Abstract
I denne studien undersøkte vi uttrykket av osteopontin (OPN), αvβ3 og Pim-en i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og undersøkt de potensielle kliniske implikasjoner av deres uttrykk mønstre i NSCLC. Immunhistokjemiske analyser ble anvendt for å undersøke protein ekspresjon av OPN, αvβ3 og Pim-1 i 208 NSCLC-prøvene og deres tilstøtende eksemplarer normale lungevevet. Statistiske analyser ble utført for å evaluere forholdet mellom OPN, αvβ3 og Pim-1 uttrykk mønstre, og deres tilknytning til de kliniske-patologiske parametere av NSCLC pasienter. I NSCLC vev, de positive tallene for OPN, αvβ3 og Pim-1 uttrykk var 67,8% (141/208), 76,0% (158/208) og 58,7% (122/208), henholdsvis. Men i de tilstøtende normale lungevev, de positive tallene for OPN, αvβ3 og Pim-1 var 20,2% (42/208), 24,0% (50/208) og 14,9% (31/208), henholdsvis. Forskjellene i de positive ekspresjonshastigheter av OPN, αvβ3 og Pim-en mellom NSCLCs og de tilstøtende normale lungevev var alle signifikante (
P
0,01). I tillegg ble det positivt uttrykk for OPN, αvβ3 og Pim-1 i NSCLCs forbundet med en økning i patologisk klasse, lymfeknutemetastase og avansert klinisk stadium (all
P
0,01). Videre assosiasjoner mellom uttrykket av OPN og αvβ3, OPN og Pim-en, og αvβ3 og Pim-en ble også observert i vår NSCLC kohort (alle
P
0,01). De OPN, αvβ3 og Pim-1-proteiner er ofte overexpressed i NSCLC og er forbundet med noen clinicopathologic variabler som er av kjent prognostisk betydning i NSCLC, noe som tyder på at de kan spille en viktig rolle i utvikling og /eller progresjon av NSCLC.
Citation: Jin Y, Tong Dy, Chen Jn, Feng Zy, Yang Jy, Shao Ck, et al. (2012) Overuttrykte osteopontin, αvβ3 og Pim-en Associated med prognostisk Viktige Clinicopathologic Variabler i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (10): e48575. doi: 10,1371 /journal.pone.0048575
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia
mottatt: 29 mars 2012; Godkjent: 27 september 2012; Publisert: 31 oktober 2012
Copyright: © 2012 Jin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Primære bronchogenic karsinomer i lunge har høyest dødelighet frekvensen av noen ondartet svulst i verden, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 85% av primærlungekrefttilfellene. De fleste NSCLC pasienter er klinisk diagnostisert i mer avanserte stadier, og har en svært lav 5-års overlevelse [1]. Således, tidlig diagnose og tidlig behandling er særlig viktig for å forbedre overlevelsesraten. Det er allment akseptert at ulike patogene faktorer er involvert i utviklingen av NSCLC.
osteopontin (OPN) er et multifunksjonelt skilles fosforylert glykoprotein som fremmer celle chemotaxis, adhesjon og migrasjon. Disse prosessene formidle invasjon og metastase av tumorceller og er forbundet med forekomsten, utvikling, metastase og prognose av en rekke krefttyper [2], [3], [4]. Nylige studier har indikert at OPN er involvert i NSCLC progresjon og metastase gjennom dets interaksjon med αvβ3 (alphavbeta3) integrin-reseptoren, og OPN overekspresjon i NSCLC er assosiert med patologisk stadium av tumoren, som er en av de prediktor for dårlig prognose [ ,,,0],5]. Det heparin-bindende αvβ3 integrin medierer celle-celle og celle-matrise-adhesjon, regulerer intracellulære signalveier og induserer aktivering av protein-oppløsning av enzymer, og dermed bidra til ekstracellulær matriks og kjeller cellemembranen degradering og fremme invasjon og migrering av tumorceller [ ,,,0],6]. Tidligere studier funnet at αvβ3 blir detektert i en rekke forskjellige tumortyper, og er nært forbundet med både tumorutvikling, og graden av malignitet tumor [7]. Andre faktorer som er nært beslektet med gener av cellesyklus regulering og spredning, slik som Pim-en (PIM-en onkogen), er også involvert i tumordannelse [8]. Angivelig, OPN virker gjennom αvβ3 inte, som i sin tur aktiverer FAK, PI3K, Akt, ERK, NF-kB og Pim-1 veier, og dermed bidra til migrasjon av lungekreftceller [8]. Samtidig blir disse resultatene tyder på at OPN medierer migrasjon i humane lungekreftceller via αvβ3 integrin, FAK, PI3K, Akt, ERK, NF-kB og Pim-1 signalveier. Derfor valgte vi å ytterligere undersøke OPN, αvβ3 inte og Pim-en, tre komponenter av disse signalveier, i denne studien. Til dags dato, men uttrykket dynamikken i OPN, αvβ3 og Pim-en i NSCLCs og deres potensielle biologiske roller i tumorigenesis av NSCLC er ikke fullstendig klarlagt.
