Abstract
uttrykk for gangliosider er ofte assosiert med kreft progresjon. Sialyltransferaser har fått mye oppmerksomhet i form av sitt forhold til kreft, fordi de modulere uttrykk for gangliosider. Vi har tidligere vist at GD1a produksjonen var høy i kastreringsresistent prostatakreft-cellelinjer, PC3 og DU145, hovedsakelig på grunn av deres høye ekspresjon av β-galaktosid α2,3-sialyltransferase (ST3Gal) II (ikke ST3Gal I), og ekspresjon av begge ST3Gals ble regulert av NF-kB, hovedsakelig ved relB. Vi her viser at GD1a ble produsert i overflod i kreft vevsprøver fra menneskelige pasienter med hormonfølsom prostatakreft samt kastrering-resistent prostatakreft. Ekspresjon av ST3Gal II ble konstitutivt aktivert i kastreringsresistent prostatakreftcellelinjer, PC3 og DU145, på grunn av den hypometylering av CpG øy i sin promotor. Men i androgen-utarmet LNCaP-celler, en hormonsensitiv prostatakreft-cellelinje, ble ekspresjonen av ST3Gal II dempet på grunn av hypermethylation av promotorområdet. Ekspresjonen av ST3Gal II i LNCaP-celler økte med testosteronbehandling på grunn av demetylering av CPG-områder. Dette testosteron-avhengige ST3Gal II-ekspresjon ble undertrykt av relB siRNA, noe som indikerer at relB aktivert ST3Gal II transkripsjon i den testosteron-indusert demetylerte promoter. Derfor, i hormonsensitiv prostatakreft, produksjon av GD1a kan reguleres ved androgen. Dette er den første rapporten som viser at uttrykket av en sialyltransferase er transcriptionally regulert av androgen-avhengige demetylering av CPG nettsteder i sin genet promoter
Citation. Hatano K, Miyamoto Y, Mori M, Nimura K, Nakai Y, Nonomura N, et al. (2012) Androgen-regulert transkripsjonskontroll av sialyltransferaser i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31234. doi: 10,1371 /journal.pone.0031234
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 10 august 2011; Godkjent: 04.01.2012; Publisert: 8. februar 2012 |
Copyright: © 2012 Hatano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Program for fremme av grunnleggende studier i helsefag av National Institute of Biomedical Innovation (Prosjekt ID: 10-03) og ved den nordlige Osaka (Saito) Biomedical kunnskapsbasert Cluster Creation Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange kreftcellene har avvikende sialyserte glykaner på overflaten. Disse avvikende molekyler kan være involvert i kreft progresjon [1] – [3], men sialyserte glykaner også spille flere roller i friske organismer og ikke-kreftceller, inkludert embryogenese, regulering av immunresponsen og virus binding som fører til infeksjoner [4 ], [5]. Sialyserte glykaner er syntetisert av sialyltransferaser, som legger sialinsyrer til oligosakkarid-kjeder av glykoproteiner og glykosfingolipider (GSLs) [5]. Hittil har 20 sialyltransferase gener blitt klonet, og de respektive enzymer har blitt gruppert i fire familier i henhold til karbohydrat sammenhengene de katalyserer: P-galactoside α2,3-sialyltransferaser (ST3Gal I-VI), β-galactoside α2,6- sialyltransferaser (ST6Gal I og II), GalNAc α2,6-sialyltransferaser (ST6GalNAc I-VI), og α2,8-sialyltransferaser (ST8Sia I-VI) [6]. I løpet av neoplastisk transformasjon og progresjon av kreft, er aktiviteten av sialyltransferaser ofte forandret, og følgelig, kreftcellene har mer tungt sialylert glykaner på sin overflate enn ikke-cancerceller [1], [2], [7].
