Abstract
kreft stamceller (cscs) anses å være ansvarlig for den dystre prognosen for kreftpasienter. Men lite er kjent om de molekylære mekanismene bak kjøp og vedlikehold av CSC egenskaper i kreftceller på grunn av sin sjeldenhet i kliniske prøver. Vi her indusert CSC egenskaper i kreftceller ved hjelp av definerte faktorer. Vi retroviralt innført et sett med definerte faktorer (
OCT3 /4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
) i humane tykktarm kreft celler, etterfulgt av kultur med konvensjonell serumholdig medium , ikke humane embryonale stamceller medium. Vi vurderte deretter CSC eiendommer i cellene. De tykktarm kreft celler transduced med de tre faktorene viste signifikant forbedret CSC egenskaper i forhold til markør genuttrykk, sfære formasjon, chemoresistance og tumorgenisiteten. Vi har betegnet cellene med CSC egenskaper indusert av faktorene, en undergruppe av de transduserte celler, som induserte cscs (iCSCs). Videre etablerte vi en ny teknologi for å isolere og samle iCSCs basert på forskjeller i graden av fargestoff-effluxing aktivitet ekstrautstyr. De xenografter avledet fra våre iCSCs var ikke teratomas. Spesielt, i motsetning til tumorene fra foreldrekreftcellene, ICSC-baserte tumorer lignet faktiske humane tarmkreft vev i forhold til deres immunohistologiske funn, som viste colonic avstamning differensiering. I tillegg fikk vi bekreftet at fenotyper av våre iCSCs var reproduserbar i serietransplantasjonsforsøk. Ved å innføre definerte faktorer, genererte vi iCSCs med avstamning spesifisitet direkte fra kreftceller, ikke
via
en indusert pluripotent stamcelle tilstand. Den nye fremgangsmåten gjør det mulig å oppnå rikelige materialer fra cscs som ikke bare har forbedret tumordannelse, men også evnen til å differensiere til å rekapitulere en bestemt type cancervev. Vår metode kan være av stor verdi for å forstå cscs og utvikle nye behandlingsformer rettet mot cscs
Citation. Oshima N, Yamada Y, Nagayama S, Kawada K, Hasegawa S, Okabe H, et al. (2014) Induksjon av kreft stamcelleegenskaper i tykktarm kreft celler med definerte faktorer. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10,1371 /journal.pone.0101735
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 03.02.2014; Godkjent: 10 juni 2014; Publisert: 09.07.2014
Copyright: © 2014 Oshima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien hadde blitt gjort mulig takket være den balzanprisen til Shinya Yamanaka (https://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), og støttes av Forskningsbistandsmidler fra Shinryokukai Generelt Incorporated Association (https: //www.shinryokukai.com/) (til TA), som er en ikke for profitt alumni forening av Kobe university school of Medicine, og Grants-i-Aid for Scientific Research fra Japan Society for Promotion of Science (JSP; http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (til NO), og ingen var JSP stipendiater. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet, og dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Konkurrerer interesser: INGEN og TA er medlemmer uten lønn på Shinryoku-Kai Generelt Incorporated Association som er en ikke for profitt alumni forening av Kobe University school of Medicine. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
introduksjon til
Cancer stamceller (cscs) har blitt foreslått å være ansvarlig for den dårlige prognosen for pasienter med ulike kreftformer på grunn av deres egenskaper og atferd, som for eksempel høyere forekomst av terapeutisk motstand og tilbakefall [1] – [3]. Derfor er cscs betraktes som et potensielt terapeutisk mål. Å etablere nye behandlinger rettet mot cscs, er det viktig å belyse de molekylære mekanismene bak oppkjøpet av stemness i cscs. Men disse er fortsatt uklart, fordi cscs er en sjelden populasjon av celler i kreftvevet, og sjeldenhet av cscs gjør det vanskelig å identifisere og samle dem.