I denne studien immunhistokjemiske analyser ble benyttet for å bestemme uttrykket priser på OPN, αvβ3 og Pim-en i 208 NSCLC prøvene og deres tilstøtende prøver normale lungevevet. I tillegg ble de potensielle assosiasjoner mellom uttrykk mønstre av de tre merkene og deres assosiasjoner med klinisk-patologiske trekk ved NSCLC pasienter evaluert.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av klinisk forskningsetiske komité for tredje Affiliated Hospital, Sun Yat-sen-universitetet. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra hver pasient, og de etiske retningslinjene som beskrevet i Helsinkideklarasjonen ble fulgt.
Fag
I denne studien prøver ble hentet fra den arkiverte parafin-embedded tissue deler av 208 sammenhengende NSCLC tilfeller diagnostisert på tredje Affiliated Hospital, Sun Yat-sen-universitetet, Guangzhou, Kina, fra 1. januar 2008 til 31. desember, ble 2010. tilstøtende normalt lungevev fra hvert tilfelle brukt som kontroller. I denne NSCLC kohort, 147 pasientene var menn og 61 var kvinner, med en median alder på 60 år (30-82 år). Ifølge Verdens helseorganisasjon kriteriene for lungekreft publisert i 2004 [9] ble histologi av vår NSCLC kohort klassifisert som følger: adenokarsinom: 110 saker, plateepitelkarsinom: 61 tilfeller, og andre typer: 37 tilfeller; godt differensiert karsinom: 65 tilfeller, moderat differensiert karsinom: 70 saker, og dårlig differensiert karsinom: 73 tilfeller. Ifølge TNM-systemet fra den internasjonale foreningen for studier av lungekreft [10], 87 saker ble klassifisert som stadium I, 59 tilfeller var stadium II, 42 tilfeller var stadium III og 20 tilfeller var stadium IV.
Immunohistokjemi
Immunohistokjemiske teknikker som bruker streptavidin-peroksidase (SP) ble ansatt for OPN, αvβ3 og Pim-en oppdagelse. Klar til bruk mus anti-human monoklonale antistoffer mot OPN, αvβ3 og Pim-en, og S-P kits ble kjøpt fra Maxim biologisk og teknisk selskap, Fuzhou, Kina. Alle seksjonene ble rutinemessig deparaffinized og rehydrert, skyllet i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) og behandlet for antigen gjenfinning. Snittene ble behandlet i EDTA-buffer (pH 8,0) i en autoklav sterilisator. Etter avkjøling ved romtemperatur i 20 minutter, ble seksjonene skylt i PBS og deretter neddykket i 3% H
2o
2 i 15 minutter for å blokkere endogen enzymaktivitet. Etter skylling med PBS, ble seksjonene inkubert med normalt geiteserum ved 37 ° C i 15 minutter for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding. Etter inkubering med de primære antistoffer (OPN, αvβ3 og Pim-1-monoklonale antistoffer), ble seksjonene skylt i PBS, inkubert med biotinylerte sekundære antistoffer og skylt med PBS igjen. Etter at snittene ble inkubert med streptavidin-HRP og skylt med PBS, ble seksjonene visualisert ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin og motfarget med hematoksylin. Til slutt ble seksjonene dehydrert, transparented, dekket med Dekkglass og forseglet med nøytral gummi. PBS uten primært antistoff ble anvendt som negativ kontroll.