GSLs som inneholder sialinsyrer er kjent som gangliosider og blir uttrykt ved høye nivåer i forskjellige kreftceller [3]. De gangliosider som er tilstede på cancerceller brukes som biomarkører eller behandlings mål, og de anrikede gangliosidene er forskjellige cancercelletyper [8] – [10]. Vi har fokusert på GD1a syntese i kreftceller fordi GD1a har flere biologiske handlinger som fremmer kreft progresjon. For eksempel, svært metastatiske kreftceller har rikelig GD1a, og GD1a er involvert i kreft celle adhesjon til endotelceller under metastase [11]. Den GD1a skur av tumorceller i svulsten mikromiljøet fremmer angiogenese og forbedrer vekstfaktor signalering ved å øke dimerisering av vekstfaktor-reseptorer [12] – [15]. Derfor kan GD1a være involvert i kreftcellevekst og metastase. Videre er dette gangliosid en reseptor for Sendai-virus [16], og inaktivert Sendai-viruspartikler [hemaggluinerende virus fra Japan konvolutt (HVJ-E)] indusere apoptose i flere humane kreftceller med anriket GD1a på deres overflate [17]. Derfor kan GD1a være en attraktiv molekyl fra synspunktet til kreftterapi
GD1a er blitt rapportert å være rikelig produsert i kastreringsresistent prostatacancerceller [17] -. [20], og vi tidligere har demonstrert at kastrering -resistente prostata kreft celler ble effektivt utryddet av HVJ-E [17]. GD1a syntetiseres fra GM1 ved ST3Gal I og II. Den Km verdien av ST3Gal II for GM1 er mindre enn den for ST3Gal I; således, ST3Gal II bidrar fortrinnsvis til GD1a syntese [6], [21] – [24]. Vi har nylig vist at rikelig produksjon av GD1a i kastreringsresistent prostatacancerceller er korrelert med høye nivåer av ST3Gal II uttrykk [20], og som ST3Gal II ekspresjon blir regulert av NF-kB, hovedsakelig ved relB, i kastrering resistent prostatakreft celler [20]. Selv relB nivåene var lik i en hormonfølsom prostatakreft cellelinje (LNCaP) og kastreringsresistent prostatakreft celler, og selv om ST3Gal jeg ble uttrykt i LNCaP celler [20], et uttrykk for ST3Gal II ble stille i LNCaP celler, og GD1a var mye mindre rikelig i LNCaP-celler [17], [20]
Det har hittil ikke vært publisert analyse av de gangliosid-nivåene i kreftvev prøver fra humane pasienter med prostatakreft.; ble imidlertid en endogen immunrespons mot GD1a observert hos pasienter med hormonfølsom prostatakreft, men ikke hos friske kontroller [19], og dermed tyder på at GD1a er rikelig produseres i hormonfølsom prostatakreft. Prostatakreft viser androgen-avhengige vekst og progresjon [25]; Derfor kan androgener også regulere GD1a produksjon som er relatert til kreft progresjon. Men det har også vært noen publiserte studier som har undersøkt hormonelle kontroll av sialylert glykan syntese.
Formålet med denne studien var å finne ut om GD1a er produsert i overflod i hormonfølsom prostatakreft hos pasienter og til analysere transkripsjonen kontroll av sialyltransferaser, spesielt ST3Gal II, som er nødvendig for syntesen av GD1a i hormonfølsom prostatakreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter for bruk av deres vevsprøver, og bruken av slike prøver ble godkjent av Osaka University Hospital Institutional Review Board (Osaka, Japan).
Cell kultur
Kastrering -resistente humane prostatacancercellelinjer, PC3 og DU145, og en hormon-sensitiv human prostatacancercellelinje, LnCap klon FGC, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). En normal menneskelig prostata epitelceller, PNT2, ble kjøpt fra European Collection of Animal cellekulturer (Porton Down, UK). PC3-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle F12 medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), og DU145, LnCap, og PNT2 celler ble holdt i RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2.
Reagenser og antistoffer
Trichostatin A (TSA) og 5-aza- 2′-deoksycytidin (5-azadC) ble kjøpt fra Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan). Testosteron ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan). Bicalutamide ble kjøpt fra Enzo miljø- og biovitenskap (Plymouth Meeting, PA). Restriksjonsenzymer,
Msp
jeg og
Hpa
II, ble kjøpt fra New England Biolabs (Ipswich, MA). Anti-human relB (C1E4) ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-human β-aktin (AC-15) ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK).
