, Porton Down, UK). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-media (DMEM) (GIBCO, Paisley, UK) supplert med 10% føtalt bovint serum (Fisher Scientific, Loughborough, UK), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Poole, UK), penicillin ( 50 enheter /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Sigma-Aldrich). Cellene ble dyrket i 75cm
3 ventilerte kolber (Tsz Scientific, Framingham, MA, USA) i fuktede inkubatorer ved 37 ° C med 5% CO
2 (Sanyo, Osaka, Japan).
celle~~POS=TRUNC og behandlinger
celler ble sådd med 500.000 celler /brønn i en 6-brønns plate og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 inntil de nådde 70% konfluens.
For MIR-21 hemming studier celler ble transfektert med MIR-21-hemmer (100 nM) eller en negativ egge kontroll (100 nM) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, USA), ved hjelp av Dharmafect to lipid transfeksjon reagens (Dharmacon Lafayette, CO, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
for COX-2-inhibering, ble cellene behandlet med serumfritt medium inneholdende kontrollen (0,1% DMSO) eller 100 pM NS398 (selektiv COX-2 inhibitor, Cayman Chemical, Michigan , USA) i 72 timer. For Prostaglandin E
2 (PGE
2) behandling, cellene ble dyrket 24 timer med serumfritt medium inneholdende DMSO bærer alene eller 1 uM PGE
2, slik at sluttkonsentrasjonen av DMSO i begge tilstander var de samme (0,1%). For kombinert MIR-21 hemming og PGE
2 behandling, PGE
2 ble lagt til kulturen 48 timer etter MIR-21 hemmer transfeksjon og cellene ble dyrket i ytterligere 24 timer.
RNA analyser
Total RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av TRI Reagens følge produsentens protokoll (Sigma-Aldrich) og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, dE, USA).
For Mir -21 studier, en total på 6 ng av total RNA ble brukt til å transkribere revers MIR-21 og RNU44 kontroll inn i cDNA som følge av TaqMan miRNA protokollen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ved hjelp av hårnål primere dirigert til mir-21 og RNU44 som en kontroll i en termosykler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) i 30 minutter ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, 5 minutter ved 85 ° C. Real-time kvantitativ polymerase chain reaction ble deretter utført ved hjelp mirnas bestemt TaqMan probe-analyser (MIR-21, ID 000397, RNU44, ID 001094, Applied Biosystems) i en Chromo4 termosykler (Bio-Rad Laboratories LTD, Hemel Hempstead, UK). MIR-21 uttrykk nivåer ble normalisert til RNU44 og beregnes på grunnlag av 2
-ΔΔCt metoden [29] med kommersielt tilgjengelig normal kolon RNA som en kalibrator.
For
COX-2
og
PDCD4
analyser, 30ng av total RNA ble konvertert til cDNA med tilfeldige heksamer bruker TaqMan høykapasitets cDNA revers transkripsjon protokollen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sanntid PCR ble utført i henhold til produsentens instruksjoner i en Chromo4 sanntid cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd) bruker kommersielt tilgjengelige 20x TAQMAN analyser (Applied Biosystems) for
PDCD4 plakater (Hs00377253_m1) og
COX 2 plakater (PTGS2 – Hs00153133_m1), sammen med kontrollgener
GAPDH plakater (Hs02258991_g1),
PGK1 plakater (Hs00943178_g1) og
HPRT plakater (Hs01003267_m1). For forsøkene i cellelinjer, ble kvantifisering utført i henhold til MIQE (Minimum Informasjon til offentliggjøring av kvantitativ real-time PCR Eksperimenter) retningslinjer [30] relativt til det geometriske gjennomsnittet av referansegener
GAPDH
,
PGK1
,
HPRT
bruker GENEX programvare (MultiD Analysis, Göteborg, Sverige). På grunn av begrenset prøven er mengder, i menneskelig vev uttrykk ble kvantifisert relativt til
GAPDH
alene som beskrevet ovenfor for MIR-21 analyser.