Dermed genererer cscs
in vitro
fra kreftceller og å undersøke deres egenskaper er ansett for å være en nyttig metode for å overvinne dette problemet. Flere studier [4] – [6] rapportert at celler med noen CSC egenskaper som forbedret tumorgenisitet var induserbar. Men de refererer ikke til om cellene har evne til differensiering til å rekapitulere spesifikke typer av kreftvev. Derfor er det fortsatt uklart om det er mulig å generere cscs at nettopp tilsvarer primære kreftstamceller.
Når det gjelder kjøp av stemness, i generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCs), ble det funnet at ektopisk uttrykk for bare tre eller fire transkripsjonsfaktorer (
OCT3 /4
,
SOX2 Kjøpe og
KLF4
med eller uten
C-MYC
) kan indusere embryonale stamcelleegenskaper i somatiske celler når MGP dyrkningsforhold blir brukt [7], [8]. Disse genene kan også direkte indusere nevrale stamceller (NSC) egenskaper i somatiske celler ved hjelp av neuro-sfæren dyrkningsforhold [9]. Således er disse genene har evnen til å fremkalle forskjellige typer av stemness i somatiske celler, avhengig av dyrkningsbetingelsene. Derfor hypotese vi at disse genene kan også indusere CSC egenskaper i kreftceller.
I denne studien har vi omformet
OCT3 /4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
inn i menneskelige tykktarmskreftceller under foreldrecelledyrkningsforholdene og analysert transduced celler i form av sine CSC egenskaper
in vitro Hotell og
in vivo
. Derfor kunne det sett av tre gener indusere CSC egenskaper i en undergruppe av tykktarmskreftceller, og vi var i stand til å samle cellene med indusert CSC egenskaper basert på deres forskjell i dye-utstrømming aktivitet. De innsamlede cellene viste colonic avstamning spesifisitet
in vitro Hotell og
in vivo
. De induserte cscs generert ved hjelp av denne metoden kan bidra til å undersøke de molekylære mekanismene bak kjøp og vedlikehold av CSC egenskaper i kreftceller og til å utvikle CSC-targeting terapi.
Materialer og metoder
Cellelinjer og Cell Culture
menneske~~POS=TRUNC kolorektal kreft cellelinjer (SW480 og DLD-1) ble levert fra celle~~POS=TRUNC Resource Center for Biomedical Research, Tohoku University. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Life Technologies), og som brukes ved tidlig passasje for eksperimentene.
RNA isolering og kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit Plus ( QIAGEN, Hilden, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner. En aliquot 1 ug total RNA ble revers transkribert ved hjelp av en Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel, Switzerland), ifølge produsentens protokoller. Kvantitativ revers-transkriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR) ble utført med Faststart Universal SYBR Grønn Master Mix (Roche) og ble analysert med Step-One real-time PCR system (Life Technologies). Primersekvensene er vist i tabell S1
Flow Cytometry
En enkeltcellesuspensjon fra dyrkede celler, ble immunfarget med et mus anti-humant CD133 antistoff (klon:. AC133, Miltenyi Biotec, Auburn, CA , USA), mus anti-human CD44 antistoff (Klon: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, USA) eller mus anti-human ABCG2 antistoff (Klon: 5D3, BioLegend, San Diego CA, USA). Etter å ha blitt vasket ble cellene resuspendert med PBS inneholdende 2% FBS, og døde celler ble merket ved 2 ug /ml propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA). Enkeltcellesuspensjoner fra paraformaldehyd-fikserte celler ble permeabilisert med 0,2% Triton-X (Sigma), og ble immunfarget med et muse-anti-human CD26-antistoff (klon: M-A261, BD) og kanin-anti-human LGR5 (klon: EPR3065Y , Abcam, Cambridge, MA, USA). I alle av flowcytometri (FCM) eksperimenter ble isotype-antistoffer som svarer til hver antistoff som brukes som kontroller. Prøvene ble analysert av en FACS Aria II instrument (BD).
Western blotting
Cellene ble lysert med M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, USA ). Cellelysatene ble underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Etter den elektroforetiske overføring av proteiner, immunblotting med et muse-anti-humant ALDH-antistoff (klon: 44 /ALDH, BD), etterfulgt av et pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff, ble utført. For å bestemme den kjemiluminescens, LAS 4000 systemet (Fuji film, Tokyo, Japan) ble anvendt.