Real-time kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av en RNeasy RNA isolering kit (Qiagen, Valencia, CA). CDNA ble syntetisert ved hjelp av en High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Real-time kvantitativ PCR ble utført med et Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR system under følgende forhold: 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Blandinger av prober og primerpar som er spesifikke for human ST3Gal I (Hs00161688_m1), ST3Gal II (Hs00199480_m1), ST3Gal VI (Hs00196086_m1), relB (Hs00232399_m1), og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (Hs99999905_m1) ble kjøpt fra Applied Biosystems . De relative ekspresjonsnivåer ble beregnet fra en standardkurve oppnådd ved bruk av log fortynninger av cDNA inneholdende genet av interesse, og verdiene ble normalisert til GAPDH, en intern kontroll.
Evaluering med et reportergen
gener ble transfektert inn i celler sammen med et luciferase reporter konstruksjon som drives av en NF-kB-bindingssete, rela, og relB (NF-kB luciferasereportergenet; BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA), ved bruk Fugene HD-reagens (Roche, Basel, Sveits). Luciferase-aktiviteten ble målt ved hjelp av den dual-luciferase-analysesystemet (Promega, Madison, WI).
Western blot-analyse
Cellene ble høstet og lysert med RIPA-lysebuffer. Proteinprøver ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese. De separerte proteiner ble overført til polyvinylidenfluorid membraner, da membranene ble blokkert med 5% skummet melk og inkubert over natten ved 4 ° C med anti-relB (1:500) eller anti-β-aktin (1:2000) antistoffer. Membranene ble vasket og merket med en 1:2000 fortynning av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ved romtemperatur i ca. 1 time. Påvisning av chemiluminescence ble utført i henhold til ECL brukerhåndboken (Amersham, Buckinghamshire, UK). Bilder ble tatt med Imagequant LAS 4000mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), og kvantifisering av Western blot signaler ble utført ved densitometri med Imagequant TL programvare (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
RNA interferens eksperimenter
følgende dobbel tråd stealth liten interfering RNA (siRNA) oligonukleotider og egge RNA ble kjøpt fra Invitrogen (Tokyo, Japan): siRNA oligonukleotider mot relB var (forstand) 5′-UCUUCAGGGACCCAGCGUUGUAGGG-3 «og (antisense) 5 «-CCCUACAACGCUGGGUCCCUGAAGA-3». Transfections ble utført med lipofektamin RNAiMAX (Invitrogen, Tokyo, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner.
Metylering spesifikke PCR (MSP) analyse
DNA metylering ble undersøkt på CpG øyene med en MSP analyse som tidligere rapportert [26]. For MSP analyse, ble genomisk DNA ekstrahert fra cellene og renset ved anvendelse av QIAamp DNA-kit (Qiagen, Valencia, CA). Genomisk DNA ble underkastet bisulfitt konvertering ved hjelp av en EZ-DNA Metylering Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Basert på sekvensen av ST3Gal II p1 promoter og ST3Gal jeg p1 promoter, denaturert spesifikke primere og unmethylated-spesifikke primere ble utformet ved hjelp av programversjonen Methyl Primer Express Software 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, California). Den ST3Gal II-metylerte-spesifikke primere ble forstand, 5′-TAGGGCGTAGCGGTTTTATC-3 «, antisense, 5′-ACTAACCGAAAACGCCTCTC-3′, og de ST3Gal II-unmethylated-spesifikke primere ble forstand, 5»-GGTTAGGGTGTAGTGGTTTTATT-3 «, og antisense, 5»-CACACTAACCAAAAACACCTCTC-3 «. Den ST3Gal II 5′-ikke-translaterte området -659 til -495 ble valgt for MSP analyse. Den ST3Gal I-metylert-spesifikke primere ble forstand, 5»-TAGGGTCGGTCGTAGTGTTC-3 «, antisense, 5′-ACCGATCCCCTACTAACGAC-3′, og