Protein analyserer
Protein ekstraksjon og kvantifisering var utført som tidligere beskrevet [31]. Western blotting ble utført ved anvendelse av lastestyre anti-beta-aktin-antistoff (1:1000 fortynning; Abcam, Cambridge, UK) i kombinasjon med anti-PDCD4 antistoff (1:500 fortynning, Sigma-Aldrich) eller anti-COX-2 (1 :1000 fortynning, Abcam). Anti-kanin-IgG-antistoff konjugert til alkalisk fosfatase ble anvendt som sekundært antistoff (1:30,000 fortynning; DAKO, Ely, UK) for påvisning av primær antistoffbinding. Immunokomplekser ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens hjelp av ECL-sett (Bio-Rad) ifølge produsentens protokoll. Den chemidoc systemet ble brukt til å ta bilder og Antall One (Bio-Rad) programvare ble brukt for kvantifisering av band «intensiteter.
Elisa Analyse
PGE
2 nivåer ble målt i media av HCA-7 behandlede og ubehandlede celler ved hjelp av PGE
2 elisa deteksjon kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Platene ble avlest med en plate photocytometer ved 450 nm (Wallac 1420 Victor, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism versjon 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Den Kolmogorov-Smirnov test viste alle vev eksempeldataene til å være ikke-parametrisk og alle celle linje for å være parametrisk. Derfor pasientens data er uttrykt som medianverdier og rekkevidde, mens cellelinjen dataene er uttrykt som gjennomsnittet og standardfeil for gjennomsnittet. Den Wilcoxon signed-rank test (parvise data); Mann-Whitney U-test (uparet) og den Kruskall-Wallis-test ble anvendt for sammenlignende analyse av pasientdata. Den paret t-test (parvise data); t-testen (uparet) og den ANOVA-test ble anvendt for sammenlignende analyse av cellelinje-data.
Statistisk signifikans ble bestemt ved p≤0.05 for både pasienten og cellelinje data.
Resultater
økning i MIR-21 direkte relatert til økning i COX-2 mRNA nivåer i CRC pasienter
Vi utførte vår studie på primær kolorektal kreft vev og paret normal slimhinne samlet mellom august og desember 2010 fra 45 elektive pasienter med sporadiske tilfeller av CRC. En prospektiv opprettholdt databasen ble befolket med pasientens demografi, neoadjuvant terapi og kreftegenskaper. Svulsten histopatologi ble klassifisert i henhold til det nasjonale minimum datasett for tykktarmskreft designet av Royal College of Patologer, UK [32]. Ingen pasienter ble ekskludert eller hadde trukket seg fra studien, og ingen hadde godartet sykdom. Median alder var 69 (spredning 51-88) år, og flertallet av pasientene var menn. Fire pasienter med endetarmskreft som fikk neo-adjuvant kjemoterapi-strålebehandling ble også inkludert basert på tidligere studier som viser at uttrykket av MIR-21 tilsvarer mellom utstrålt og ikke-utstrålt vev [33]. Alle pasientene hadde en komplett reseksjon og histologi bekreftet alle svulster var adenokarsinomer. (Tabell S1 og S2 i File S1)
Ved hjelp av real time RT-PCR vi studerte uttrykk for
COX-2
og Mir-21 i tumorvev i forhold til normal slimhinne i vår kohort av CRC pasienter. Relativ uttrykk for MIR-21 var signifikant oppregulert i CRC vev sammenlignet med matchet normal slimhinne (p 0,0001, Wilcoxon matchet-parene signert rank test, Fig. 1A). Videre ble uttrykk nivåer av MIR-21 korrelert med de vanligste klinisk-patologiske funksjoner for CRC (tabell 1). Høyere ekspresjon av MIR-21 i tumorvev signifikant korrelert med en dårligere Dukes fase (p 0,0001, Kruskall-Wallis test, Fig. 1B), lymfeknutemetastase (p 0,0001, Mann-Whitney U-test, Fig. 1C) , og dybden av tumorinvasjon (pT trinn; p 0,0001, Mann-Whitney U-test, fig. 1 D). Disse funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter [34], [35], og bekrefter at MIR-21 er oppregulert i CRC med økende uttrykk nivåer korrelerer med økt alvorlighetsgrad av sykdommen.