Cell Cycle Analysis
Cellene ble fiksert med 70% etanol i PBS ved 4 ° C natten over. Cellene ble behandlet med ribonuklease å fordøye RNA og farget med 50 ug /ml PI. Cellene ble analysert ved flowcytometri (FACS Aria II).
5-FU-chemoresistance analyse
celleviabilitet etter 5-fluorouracil (5-FU, Kyowa KIRIN, Tokyo, Japan) eksponeringen ble målt ved hjelp av WST-8 kolorimetrisk analyse (Celletelling Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). En total av 5 x 10
3-celler ble sådd ut i 96-brønners plater på dag 10, og mediet ble erstattet med DMEM inneholdende 1 eller 50 ug /ml av 5-FU 24 timer etter såing. Etter inkubasjon i 48 timer ble absorbans ved 450 nm målt ved anvendelse av en mikrotiter plateleser. Cellen levedyktighet ble beregnet som forholdet mellom absorbans verdier for samme prøve inkuberes i DMEM uten 5-FU i 48 timer.
Sphere-analysen
Cellene ble overført til Ultra Low festeplater (Corning Incorporated, Corning, New York, USA) i serumfritt DMEM inneholdende 10 ng /ml bFGF (Wako, Osaka, Japan), 10 ug /ml human insulin (CSTI, Miyagi, Japan), 100 pg /ml human transferrin (Roche) og 100 ug /ml BSA (Nacalai Tesque), og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i 10 dager.
Dye utstrømning aktivitet Analyse
Et fargestoff efflux aktivitetsanalyser ble utført i henhold til tidligere beskrevne fremgangsmåter [10] – [12] med noen modifikasjoner. Cellene ble høstet i DMEM inneholdende 2% FBS og 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Cellene ble inkubert i DMEM inneholder 2% FBS og 1 mM HEPES med Hoechst33342 (Life Technologies) på 5 mikrogram /ml med eller uten samtidig administrering av verapamil (Sigma-Aldrich) på 50 eller 250 mikrometer i 90 minutter ved 37 ° C, og ble forsiktig snudd hvert 30. minutt. Etter inkubering ble cellene resuspendert i PBS inneholdende 2% FBS og 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Cellene ble kontra med 2 ug /ml PI å merke døde celler, og ble ført gjennom en 35 um maskefilter, holde dem på is i flowcytometri og sortering. Celler ble analysert og sortert ved FACS en Aria II. Hoechst fargestoff var spent med en UV-laser (355 nm), og fluorescensen ble målt med både et filter 670/50 (Hoechst Red) og et filter 450/50 (Hoechst blå).
in vivo tumorgenisitet Study
Det er totalt 1 × 10
6, 3 × 10
5 eller 1 × 10
5 celler i 100 mL serumfritt PBS ble injisert subkutant i to rygg flankene en immunodeficient naken mus (KSN /Slc mus, SLC, Shizuoka, Japan). Tumorvolumet ble beregnet ved formelen 0,5 x L x W
2 (L: lengde, W: bredde). Forsøkene ble gjennomgått og godkjent av dyreetikk og forskningskomiteen, Kyoto University (Permit Number: 11537, 12237, 13217), og gjennomføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Serie Transplantasjon
For serietransplantasjonsforsøk, sorterte cellene ble dyrket i ni-16 dager (første kultur) etter sortering, så totalt 3 × 10
6-celler ble subkutant injisert i immunsvikt nakne mus. Tumorene (første svulster) ble skåret ut når de nådde en diameter på mer enn 10 mm, og ble patologisk analysert. Det utskårede tumorer ble også enzymatisk dissosiert til enkeltcellesuspensjoner av en gentleMACS Dissociator and Human Tumor Dissosiasjon Kit (Miltenyi Biotec), ifølge produsentens protokoller. De dissosierte celler ble subkutant injisert inn i nakne mus etter å ha vært dyrket i seks til ti dager (andre kultur), og ble analysert ved hjelp av FCM basert på deres fargestoff-utløps aktivitet på dag seks til tolv etter dissosiasjon. Prosedyren ble gjentatt tre ganger til den fjerde dyrkede celler fra dissosiasjonen av det tredje settet med tumorer ble erholdt.