de ST3Gal I-unmethylated-spesifikke primere ble forstand, 5»-TTAGGGTTGGTTGTAGTGTTT-3 «, og antisense, 5»-AACCAATCCCCTACTAACAAC-3 «. Den ST3Gal I 5′-ikke-translaterte området -697 til -535 ble valgt for MSP analyse. Glutation S-transferase-gen π (GSTP1) metylert-spesifikke primere ble forstand, 5»-AGTTGCGCGGCGATTTC-3 «, antisense, 5′-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3», og de GSTP1-unmethylated-spesifikke primere ble forstand, 5 « -GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3 «, og antisense, 5′-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3», som tidligere beskrevet [27]. Renset genomisk DNA behandlet med natriumbisulfitt ble amplifisert ved PCR som følger: 2 minutter ved 95 ° C for denaturering, 35 amplifikasjonssykluser (95 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 s) . Humant genomisk DNA eller enzymatisk denaturert humant genomisk DNA (Chemicon International, Temecula, CA) ble bisulfitt-konvertert og anvendt som en positiv kontroll for unmethylated eller denaturert gener. Fraværet av en DNA-templat tjente som en negativ kontroll. Produktene ble analysert i to% agarosegel farget med etidiumbromid.
Isolering av sure GSLs fra prostata kreft vev
Pasienter diagnostisert med prostatakreft hadde gjennomgått prostata biopsi eller reseksjon av svulster ved Osaka University Hospital (Osaka, Japan). Primære kreft vevsprøver ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. De fleste av de eksperimentelle prosedyrer er rapportert i tidligere [28]. I korte trekk, ble prøvene homogenisert i kloroform /metanol (2:01, v /v), og inkubert ved romtemperatur i 2 timer med 30 s med sonikering hvert 30 min. Metanol ble deretter tilsatt til prøvene, som ble sentrifugert ved 1800 x g i 15 min. Pelletene ble homogenisert i kloroform /metanol /vann (1:2:0.8, v /v /v), inkubert ved romtemperatur i 2 timer, og deretter sentrifugert ved 1800 x g i 15 min. Begge ekstrakter ble slått sammen og inndampet til tørrhet i vakuum konsentratoren. Residuet ble oppløst i kloroform /metanol /vann (30:60:8) og fraksjonert ved DEAE-Sephadex A25 kolonnekromatografi for å skille nøytrale GSLs fra sure GSLs.
Analyse av sure GSLs
strukturene av de sure GSLs ble analysert ved enzymatisk frigjøring av karbohydratkomponentene, fluorescerende merking med aminopyridin, og todimensjonal kartlegging etterfulgt av massespektrometri. De fleste av eksperimentelle prosedyrer er rapportert i tidligere [28]. I korte trekk ble de sure GSLs hentet fra primær kreft vevsprøver eller kulturkreftceller og fordøyd med rekombinant endoglycoceramidase II fra
Rhodococcus
sp. (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). De frigitte oligosaccharider ble merket med 2-aminopyridin (2-AP) og separert på et Shimadzu LC-20A HPLC-system (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) utstyrt med en Waters 2475 fluorescensdetektor. Normal-fase HPLC ble utført på en TSK gel Amide-80 kolonne (0,2 x 25 cm, Tosoh, Tokyo, Japan). Molekylstørrelsen av hver pyridylaminated (PA) -oligosaccharide er gitt i glukoseenheter (Gu) basert på Elueringstidene for PA-isomaltooligosaccharides. Reversert-fase HPLC ble utført på en TSK-gel ODS 80Ts-kolonne (0,2 x 15 cm, Tosoh). Oppholdstiden i hver PA-oligosakkarid er gitt i glukose-enheter basert på Elueringstidene for PA-isomaltooligosaccharides. Derfor atferd av en gitt forbindelse i disse to kolonnene gir et unikt sett av Gu (amid) og Gu (ODS) verdier, som tilsvarer koordinatene på en 2-D kart. PA-oligosakkarider ble analysert ved LC /MS ESI /MS. Standard PA-oligosakkarider, PA-GM1 og PA-GD1a, ble kjøpt fra Takara Bio, og PA-LST-en og PA-SPG ble isolert som i vår forrige undersøkelse [28].