Kolonne søylediagrammer indikere median og kinnskjegg demonstrere IQR av MIR-21 uttrykk. Merk at betydelig økning i MIR-21 uttrykk er observert i tumorer, og dette øker ytterligere med forverring scenen, lymfeknute engasjement og dybden av invasjonen. Statistisk signifikans ble beregnet ved bruk av Wilcoxon signed-rank test i A, Kruskall-Wallis test i B, og Mann-Whitney U test i C og D.
Relativ uttrykk for
PDCD4
var signifikant nedregulert i CRC vev sammenlignet med matchet normal slimhinne (p 0,0001, Wilcoxon en matchende par signert rank test, fig. 2A). Imidlertid var det ingen korrelasjon mellom
PDCD4
ekspresjon i tumorvevet, og det Dukes fase, med ekspresjon i Dukes’A trinn er allerede betydelig redusert sammenlignet med normalt vev, og ingen ytterligere reduksjon sett i mer avanserte stadier ( fig. 2B). Det er usannsynlig at den observerte nedregulering av
PDCD4
på RNA-nivå er forårsaket av MIR-21 gitt at denne mikro-RNA virker til å forhindre PDCD4 mRNA oversettelse i stedet indusere dets nedbrytning eller transkripsjonen undertrykkelse [27]. Gitt at alle pasientene i studien gjennomført ondartede svulster med en tildelt Dukes «stadium, data tyder på at i løpet av progresjon av malignitet økende mengder av MIR-21 fører til hemming av oversettelse av den allerede reduserte nivåer av
PDCD4
mRNA. Etikk begrensninger hindret oss i å analysere PDCD4 proteinnivåene hos disse pasientene for å bekrefte denne hypotesen, og vi dukket opp igjen til
in vitro
studier for å få mekanistiske innsikt (se neste avsnitt).
Kombinert relative uttrykk for PDCD4 og COX-2 ble analysert ved primær tumor mot avstemt tilstøtende normal slimhinne (n = 45, A og C henholdsvis), og i normal (N) og tumor (T) vev fra Dukes A (n = 9), B (n = 23) og C (n = 13) henholdsvis trinn (B og D). kolonne søylediagram Den viser median og kinnskjegg demonstrere IQR av mRNA uttrykk. Statistisk signifikans ble beregnet ved bruk av Wilcoxon signed-rank test i A og C; den Kruskall-Wallis-test B og D. Legg merke til at
PDCD4
er nedregulert i tumor sammenlignet med normalt, men ingen forskjeller er sett i den gjenværende ekspresjon i tumorer av forskjellig Dukes «stadier. I motsetning
COX-2
nivåene øker i tumor og med sykdom stadium.
Interessant, relative uttrykk for
COX-2
mRNA ble signifikant oppregulert i tumorvev sammenlignet med deres matchet normal slimhinne (p 0,0001, Wilcoxon en matchende par signert rank test, fig. 2C). Videre, i likhet med det som ble observert med MIR-21, relative uttrykk for
COX-2
mRNA i tumorvev signifikant korrelert med en dårligere Dukes «stadium (p 0,0001, Kruskall-Wallis test, Fig. 2D) . Gitt at MIR-21 og betennelser har begge vist seg å redusere PDCD4 protein nivåer [27], [36], er en mulig tolkning av disse funnene at økningen i MIR-21 og
COX-2
kan være funksjonelt beslektet og at de kan lede til nedregulering av PDCD4 gjennom en felles bane.