Resultatene av de immunhistokjemiske analysene ble vurdert ved tre av forfatterne (Jin Y, Chen JN og Shao CK). Positive OPN og Pim-1-ekspresjon ble observert i cytoplasma som en brun-gul farge, mens αvβ3 ble lokalisert i både cytoplasma og cellemembran som en brun-gul farge. Bare celler med en klar cytoplasma og /eller membran flekker ble ansett som positivt. For hvert tilfelle ble totalt 10 tilfeldig utvalgte høy effekt felt (400 ×) evaluert og andelen av celler som viste positiv farging ble kvantifisert. For å minimalisere interindividuelle forskjeller tolkning, ble gjennomsnittsresultatet av de tre observatører ble brukt til analysen. En tumor eller normalt vev i hvilket mer enn 10% av cellene ble positivt fargede ble klassifisert som positiv [11], [12], [13]. En svulst eller normalt vev med mindre enn 10% positivt fargede celler ble klassifisert som negative.
Statistisk analyse
uttrykk for de tre markører (OPN, αvβ3 og Pim-1) ble presentert i studien som dikotomien (positive /negative), og ble analysert som dikotome variabler. Chi-squared tester ble brukt for å sammenligne uttrykk priser på OPN, αvβ3 og Pim-en i NSCLCs og deres tilstøtende normale lunge vev, samt sammenhengen mellom uttrykket av OPN, αvβ3 og Pim-en og de klinisk-patologisk parametere av NSCLC pasienter. Assosiasjonene mellom to variabler ble også evaluert av chi-squared tester. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant på
p
-verdi på mindre enn 0,05. Alle de
p
-verdier som presenteres i denne studien er tosidig. Dataene ble analysert med dataassistert SPSS13.0 statistisk programvare.
Resultater
Uttrykk for OPN og sin tilknytning til klinisk-patologisk parametere av NSCLC pasienter
Uttrykket av OPN i NSCLC vev var overveiende cytoplasma (figur 1A-C). I vår studie, 141 av 208 (67,8%) NSCLC tilfeller viste positivt uttrykk for OPN, mens den positive frekvensen av OPN uttrykk i tilstøtende normale lunge vev var 20,2% (42/208). Forskjellen mellom ekspresjonen av OPN i NSCLC-vev og de tilstøtende normale lunge vev var signifikant (
P
0.01, tabell 1). Videre analyser viste at uttrykket av OPN ble signifikant assosiert med svulsten differensiering grad, lymfeknutemetastase og klinisk staging i NSCLC pasienter (
P
0,01). Sammenhengen mellom uttrykket av OPN og fjernmetastaser hos NSCLC pasienter var av border statistisk signifikans (
P
= 0,05). Men OPN uttrykk var ikke korrelert med andre studert klinisk-patologisk parametre (
P
0,05, tabell 2).
OPN er uttrykt i cytoplasma og vises som enten gul eller brun gul. Positivt uttrykk for OPN ble påvist i en skvamøst karsinom (A) og et adenokarsinom (B) i lungen, men ikke i den tilstøtende normalt lungevev (C). αvβ3 er uttrykt i cellemembranen og cytoplasma og fremstår som enten gul eller brun-gul. αvβ3 er positiv i en annen skvamøst karsinom (D) og et adenokarsinom (E) i lungen, men ikke i den tilstøtende normalt lungevev (F). Ekspresjonen av Pim-1 hovedsakelig er cytoplasmisk. Pim-1 er positiv i en skvamøst karsinom (G) og et adenokarsinom (H) i lungen, men ikke i den tilstøtende normalt lungevev (I) (SP 20 x 10).
uttrykk for αvβ3 og sin tilknytning til klinisk-patologisk parametere av NSCLC pasienter
i NSCLCs, observerte vi at αvβ3 protein ble uttrykt hovedsakelig i cellemembranen eller cytoplasma (figur 1D-F). Den positive frekvensen av αvβ3 uttrykk i NSCLCs var 76,0% (158/208), som var betydelig høyere enn i tilstøtende normalt lungevev (24,0%, 50/208) (
P
0,01, tabell 1) . I tillegg ble et uttrykk for αvβ3 også positivt assosiert med histopatologiske differensiering, lymfeknute metastatisk status og klinisk stadium (
P
0,01, tabell 2).