Statistiske analyser
resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE). Den tosidige uparede Students
t
-test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellene mellom gruppene. Sannsynlighets verdier av P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av Statview 5.0 programmet (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
Analyser av gangliosider i kreft vevsprøver fra pasienter med prostatakreft
Vi har tidligere demonstrert at GD1a var rik på kastreringsresistent prostatacancercellelinjer (inkludert PC3 og DU145), mens det var knapt synlig i en hormonsensitiv prostatakreft-cellelinje (LNCAP) og en normal prostata epitelcellelinje (PNT2) [17]. Vi undersøkte nivåene av gangliosider i prøver av kreftvev fra åtte pasienter med prostatakreft, inkludert seks pasienter med fremskreden hormonsensitive prostatacancer og to pasienter med kastrering-motstandsdyktig prostatakreft (tabell 1). De sure GSLs hentet fra kreft vevsprøver fra disse pasientene ble undersøkt ved hjelp av HPLC (Fig. 1). Både GM3 og GD3 er vanlige gangliosider uttrykkes i begge prostatakreftceller og normale prostata epitelceller [18], [19]. GD1a ble produsert i kreft vevsprøver fra både pasienter med hormonsensitiv prostatakreft og de med kastreringsresistent prostatakreft (Fig. 1A, 1B). I alle pasientens prøver (hormon-sensitive og kastreringsresistent), var gjennomsnittlig andel av totale sure GSLs med GD1a var 8,1%, og ingen statistisk signifikant forskjell sammenlignet med verdien fra kastreringsresistent prostatakreft cellelinjer ( PC3 og DU145) (fig. 1C).
(A) de sure GSLs fra kreft vevsprøver fra åtte pasienter med prostatakreft, inkludert seks pasienter med avansert hormonfølsom prostatakreft og to pasienter med castration- motstandsdyktig prostatakreft ble separert ved molekylstørrelsen av oligosakkaridene ved hjelp av normal-fase HPLC. Prøver fra en pasient (betegnet Tilfelle 1) ble tatt fra både prostata og skjelettmetastaser for evaluering. (B) De sure GSLs i de primære kreft vevsprøver ble separert ved molekylstørrelsen av oligosakkaridene ved hjelp av HPLC. Mengden av GD1a er presentert som en prosentandel av den totale sure GSLs med GD1a. (C) De sure GSLs i dyrkede prostatakreftceller ble separert ved molekylstørrelsen av oligosakkaridene ved hjelp av HPLC. Analysen ble utført i triplikat, og et middel ± S.E. GD1a nivåer er vist som forholdet for de totale sure GSLs i cellelinjer. Gjennomsnitt ± S.E. GD1a nivået ble også presentert som forholdet til de totale sure GSLs i pasientenes prøver (HS + CR) angitt i figur 1B. (HS, hormon-sensitive, CR, kastrering-resistente F fri sukker)
Androgen avhengig regulering av ST3Gal II i LNCaP celler
Syntesen av. GD1a er i hovedsak regulert av ST3Gal II, og ekspresjonen av ST3Gal II er regulert av NF-kB, hovedsakelig ved relB, i kastrerings-motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjer [20]. Mengdene av kjernefysisk relB var lik i hormonfølsom LNCaP celler og kastreringsresistent PC3 og DU145 cellene [20], men et uttrykk for ST3Gal II var lavere i LNCaP celler enn i PC3 og DU145 cellene [20].