HCA-7-celler er et egnet system for å analysere forholdet mellom MIR-21 og COX-2 overekspresjon i CRC
for ytterligere å undersøke mulighetene for et funksjonelt forhold mellom COX-2 og MIR-21 i nedregulering av PDCD4 i CRC vi dukket opp igjen til en
in vitro
cellekultursystem. Vi valgte humane kolon adenocarcinom-cellelinje HCA-7 isolert fra en Dukes «B tumor [37], fordi den har høye endogene nivåer av COX-2 [38] og etter behandling med COX-2 inhibitor NS398, øker ekspresjon av
PDCD4 product: [39]. For å bestemme hvorvidt HCA-7-celler er et godt system for å studere den funksjonsmessige forhold mellom den MIR-21 og COX-2-trasé, vi først nødvendig for å fastslå hvorvidt MIR-21 blir uttrykt og er ansvarlig for
PDCD4
downregulation i disse cellene. For å oppnå disse vi benyttet RT-PCR for å undersøke nivået av MIR-21 i ubehandlede HCA-7-celler eller i celler behandlet med 100 nM av en MIR-21-inhibitor eller krafse kontroll basert på publiserte arbeider som viser at denne konsentrasjonen er ikke-cytotoksisk og effektive i hemmende studier [40]
Vi fant at Mir-21 er uttrykt ved høye nivåer i HCA-7 celler og disse nivåene er ikke påvirket av behandling med krafse små RNA, men er betydelig redusert (p . 0.0001 , uparet t-test) etter 72 timer behandling med en spesifikk MIR-21 små RNA-inhibitor (fig. 3A). Ingen signifikante forskjeller i PDCD4 mRNA-nivåer ble observert ved kvantitativ RT-PCR i en hvilken som helst av behandlingsbetingelsene (figur 3B.); I motsetning til dette ble en signifikant økning (p = 0,002, uparet t-test) i PDCD4 observert på proteinnivået ved western blot i MIR-21-inhibitor behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller krafse kontroll behandlede celler. Disse funnene er i tråd med MIR-21 som virker til å hemme oversettelse av PDCD4 mRNA i stedet for å dirigere sin fornedrelse og bekrefter at Mir-21 spiller en rolle i PDCD4 downregulation i HCA-7 celler. Derfor både COX-2 og MIR-21 trasé bidra til nedregulering av PDCD4 i HCA-7 celler, noe som gjør dem egnet system for å studere hvorvidt en funksjonell sammenheng mellom de to banene.
Etter 72 timer fra transfeksjon signifikant reduksjon i MIR-21 nivåer er sett bare i celler transfektert med MIR-21-inhibitor (A).
PDCD4
mRNA nivåer ble ikke påvirket av hemming av MIR-21 (B). Western blot-analyse av PDCD4 (C toppfeltet for et representativt blot) viser en betydelig økning i proteinnivåer i celler transfektert med inhibitor sammenlignet med ubehandlede eller krafse kontroll behandlede celler, da kvantifisert relativt til beta-aktin protein (Bact) som en laste kontroll (C nedre panelet). kolonne søylediagram den indikerer middelverdien og linjene viser standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. Forsøkene ble gjentatt tre ganger og analysert i duplikat. Ubehandlet = celler kultur i media; krafse = celler transfektert med krafse RNA-hemmere; MIR-21 hemmer = celler behandlet med MIR-21 RNA-hemmer.
Forholdet mellom MIR-21 og COX-2 i nedregulering av PDCD4 i HCA-7 celler
Å videre undersøke den funksjonelle samvirke mellom MIR-21 og COX-2 veier, vi først analysert COX-2-mRNA og proteinnivåene i HCA-7-celler etter 72 timers behandling med MIR-21-inhibitor i forhold til krafse kontroll og ubehandlede celler. ble ikke observert noen forskjell i COX-2 ekspresjon hverken ved mRNA eller på proteinnivå (p = 0,62 og p = 0,83 henholdsvis, uparet t-test), som viser at COX-2 er ikke et mål for MIR-21 (fig. S1 Fil S1).
neste behandlet HCA-7-celler med 100 pM NS398, en spesifikk COX-2 inhibitor rapportert å være ikke-cytotoksiske og effektiv ved denne konsentrasjonen i cellekultur [41], eller med kjøretøy alene (0,1% DMSO). COX-2 spiller en avgjørende rolle ved betennelse i de innledende trinn av omdannelse av arakidonsyre til prostaglandiner som innbefatter prostaglandin E (PGE
2) og oppregulering av COX-2 i kolorektal kreft har vært vist å assosiere med markert økning ved fremstilling av PGE
2 [42]. Ved hjelp av Elisa for å måle nivåene av PGE
2 har vi funnet en signifikant reduksjon (p = 0,006, uparet t-test) i media av celler behandlet med NS398 sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med bærer alene, i samsvar med hemning av COX 2 katalytisk aktivitet (fig. S2 i File S1).