Uttrykk for Pim-en og sin tilknytning til klinisk-patologisk parametere av NSCLC
Pim-1 uttrykk ble observert hovedsakelig i cytoplasma (figur 1G-i). I vår NSCLC kohort, 122 av de 208 (58,7%) tilfeller viste positivt uttrykk for Pim-en, mens den positive frekvensen av Pim-1 uttrykk i normale lunge vev var 14,9% (31/208). Forskjellen mellom Pim-1-ekspresjon i NSCLC-vev og normale lunge vev var signifikant (
P
0.01, tabell 1). I tillegg er uttrykk for Pim-en var signifikant korrelert til differensiering grad, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser og klinisk staging i NSCLC vev (
P
0,01), men ble ikke observert noen korrelasjon mellom uttrykket av Pim-en og andre studert klinisk-patologisk parametre (
P
0,05, tabell 2).
foreninger mellom protein uttrykk mønstre av OPN, αvβ3 og Pim-en i NSCLCs
i vår studie potensielle assosiasjoner mellom protein uttrykk mønstre av OPN, αvβ3 og Pim-en i NSCLCs ble evaluert videre. 89,4% (126/141) av svulster positive på OPN var også αvβ3-positive, og 52,2% (35/67) OPN negative svulster var αvβ3 negative. Sammenhengen mellom uttrykket av OPN og αvβ3 var statistisk signifikant (
P
0,01, tabell 3). Dessuten var 72,3% (102/141) av svulster positive på OPN positivt for Pim-en, og 70,1% (47/67) av svulster negative på OPN var også Pim-en negativ. Sammenhengen mellom uttrykket av OPN og Pim-en var også statistisk signifikant (
P
0,01, tabell 4). Videre, 66,5% (105/158) av tumorer som var positive for αvβ3 var positive for Pim-1, og 66% (33/50) av tumorer negative for αvβ3 ble også Pim-1 negativ. En sammenheng mellom uttrykk for αvβ3 og Pim-en ble også observert (
P
0,01, tabell 5).
Diskusjoner
det er vel-etablert at den maligne transformasjon av celler krever endringer av genet fenotype og angiogenese. OPN er ansett å være den viktigste faktoren for malign transformasjon. OPN, også kjent som en transformasjon relatert protein fosfatase, er en ekstracellulær matriks sekrert fosforylert glykoprotein som opprinnelig ble funnet ved Senger og medarbeidere [14] i epitelceller som hadde gjennomgått malign transformasjon. I de senere årene har flere studier bekreftet at overekspresjon av OPN kan fremme tumorvekst, invasjon og /eller metastase [3].
Tidligere ble det rapportert at uttrykket av OPN ble observert hos 68,8% hos NSCLC tilfeller [15]. Andre grupper rapporterte at OPN uttrykket var forbundet med tumorvekst, tumor iscenesettelse og lymfeknute invasjonen av pasienter med NSCLC [16]. I foreliggende undersøkelse, ekspresjonen frekvensen av OPN protein i NSCLCs ble bestemt til å være 67,8%, mens bare 20,2% av de normale lunge vev uttrykt OPN protein, noe som tyder på at OPN uttrykk kan tilveiebringe en selektiv fordel for utvikling av NSCLC. Ytterligere statistiske analysene viste at OPN uttrykk korrelert tett med differensiering grad av NSCLC, lymfeknutemetastase og klinisk staging, men at det var uavhengig av andre klinisk-patologisk parametere av NSCLCs. I tillegg OPN uttrykk ble sett oftere i dårlig differensierte kreft, svulster med lymfeknutemetastaser og /eller svulster i avansert klinisk stadium (III /IV). En aktuell studie antyder at OPN kan frembringe en markert effekt ved å binde til reseptorer på endoteliale celle cellemembraner. Etter OPN binding til reseptorer slik som αvβ3 inte, kan det direkte stimulerer differensiering og spredning av lungekreft celler, og kan regulere dannelsen og migrasjon av lungekreft celler, øke vaskulær permeabilitet, endre ekstracellulære matrise, indusere angiogenese, aktiverer intracellulære signalveier og fremme veksten av NSCLC [17]. Disse data tyder på at økt uttrykk av OPN kan lette utvikling og /eller progresjon av NSCLC, og det er mulig at OPN kan brukes enten som et terapeutisk mål eller en biomarkør for NSCLC i fremtiden.