LNCaP cellekulturmedium er rutinemessig supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). En fersk rapport viser at media supplert med 10% FBS inneholder kun kastrere nivåer av testosteron [29]; i motsetning hormonfølsom prostatakreft av ubehandlede pasienter vanligvis vokser i et miljø som inneholder testosteron
in vivo
. For å analysere den transkripsjonelle kontroll av ST3Gal II i hormonsensitiv prostatakreft, undersøkte vi hvorvidt ekspresjonen av ST3Gal II ble styrt av testosteron i LNCaP-celler. LNCaP-celler ble behandlet med testosteron (0-1000 nM), og ble inkubert i 120 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser viste at ekspresjon av ST3Gal II var høyere i LNCaP-celler ble behandlet med testosteron enn i LNCaP-celler som ikke var (fig. 2A). Videre ble induksjon av ST3Gal II etter testosteronbehandling undertrykkes av et anti-androgen, bikalutamid, i LNCaP-celler (Fig. 2B). For å sikre at det ikke var noen androgener som er tilstede i mediene, ble LNCaP-celler inkubert i trekull-strippet serum i 48 timer. Basalnivået ST3Gal II var ikke signifikant forskjellig mellom 10% FBS- og kull strippet serum-supplert LNCaP celler (Fig. 2C). De LNCaP-celler ble deretter behandlet med 100 nM testosteron, og tidsforløpet av uttrykket etter testosteronbehandling ble evaluert. Ekspresjon av ST3Gal II ble øket 48 timer etter behandling med testosteron, og forble forhøyet i mer enn 120 timer i LNCaP-celler (Fig. 2C). For å evaluere den NF-kB aktivitet etter testosteronbehandling, ble LNCaP-celler transfektert med et NF-kB luciferase reporter-konstruksjonen og inkuberes i 120 timer med eller uten testosteron. NF-kB aktivitet var ikke signifikant forskjellig i de testosteron-behandlede LNCaP-celler sammenlignet med celler dyrket uten testosteron (figur S1). I PC3 og PNT2 celler, ble ingen signifikant økning i ekspresjonen av ST3Gal II detektert uavhengig av om cellene dyrket med eller uten testosteron (fig. 2A). Ekspresjonen av ST3Gal II ikke øke etter testosteronbehandling i PC3-celler på ethvert tidspunkt opp til 120 timer (figur S2). Basert på disse funnene, hypotese vi at media med kastrering nivåer av testosteron førte til epigenetisk stanse av ST3Gal, et gen som kreves for syntesen av GD1a, i LNCaP-celler.
(A) LNCaP, PC3, og PNT2 celler ble behandlet med eller uten testosteron (0-1000 nM) i 120 timer, ved refeeding med friskt medium med eller uten testosteron i 72 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser av ST3Gal II mRNA ble utført, og uttrykket nivåer er rapportert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3) av den ganger forskjell i mRNA etter normalisering verdiene til ekspresjonsnivået av ubehandlede celler. ** P 0,001. (B) LNCaP-celler ble behandlet med eller uten testosteron (0-100 nM), og samtidig med eller uten 10 mM bikalutamid i 120 timer, ved refeeding med friskt medium med eller uten testosteron og /eller bikalutamid ved 72 timer. Den kvantitative real-time PCR analyser for ST3Gal II ble utført, og uttrykket nivåer er rapportert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3) av den ganger forskjell i mRNA etter normalisering verdiene til ekspresjonsnivået av ubehandlede celler. ** P 0,001. (C) LNCaP-celler ble inkubert på trekull-strippet serum (CSS) i 48 timer og deretter behandlet med 100 nM testosteron i de angitte tidsrom. Den kvantitative real-time PCR analyser for ST3Gal II ble utført, og uttrykket nivåer er rapportert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3) av den ganger forskjell i mRNA etter normalisering verdiene til ekspresjonsnivået av ubehandlede celler. * P 0,05, ** P. 0,001
epigenetisk regulering av ST3Gal II i LNCaP celler
Deretter undersøkte vi om ST3Gal II ble epigenetiske regulert i LNCaP celler. De LNCaP-celler ble behandlet med et DNA-metyltransferase-inhibitor, 5-azadC, og inkubert i 120 timer (fig. 3A). Den kvantitative real-time PCR-analyser viste at uttrykket av ST3Gal II ble oppregulert etter 5-azadC behandling. Etter dette forsøk ble LNCaP-celler ble behandlet med en histondeacetylase-inhibitor, TSA, og inkubert i (3b Fig.) I 48 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser viste at uttrykket av ST3Gal II ble oppregulert etter TSA behandling. Disse resultatene tyder på at epigenetisk regulering, inkludert DNA metylering og histonmodifikasjonene, kan være involvert i undertrykkelsen av ST3Gal II genet i LNCaP celler. I videre forsøk, fokuserte vi på DNA metylering ved CpG øy i ST3Gal II promoter.