Immunhistokjemi
formalinfikserte, parafininnstøpte seksjoner som stammer fra xenotransplantater ble farget med anti-human cytokeratin 20 (CK20) monoklonalt antistoff (Klon: Ks20.8, fortynning 1:25, Dako, Glostrup, Danmark), anti-human cytokeratin 7 (CK7) kanin monoklonalt antistoff (Klon: SP52, konsentrasjon, 0,536 ug /ml, Roche) eller anti-human haletypen homeobox 2 (CDX2) mus monoklonalt antistoff (klon: AMT28, fortynning 1:500, Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) ved hjelp av avidin-biotin-metoden immunoperoxidase. Mikrobølgeovn antigen gjenfinning ble utført. For immunocytochemistry, ble de dyrkede celler, som ble løst med 4% paraformaldehyde, farget med anti-CK20 antistoff (Klon: Ks20.8, fortynning 1:100) eller anti-CDX2 antistoff (Klon: CDX2-88, prediluted, Abcam) og kontra med Hoechst33342 (Life Technologies) for å identifisere alle kjerner.
Resultater
Transduksjon av
OCT3 /4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
inn en tykktarmskreft cellelinje
Vi omformet
OCT3 /4, SOX2, KLF4
, eller en blanding av de tre (heretter, OSK) i SW480 human kolon kreftcelle linje ved hjelp av retrovirusvektorer [7] (se Methods S1), og også en Mock vektor (tom vektor) ble anvendt som en kontroll. Disse cellene ble deretter kalt O-SW480, S-SW480, K-SW480, OSK-SW480 og M-SW480, henholdsvis. De parentale celler ble også betegnet som Wt-SW480. I denne studien, ble cellene dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS og evaluert på dag 10 etter transduksjon (fig. S1A). Vi bekreftet retroviral transduksjon og mRNA uttrykk for omsatte gener (Fig. S1B og S1C). I M-SW480 celler,
KLF4
ble endogent uttrykt, mens
OCT3 /4 Hotell og
SOX2
ikke ble oppdaget. Skjelnes morfologiske endringer ble sett i hver av linjene som ble tilskrevet deres transdusert gen (er) (Fig. S1D).
Uttrykk av tidligere rapportert markører knyttet til kolon cscs og tarm stamceller i transduced-SW480 celler
for å vurdere stamcelle status for de omsatte cellene, vi evaluert uttrykket nivåer av tidligere rapporterte kandidat markørgener, riktignok uenighet [13], [14], av kolon cscs og tarm stamceller, for eksempel som
CD133 product: [15], [16],
CD44 product: [17], [18],
CD26 product: [19],
ALDH1 product: [ ,,,0],20],
ABCG2 product: [21] og
LGR5 product: [22] av QRT-PCR (fig. 1a). Blant de cellelinjer, vil bare de OSK-SW480-cellene var signifikant øket mRNA-ekspresjonsnivåene av alle genene i forhold til M-SW480-celler (n = 3).