Å ha effekten av den behandlingen vi målte den relative uttrykk for MIR-21, og vi kunne oppdage en betydelig reduksjon i MIR-21 etter NS398 behandling for 72 timer (p 0,01, uparet t-test; fig. 4A). I motsetning til dette, har behandling av HCA-7-celler med NS398 ikke forandre ekspresjon av PDCD4 mRNA (p = 0,74, uparet t-test) (Fig. 4B), en observasjon som er i kontrast til den tidligere rapporterte 1,5 ganger oppregulering av PDCD4 mRNA følge behandling av HCA-7-celler med NS398 [39]. Forskjellen kan skyldes metodene som brukes: sistnevnte studien analyserte PDCD4 mRNA uttrykk ved Northern blot og kvantifisert det relativt til GAPDH, mens i vår studie har vi målt mRNA nivåer ved hjelp av kvantitativ RT-PCR og normalisert data ved hjelp av geometriske gjennomsnittet av tre referanse gener (GAPDH, PGK og hprt) i henhold til retningslinjene MIQE [30] (se metoder). Vår sanntid PCR data tyder på at NS398 behandling fører til en reduksjon i GAPDH-nivåer (fig. S3 i File S1), og denne endringen vil resultere i en tilsynelatende økning i PDCD4 nivåer hvis GAPDH ble anvendt som det eneste referanse-genet. Derfor konkluderer vi med at NS398 behandlingen ikke endrer PDCD4 transkripsjon sats eller mRNA stabilitet; imidlertid, i overensstemmelse med den observerte reduksjonen i MIR-21, betydelig oppregulering i PDCD4 proteinekspresjon (p 0,001, uparet t-test) ble observert i NS398 behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller bærer alene celler (figur 4C.). Disse data indikerer at nedregulering av PDCD4 av COX-2 ikke er en følge av redusert PDCD4 mRNA-syntese eller stabilitet, men heller at COX-2 kan virke ved å fremme en økning i MIR-21 som i sin tur hindrer translasjon av PDCD4 mRNA.
Etter 72 timers behandling signifikant reduksjon i MIR-21 nivåer er sett i NS398 behandlede celler (A).
PDCD4
mRNA nivåer påvirkes ikke av NS398 behandling (B). Western blot-analyse av PDCD4 (C toppfeltet for et representativt blot) viser en betydelig økning i proteinnivåer i NS398 behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller bærer alene (DMSO) behandlede celler, da kvantifisert relativt til beta-aktin protein (Bact) som en lasting kontroll (C nedre panelet). kolonne søylediagram den indikerer middelverdien og linjene viser standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. Forsøkene ble gjentatt tre ganger og analysert i triplikat. Ubehandlede = celler dyrket i media; DMSO = celler dyrket i media supplert med 0,1% DMSO kjøretøy; NS398 =-celler dyrket i medium supplert med NS398 forberedt i DMSO til en sluttkonsentrasjon på 100 uM NS398 og 0,1% DMSO.
COX-2-aktivering av MIR-21 i HCA-7-celler blir mediert av PGE
2
på grunn av rollen av COX-2 i produksjonen av prostaglandiner, for å undersøke mekanismen bak aktivering av MIR-21 av COX-2-vi behandlet HCA-7-celler med 1 pM PGE
2 for 24 timer som denne konsentrasjonen ble vist seg å fungere effektivt på disse cellene [38]. Vi fant at MIR-21 ekspresjon var signifikant oppregulert (p = 0,019, uparet t-test) i PGE
2 behandlede celler sammenlignet med bærer (0,1% DMSO) behandlede eller ubehandlede celler (fig. 5A). Ingen endringer ble observert i PDCD4 mRNA nivåer i PGE
2 behandlede celler (Fig. 5B); imidlertid en signifikant reduksjon (p 0,05, uparet t-test) i PDCD4 proteinnivåer ble observert som parallell økning i MIR-21 (figur 5C.). Kombinert behandling med PGE
2 og Mir-21 hemmer brakt nivåene av MIR-21 ned til nivåer sammenlignes med de i ubehandlede celler (Fig. S4 i File S1), og behandling med aspirin også ført til en nedgang i speil 21 nivåer (fig. S5 i File S1). Disse data tyder på at COX-2-drevet nedregulering av PDCD4 i dette modellsystemet er hovedsakelig på grunn av PGE
2-indusert oppregulering av MIR-21.