(A) LNCaP celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-azadC) (0-50 pM) i 120 timer, ved refeeding med friskt medium med eller uten 5-azadC ved 72 timer. Den kvantitative real-time PCR analyser for ST3Gal II ble utført, og uttrykket nivåer er rapportert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3) av den ganger forskjell i mRNA etter normalisering verdiene til ekspresjonsnivået av ubehandlede celler. * P 0,05. (B) LNCaP-celler ble behandlet med 5 uM trichostatin A (TSA) i 48 timer. Den kvantitative real-time PCR analyser for ST3Gal II ble utført, og uttrykket nivåer er rapportert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3) av den ganger forskjell i mRNA etter normalisering verdiene til ekspresjonsnivået av ubehandlede celler. * P. 0,05
Kontroll av DNA metylering ved CpG øy i ST3Gal II genet promoter i prostatakreftceller
genet for humant ST3Gal II har blitt klonet, og p1 promoter er angivelig nødvendig for aktiv transkripsjon av dette genet i prostatakreftceller [30]. De ST3Gal II-promotorsekvenser er offentlig tilgjengelige, og vi identifisert en CpG øy i ST3Gal II p1-promotoren ved bruk av metyl Primer Express programvare-programmet, versjon 1,0 (Applied Biosystems, Foster City, California) (Fig. 4A). Vi undersøkte metylering ved CpG i ST3Gal II arrangøren med MSP analyse. Genomisk DNA ble isolert fra LNCaP-celler ble behandlet med eller uten 5-azadC i 120 timer, som deretter ble behandlet med natriumbisulfitt, og DNA ble amplifisert med primere som er spesifikke for unmethylated eller det metylerte ST3Gal II-promoter (fig. 4B). I LNCaP celler, CpG øy i ST3Gal II arrangøren, som opprinnelig ble hypermethylated ble metylert ved 5-azadC behandling. Deretter undersøkte vi effekten av testosteron på metylering ved CpG i ST3Gal II-promotoren i LNCaP-celler ved hjelp av en MSP-analyse (Fig. 4C). I PC3 og DU145 celler, CpG island av ST3Gal II arrangøren var konstitutivt hypomethylated. I LNCaP-celler ble CpG øy av den ST3Gal II-promotoren hypermethylated i fravær av testosteron og demetylert i nærvær av testosteron. Videre ble demetylering ved CpG øya i ST3Gal II-promotoren etter testosteronbehandling undertrykkes av et anti-androgen, bikalutamid, i LNCaP-celler (fig. 4D).
(A) CpG øy i ST3Gal II p1 promoter og plassering av MSP primere. De vertikale linjene representerer CpG nettsider og TSS representerer transkripsjonsstartsetet. (B-D) MSP analyser av CpG øya ST3Gal II. DNA ble isolert fra LNCaP-celler ble behandlet med 5-azadC (0-50 pM) i 120 timer (B), kastrerings-motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjer (PC3 og DU145) eller LNCaP-celler ble behandlet med eller uten 100 nM testosteron i 120 timer ( C) eller LNCaP-celler ble behandlet med eller uten 100 nM testosteron samtidig med eller uten 10 mM bikalutamid i 120 timer (D). Deretter ble DNAet behandlet med natriumbisulfitt, og endelig amplifisert med primere som er spesifikke for unmethylated (USP) eller metylert (MSP) form av CpG øya i ST3Gal II-promotoren (M, metylert kontroll, UA, unmethylated kontroll A; UB, unmethylated kontroll B). De MSP Analysene ble gjentatt 3 ganger med samme resultat, og en representant bildet vises i tallene.