Høy OPN uttrykk i NSCLC kan skyldes regulering av transkripsjonsfaktorer som αvβ3 og Pim-en. Tidligere studier har vist at αvβ3 regulerer ekspresjonen av PIM-1, og VEGF, og medierer tumor angiogenese gjennom PI3 /AKT signalveier. Følgelig er de også fremme ekspresjonen av OPN [18], [19]. Nylig er det blitt rapportert at overekspresjon av αvβ3 integrin er forbundet med en aggressiv fenotype i flere solide tumortyper, [20], [21]. I denne studien fant vi at uttrykket frekvensen av αvβ3 var 76,0% hos NSCLC vev, som var betydelig høyere enn i vanlige lunge vev (24,0%), noe som tyder på at αvβ3 kan være involvert i utviklingen av NSCLC. I tillegg statistiske analyser viste at protein ekspresjon av αvβ3 var positivt assosiert med differensiering graden av NSCLC, lymfeknutemetastase og klinisk staging. Disse resultatene tyder videre på at ekspresjon av αvβ3 kan være involvert i utviklingen av NSCLC, så vel som graden av malignitet, invasjon og metastasering av NSCLC. En mulig molekylær mekanisme som kan forklare hvordan αvβ3 fremmer utviklingen av NSCLC er den rollen som αvβ3 integrin spiller i å fremme angiogenese og celle-matrise-adhesjon [22]. Således er det mulig at αvβ3 brukes som en viktig indikator for å vurdere graden av ondartet invasjon i NSCLC. Det er også mulig at αvβ3 blir brukt som en surrogatmarkør for diagnose av NSCLC og en prediktor for den terapeutiske respons etter behandling med det anti-αvβ3 antistoff i NSCLC. Imidlertid er videre forskning er nødvendig for å fastslå deres nøyaktighet.
Pim-en, en potensiell onkogen, ligger på kromosom 6p21.2 og koder for et serin /treonin kinase [23]. Nyere studier har bekreftet at den er høyt uttrykt i en undergruppe av ondartede svulster [24], [25]. Pim-1 regulerer spredning, differensiering og apoptose av lungekreft celler [26]. I foreliggende undersøkelse, ble Pim-1-ekspresjon detektert i de fleste NSCLCs, mens Pim-1-ekspresjon ble observert i en vesentlig lavere prosentandel av normale lunge vev. Dette resultatet er i samsvar med funnene rapportert av Zhang et al. [27] og He et al. [28]. Det er blitt dokumentert at Pim-1 kan fremme G2 /M, og aktivere cellevekst, differensiering og proliferasjon [8]. Vi fant også at Pim-1 protein uttrykk korrelerer med dårlig differensierte NSCLC vev, avansert klinisk stadium (III /IV) og lymfeknute og fjernmetastaser til vesentlig høyere priser enn tidlig klinisk stadium (I /II) NSCLC tilfeller og ingen lymfeknute og /eller fjernmetastaser. Basert på disse kollektive resultatene, foreslår vi at Pim-en kan også være involvert i tumordannelse og /eller progresjon av NSCLC.
I denne studien statistisk analyse viste at det var en sterk positiv-positiv sammenheng mellom uttrykk for OPN og αvβ3. Det ble foreslått at OPN virker gjennom αvβ3 inte, som i sin tur aktiverer FAK signalveier og bidrar ytterligere til overekspresjon av αvβ3 [29]. Andre grupper har også funnet at OPN er involvert i både tumorvekst og angiogenese av lungekreft med opp-regulering av vaskulær endotelial cellemigrering og proliferasjon gjennom dets interaksjon med integrin αvβ3 [30]. Oppregulering av OPN aktiverer spesielt aktiviteten til αvβ3 integrin-reseptoren, som kan akselerere tumorangiogenese og indusere aktivering av en rekke kinaser så som Pim-1, PI3K og AKT [18], [19]. Derfor kan høyere OPN uttrykk nivåer heve uttrykk for αvβ3 og Pim-en ved å aktivere flere signalveier. I vår nåværende studie ble uttrykket av OPN, αvβ3 og Pim-1 i NSCLC forbundet med hverandre. Derfor våre resultater, sammen med funn av andre grupper, tyder på at OPN spiller en avgjørende rolle for tumorvekst og /eller progresjon av menneskelig lungekreft ved å samhandle med αvβ3 grin og aktivere Pim-en gjennom flere signalveier [18], [19 ], [23], [29], noe som resulterer i overekspresjon av OPN, αvβ3 og Pim-en.
i konklusjonen, er denne studien den første forskningen vurdere forholdet mellom osteopontin, αvβ3 og Pim- 1, og deres tilknytning til de kliniske-patologiske parametere av NSCLC. Selv om alle analysene var univariate, denne studien viste at opn, αvβ3 og Pim-1-proteiner blir ofte overuttrykt i NSCLC og er forbundet med noen clinicopathologic variable som er av kjent prognostisk betydning i NSCLC, noe som tyder på at de kan spille en viktig rolle i utvikling og /eller progresjon av NSCLC. Målrette samspillet mellom OPN, αvβ3 og /eller Pim-en kan være effektive i den fremtidige utviklingen av anti-angiogene terapeutiske midler for NSCLC.