Etter 24 timers behandling signifikant økning i MIR-21 nivåer er sett i PGE
2 behandlede celler (a).
PDCD4
mRNA nivåer blir ikke påvirket av PGE
2 behandling (B). Western blot-analyse av PDCD4 (C toppfeltet for et representativt blot) viser en betydelig reduksjon i proteinnivåene i PGE
2 behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller bærer alene (DMSO) behandlede celler, da kvantifisert relativt til beta-aktin protein ( Bact) som en lasting kontroll (C nedre panelet). kolonne søylediagram den indikerer middelverdien og linjene viser standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikans ble beregnet ved anvendelse av uparede t-test. Forsøkene ble gjentatt tre ganger og analysert i duplikat. Ubehandlede = celler dyrket i media; DMSO = celler dyrket i media supplert med 0,1% DMSO kjøretøy; PGE
2 = celler dyrket i medium supplementert med PGE
2 fremstilt i DMSO til en endelig konsentrasjon på 1 uM PGE
2 og 0,1% DMSO.
diskusjon
dysregulering av mirnas er en anerkjent trinn i patogenesen av mange krefttyper, inkludert CRC. MIR-21 er et miRNA ofte oppregulert i CRC, som har økt ekspresjon nivåer er assosiert med dårligere terapeutiske resultater i CRC [34]. Vi har fått bekreftet at overuttrykk av MIR-21 korrelerer signifikant med dårligere patologisk iscenesettelse i vår CRC pasientens kohort (Fig. 1), som består av pasienter som hadde hatt svulster i et tildelt Dukes «stadium, noe som tyder på en viktig rolle MIR-21 i kreft invasjon og formidling.
Få av de potensielle nedstrøms mål regulert av MIR-21 har blitt bekreftet, og disse inkluderer programmert celledød 4 (PDCD4) tumor suppressor gen som hemmer neoplastisk transformasjon [43]. Nyere studier har vist en progressiv reduksjon i PDCD4 ekspresjon fra normal slimhinne, til polypp, til kolorektal tumor [33]. Interessant nok en signifikant økning i MIR-21 ble observert i CRC sammenlignet med normalt, men ikke mellom adenomatøse polypper og normal, selv om en reduksjon i PDCD4 ekspresjon var tydelig ved denne overgang [33]. I vår kohort observerte vi en reduksjon i PDCD4 mRNA-nivåer i tumorene i forhold til de normale vev, men ingen forandringer som sykdommen utviklet med Dukes fase (fig. 2A). Tatt sammen Disse observasjoner tyder på at ved overgang fra normal til nedregulering av hyper PDCD4 kan skyldes regulering på nivået av transkripsjon og /eller RNA og proteinstabilitet. Men i overgangen til malignitet MIR-21 mediert hemming av oversettelsen av PDCD4 protein nivåer av den allerede reduserte nivåer av
PDCD4
mRNA blir dominerende, og dermed fremme ytterligere progresjon av kreft. Derfor bestemme oppstrøms faktorer som påvirker MIR-21 uttrykk er medvirkende i å etablere hvorvidt og hvordan Mir-21 bidrar til kreft progresjon, og for å gi potensielle terapeutiske mål.
Gitt at i vår kohort av CRC pasienter oppregulering av speil 21 er positivt relatert til at av COX-2 mRNA og med verre patologisk iscenesettelse (fig. 1 og 2B), hypotese vi at Mir-21 oppregulering i CRC kan være knyttet til en inflammatorisk respons. Tabell S2.