(A) QRT-PCR av tidligere rapportert markører beslektede til kolon cscs og tarm stamceller i transduced SW480 celler. Alle markørene ble oppregulert i OSK-SW480 celler. De mRNA uttrykk nivåer ble normalisert til de av
GAPDH
. De relative ekspresjonsnivåer i forhold til de av M-SW480 er vist. (B) Protein uttrykk nivåer av CSC markører i omsatte SW480 celler som bestemmes av en flowcytometrisk (FCM) analyse. Dataene fra tre uavhengige eksperimenter viste at antallet CD133-, CD44-høy, CD26- og ABCG2-positive celler ble signifikant økt i OSK-SW480 celler. De representative dot plots av hver markør er vist i figur S2. (C) Et protein ekspresjon av ALDH1 i de transduserte SW480-celler bestemt ved en Western blot-analyse. Panelet viser representative data fra tre uavhengige forsøk. (D) celleproliferasjon
in vitro
. Totalt 3 x 10
5-celler ble sådd ut på seks-brønns plater på dag syv og ble tellet på dag 11. Antallet OSK-SW480-celler var lavere enn for M-SW480-celler (n = 3). (E) Cellene i G1 /0-fase ble detektert ved en FCM-analyse på dag 11. Prosentandelen av celler i G1 /0-fase signifikant økning i O-, K- og OSK-SW480-celler (n = 3) . (F) 5-FU-chemoresitance analyse. Levedyktigheten til OSK-SW480-celler i nærvær av 5-FU var signifikant høyere enn den av M-SW480-celler både på 1 og 50 ug /ml konsentrasjoner av 5-FU (n = 3). Levedyktigheten av de M-SW480 celler ved hver konsentrasjon ble satt til 100%. De feilfelt indikerer standardavviket: SD. * P 0,05, ** P. 0,01, Dunnetts test
Neste, vi har evaluert protein uttrykk nivåer av markører (fig 1B, 1C og S2.). FCM-analyse viste at OSK-SW480 celler hadde signifikant økt protein uttrykk nivåer av CD133, CD26 og ABCG2. De fleste av de transduserte celler som uttrykte CD44, men antall celler som uttrykker et høyere nivå av CD44 ble økt omkring to ganger i OSK-SW480-celler sammenlignet med M-SW480-celler (n = 3) (fig. 1B og S2). De OSK-SW480-celler viste en tendens til å ha et øket nivå av ekspresjon LGR5, men dette var ikke statistisk signifikant (fig. 1B og S2) (n = 3). Et Western blot-analyse viste at ekspresjonsnivået av ALDH1 ble øket bare i OSK-SW480-celler (fig. 1C). Disse resultatene antydet at OSK har evnen til å fremkalle CSC signaturer i en undergruppe av SW480 celler.
spredning og cellesyklus i transduced SW480 celler
neste vurderes veksten av cellene
i vitro
. Antallet OSK-SW480 celler ved 96 timer etter utsåing 3 x 10
5-celler var signifikant lavere enn den til M-SW480 celler (p 0,01, n = 3) (figur 1D.). Jo lenger observasjon viste også konsistente resultater (fig. S3). For å undersøke om de transduserte gener påvirket cellesyklusen, utførte vi en cellesyklusanalyse av FCM med DNA-farging ved hjelp av propidiumjodid (fig. 1E). Prosentandelen av celler i G1 /0-fasen var omtrent 10% høyere i O-, K- og OSK-SW480 kulturer enn den av M-SW480-celler (n = 3).
Sensitivitet overfor kjemoterapeutiske midler
for å undersøke anticancermedikamentsensitivitet av cellene, har vi sammenlignet overlevelse av cellene etter behandling med 1 eller 50 ug /ml av 5-FU i 48 timer ved WST-8 kolorimetrisk analyse (fig. 1F). I de OSK-SW480-celler, overlevelsesraten var rundt 20% høyere enn den for M-SW480 celler ved begge konsentrasjoner av 5-FU (n = 3). Dette resultatet antydet at OSK-SW480 celler inneholdt cellene ervervet chemoresistance til 5-FU.
Sphere-analysen
Det er tidligere rapportert at cscs hadde en høyere evne til å danne kuler i henhold til kultur i lave feste retter og serumfritt medium [2], [16]. For å undersøke sfæren dannende evne våre transduced celler, utførte vi en sfære formasjon analyse (Fig. 2A). I M-SW480 celler, vi knapt observert noen kuler. I motsetning til dette, i det O-, K- og OSK-SW480 kulturer, ble det observert en tydelig øket antall av kulene (gjennomsnitt: 47, 23 og 50, henholdsvis n = 3), noe som indikerer at
OCT3 /4, KLF4 Hotell og OSK bidratt til spheroid formasjonen i en undergruppe av SW480 celler.