Vi undersøkte også om global DNA demetylering er under androgen-avhengige kontroll i LNCaP celler. Vi undersøkte samlede restriksjonsmønstre
Msp
I- eller
Hpa
II-fordøyd genomisk DNA. Disse enzymene er isoschizomers som gjenkjenner target-sekvensen 5′-CCGG-3 «, men aktiviteten av
Hpa
II inhiberes av metylering av cytosin det indre av denne sekvens. De genomiske DNA isolert form LNCaP celler behandlet med eller uten testosteron ble spaltet ved hjelp av
Msp
jeg eller
Hpa
II (figur S3A). Testosteronbehandling har ikke i stor grad påvirke fordøyelsen mønsteret
Hpa
II-behandlede genomisk DNA fra LNCaP-celler, noe som indikerer at den globale DNA-demetylering i LNCaP-celler var ikke i henhold til androgen-avhengige kontroll. Vi undersøkte CpG øya GSTP1, som er rapportert å være hypermethylated under prostata kreftutvikling og også i LNCaP celler [27]. Basert på MSP analyse, gjorde testosteronbehandling ikke påvirke metylering av GSTP1 i LNCaP celler (Figur S3b). Således kan androgen-avhengig styring av DNA demetylering fremkalles fortrinnsvis ved CpG øya i ST3Gal II-genpromoteren i LNCaP-celler.
androgen-avhengige og epigenetisk regulering av ST3Gal I i LNCaP-celler
Selv om GD1a syntetiseres fra GM1 hovedsakelig av ST3Gal II, ST3Gal i kan også bidra til syntese av GD1a [6], [21] – [24]. Vi har tidligere rapportert at ST3Gal jeg ble uttrykt i LNCaP celler, mens uttrykket av ST3Gal II ble stille [20]. Derfor kan regulering av ST3Gal I transkripsjon være forskjellig fra den til ST3Gal II. Vi deretter undersøkt hvorvidt ekspresjonen av ST3Gal I, som ST3Gal II, ble kontrollert av testosteron i LNCaP-celler. I dette eksperiment ble LNCaP-celler ble behandlet med testosteron og inkubert i 120 timer. Den kvantitative real-time PCR-analyser viste at testosteron behandling resulterte i økt ekspresjon av ST3Gal I i LNCaP-celler (fig. 5A), skjønt ekspresjon av ST3Gal VI, den sialyltransferase som kreves for syntesen av sialyl paragloboside, ikke ble indusert ved testosteronbehandling (figur S4). Videre ble den testosteron-medierte induksjon av ST3Gal I i LNCaP-celler undertrykkes av bikalutamid (Fig. 5B). For å sikre at det ikke var noen androgener til stede i cellekulturmedier, ble LNCaP-celler inkubert i trekull-strippet serum i 48 timer. Basalnivået ST3Gal jeg var ikke signifikant forskjellig mellom de LNCaP celler dyrket med 10% FBS og trekull-strippet serum (Fig. 5C). Deretter ble LNCaP-celler ble behandlet med 100 nM testosteron, og tidsforløpet av endringene følgende testosteronbehandling ble evaluert. Ekspresjonen av ST3Gal I økt 72 timer etter behandling med testosteron og forble forhøyet i mer enn 120 timer i LNCaP-celler (fig. 5C). I PC3 og PNT2 celler, ingen signifikant økning i ekspresjonen av ST3Gal I ble påvist etter behandling med testosteron (figur S5).
(A) LNCaP-celler ble behandlet med eller uten testosteron (0-1000 nM) for 120 h, ved refeeding med friskt medium med eller uten testosteron i 72 timer. * P 0,05.