(A) spheroid formasjon analysen. Totalt 1 × 10
4-celler ble sådd ut på lave feste retter på dag 10 og dyrket med serumfritt medium i 10 dager. I O-, K- og OSK-SW480 kulturer, ble antallet kuler signifikant økt sammenlignet med den i M-SW480 celler. De feilfelt indikerer SD (n = 3). Skala barer: 100 mikrometer. (B) Den tumorgenisitet av cellene etter implantasjon i de subkutane regioner av immunsvikt nakne mus. Totalt 1 × 10
6 celler (venstre panel) eller 3 × 10
5 celler (høyre panel) ble subkutant injisert i begge flankene av immunodeficient hårløse mus på dag 10. Volumet av svulstene avledet fra K- og OSK-SW480-celler ble åpenbart høyere enn de av vekt-, M-, O- og S-SW480 celler for både antall injiserte celler. De røde linjene viser medianen tumorvolumet. ** P 0,01, NS. Ikke signifikant, Dunnetts test (med unntak av †: U-test)
tumorigenitet
in vivo
For å undersøke tumorgenisitet av de transduserte celler, subkutant vi transplantert 1 x 10
6 eller 3 x 10
5 celler i immundefekte hårløse mus i det dorsale område på begge sider, og da vi målte hyppighet og volumet av tumorer etter fire uker til 1 x 10
6-celler og åtte uker til 3 x 10
5-celler etter transplantasjon, henholdsvis (fig. 2B). En oppsummering av tumortilfeller er vist i tabell 1. K- og OSK-SW480-celler ble generert tumorer hos 100% av de steder, mens de øvrige linjer som genereres svulster i 75% og 25% av tilfellene for celletall på 1 × 10
6 og 3 × 10
5 celler, henholdsvis. Vi har observert en betydelig høyere volum av svulster i K- og OSK-SW480 celle-injiserte mus sammenlignet med de injisert med andre linjer, ved begge celle mengder, nemlig 1 x 10
6 og 3 x 10
5-celler (fig. 2B).
samlet utgjør disse dataene indikerer at OSK tilstrekkelig indusert alle tidligere rapportert CSC egenskapene vi undersøkte
in vitro Hotell og
in vivo
, mens ingen enkelt gen var tilstrekkelig til å indusere alle disse egenskapene. Vi utpekt cellene med CSC eiendommer i OSK-SW480 kulturer som induserte cscs (iCSCs).
utstrømning aktivitet for Hoechst33342
I tidligere rapporter [2], [10], [12 ], [23], [24], FCM ved hjelp Hoechst33342 merking med verapamil (VM), som er en ATP-bindende kassett (ABC) transporter inhibitor, var en effektiv måte å anrike ulike typer stamceller-lignende celler, inkludert cancerceller . I denne analysen, ble det ansett at stilk-lignende celler (såkalt Side Befolknings celler) var ikke merket av Hoechst33342 uten VM, men ble merket av Hoechst33342 med administrasjon av VM.
Vi har bekreftet eksistensen av 5 mikrogram /ml Hoechst33342-effluxing celler, som forsvant med samtidig administrering av 50 mikrometer av VM i M-SW480 kultur (fig. 3A). Vi setter en port hvor populasjonen ble inkludert, og betegnet cellene i porten i fravær av VM som «V0-celler» (fig. 3A, venstre panel), etterfulgt av en analyse av andre linjer. Antallet V0-celler signifikant økt i O- og OSK-SW480 kulturer (3,9% og 5,0%, respektivt) i forhold til M-SW480 kultur (2,6%) (fig. 3A, høyre panel). Spesielt, unike celler, som ble umerket ved Hoechst33342 selv med nærvær av 50 uM av VM, var tydelig i de OSK-SW480 kulturer. Vi kalles disse cellene som «V50-celler» (Fig. 3A, venstre panel). Behandling med 250 pM av VM resulterte i forsvinningen av cellene i porten, noe som indikerer at V50-celler var følsomme for 250 uM av VM (fig. 3B, venstre panel). Samlet utgjør disse data indikerte at vi fikk en ny samlecellepopulasjon. V50-celler med en svært potent dye-utstrømning aktivitet indusert i OSK-SW480 kulturer
(A) OSK-SW480 celler inkludert en populasjon av celler umerkede av 5 mikrogram /ml Hoechst33342 med samtidig administrering av 50 mikrometer av verapamil (VM). Vi utpekt cellene umerkede av Hoechst33342 uten VM og med 50 mikrometer av VM som V0-celler og V50-celler, henholdsvis. Det venstre panelet viser representative prikkplotter av merkede og umerkede celler på dag 10 etter transduksjon. Høyre panel viser resultatene av tre uavhengige forsøk. Den V0 undergruppe ble økt i O- og OSK-SW480 celler. V50-celler ble åpenbart sett i OSK-SW480 kulturer. De feilfelt indikerer SD (n = 3). * P 0,05, ** P 0,01, Dunnetts test. (B) Farg utstrømming aktivitet på dag 10 (venstre panel) og dag 28 (høyre panel) etter transduksjon. V50-celler forsvant under behandling med samtidig administrering av 250 mikrometer av VM selv i OSK-SW480 celler. Andelen av OSK-V50 celler ble redusert med tiden.
Bekreftelse med et annet tykktarmskreft cellelinje
For å bekrefte dagens resultater, vi undersøkte en annen tykktarmskreft cellelinje, DLD- 1, i noen eksperimenter, blant annet evalueringer av cellevekst
in vitro
, tumorigenitet
in vivo
og Hoechst33342 effluxing egenskaper (fig. S4). I DLD-1 celler, veksten av OSK-DLD-1 celler var lavere enn den vekt- (foreldre) og Mock-DLD-1 celler (p 0,01, n = 3) (Fig S4A.) . Den tumorigenicity av 1 × 10
5 celler var høyere i OSK-DLD-1 celler i forhold til vekt- og Mock-DLD-1 celler (Fig. S4B, Tabell S2). V50-celler ble også sett i OSK-DLD-en, men ikke i Mock-DLD-en, kulturer (Fig. S4C).
Samle iCSCs fra OSK-SW480
for å undersøke hvorvidt de CSC egenskaper som induseres i OSK-SW480 kulturer ble henført til V50-celler, sortert og vi analyserte V50-celler og ikke-V50-celler i nærvær av 50 uM av VM i OSK-SW480-celler, og V0- celler og ikke-V0-celler i fravær av VM og ikke-V50-celler i nærvær av 50 uM av VM i M-SW480 kulturer. Disse cellene ble kalt OSK-V50, OSK-nonV50, M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 hhv.
Etter sortering av en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) på dag 10, hele linjene ble deretter dyrket i 10 dager i DMEM inneholdende 10% FBS. De OSK-V50-celler oppviste morfologi lik den som er tydelig observert i OSK-SW480 celler på dag 10 (fig. 4A, Fig. S1D). I motsetning til dette OSK-nonV50 celler oppviste morfologi lik den for det M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 celler (Fig. 4A). Celleveksthastigheten til OSK-V50-celler var signifikant lavere enn for de andre linjer (P 0,01, n = 3) (figur 4B.), Som resulterer i redusert andel (~0.1%) av de V-50 celler hos 28 dager etter transduksjon under dagens kultur tilstand (fig. 3B, panel til høyre).
V50-celler i OSK-SW480 (OSK-V50) celler ble sortert etter FACS. Non-V0-, V0- og ikke-V50-celler i M-SW480 celler (M-nonV0, M-V0 og M-nonV50, henholdsvis) og ikke-V50-celler i OSK-SW480 celler (OSK-nonV50 ) ble også sorteres og anvendt som kontroller. Disse cellene ble deretter dyrket over alt. (A) De morfologier av celler dyrket i 10 dager etter sortering. Morfologi av OSK-V50 cellene var lik som utpreget observert i OSK-SW480 celler (fig. S1D, foret sirkel). I motsetning til dette, morfologi av OSK-nonV50 celler var lik den i M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 celler. Skala barer: 100 mikrometer. (B) celleproliferasjon
in vitro
. Totalt 3 × 10
5 celler dyrket i 14 til 18 dager etter sortering var seeded og telte 96 timer senere. Antall celler var signifikant lavere i de OSK-V50-celler enn det som i alle de andre linjer. De feilfelt indikerer SD (n = 3). ** P 0,01, Scheff test. (C) tumorgenisitet av cellene i immundefekte mus. Totalt 3 × 10
5 eller 1 × 10
5 celler ble subkutant injisert i immunodeficient hårløse mus på dag 18 etter sortering. Tumorvolumet og hyppighet ble målt åtte uker etter injeksjon. Bare de OSK-V50-celler generert åpenbare tumorer både de injiserte celle tall, mens ingen tumorer ble oppnådd fra M-nonV0, M-V0, M-nonV50 og OSK-nonV50 celler. Forekomsten av tumordannelse ved OSK-V50 celler var 4/4 for begge injisert celle tall. De røde linjene viser medianen tumorvolumet.
tumorigenicity av OSK-V50 celler i immunodeficient musene var tydeligvis høyere i forhold til størrelse og forekomst av svulster enn for de andre cellelinjer, inkludert OSK-nonV50 celler (fig. 4C).
samlet utgjør disse dataene indikerer at OSK-V50 celler utstilt CSC egenskaper, men at OSK-nonV50 celler ikke, noe som indikerer at CSC egenskaper indusert i OSK-SW480 celler var knyttet til V50-cellepopulasjon.
Kolon avstamning differensiering av OSK-V50 celler
in vitro
OSK-V50 celler samt M- V0 celler var positive for CDX2, en mester regulator av intestinal epitel differensiering [25], og CK20, en colonic differensiering markør [26] ved farging (fig. 5A). Dermed OSK-V50 celler opprettholdt tarm avstamning fenotype og differensiering evne
in vitro plakater (Fig. 5A).
(A) Immunocytochemistry for CDX2 og CK20 protein. OSK-V50-celler var positive for CDX2 og CK20, samt M-V0 celler. Cellene ble kontra med Hoechst33342. Skala barer: 100 mikrometer. (B) Et fenotypisk mangfold i morfologi og bevegelighet av derivater av OSK-V50-celler. Fotografier er tid-lapse bilder av M-V0 og OSK-V50 celler. De sorterte celler ble deretter dyrket i fem dager, og deretter observeres hver sjette time til 42 timer. Time-lapse bildebehandling avslørte at det var en høyere mangfold både i morfologi og mobilitet i OSK-V50 celler (nedre panel) i forhold til M-V0 celler (øvre panel). Original forstørrelse, × 20. Filmer av M-V0 og OSK-V50 celler er vist i videoen S1 og Video S2, henholdsvis.
fenotypiske mangfoldet i derivater av OSK-V50
Generering av heterogenitet i kreftvev er en av de bemerkelsesverdige CSC eiendommer [1] – [3]. For å undersøke denne egenskapen i våre isolerte celler, vi senere analysert 23 dager etter sortering (Fig. S5). De OSK-V50-celler, i motsetning til alle de andre celler, kan produsere V50-celler og så vel som diverse forskjellige undergrupper av celler i forhold til graden av Hoechst-effluxing funksjon (Fig. S5).
Vi neste utførte
in vitro
time-lapse avbildning av M-V0 og OSK-V50 celler for 42 timer (fig. 5B, Methods S1). M-V0 celler besto av små rund og spindel-formet celler, og dannet kolonier bestående av celler med tydelige kanter. De OSK-V50 celler besto av celler med ulike morfologi, for eksempel polygonal-, runde-, cuboidal-, spindle- og flat celler, som endret deres morfologi med tiden, og dannet flate monterte kolonier bestående av celler med uklare kanter . Videre OSK-V50 celler viste høyere celle mobilitet enn M-V0 celler (Fig. 5B, videoer S1 og S2). Disse resultatene tyder på at OSK-V50 celler kan produsere et høyere mangfold i form av morfologi og mobilitet i forhold til M-V0 celler.
Kolon avstamning differensiering av OSK-V50 celler
in vivo
Vi neste histologisk vurdert de svulster avledet fra M-SW480 og OSK-V50 celler i immunodeficient mus (fig. 6).
