Abstract
Bakgrunn
IQ-domene GTPase aktiverende protein 1 (IQGAP1) binder seg til Dishevelled (Dvl) og fungerer som en modulator av Dvl kjernefysiske lokalisering i Xenopus embryoer. Imidlertid er forholdet mellom IQGAP1 og Dvl i tumorvev uklart.
Materialer og metoder
Vi brukte immunhistokjemi å vurdere uttrykk for IQGAP1 og Dvl i en kohort av 111 ikke-småcellet lungekreft lungekreft (NSCLC) pasienter. Association of deres lokalisering uttrykk med clinicopathological faktorer ble også analysert.
Resultater
Den positive frekvensen av IQGAP1 i primære svulster var 48,6% (54/111) for sin cytoplamic uttrykk, 9,0% (10 /111) for atom uttrykk og 31,5% (35/111) for membran uttrykk; den positive frekvensen av Dvl var 65,8% (73/111) for cytoplamic uttrykk, 9,9% (11/111) for atom uttrykk og 10,8% (12/111) for membran uttrykk. Koekspresjon hastighet på IQGAP1 og Dvl var 77,8% (42/54) i cytoplasma, 80,0% (8/10) i kjernen og 8,6% (3/35) i membranen. Koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen ble signifikant korrelert (P 0,05), men ikke i membranen (P 0,05). De positive ekspresjonshastigheter av cyclin D1 og c-myc var signifikant høyere i gruppen av IQGAP1 og Dvl koekspresjon i kjernen enn i cytoplasma. Koekspresjon frekvensen av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og kjernen var betydelig høyere i lymfe nodemetastaser (63,3%, 19/30) enn i primær vekster (38,3%, 31/81), korrelerer med dårlig prognose. Fem års overlevelse etter reseksjon i gruppen med sine koekspresjon i cytoplasma og kjernen var betydelig lavere enn uten koekspresjon (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 måneder, p 0,05).
Konklusjoner
koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen var korrelert med lymfe nodal metastase og dårlig prognose av NSCLC, og koekspresjon i kjernen kan spille en kritisk rolle i aktiveringen av kanoniske Wnt svei.
Citation: Zhao H, Xie C, Lin X, Zhao Y, Han Y, Vifte C, et al. (2014) koekspresjon av IQ-Domain GTPase-Aktivere Protein 1 (IQGAP1) og Dishevelled (Dvl) er korrelert med dårlig prognose i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (12): e113713. doi: 10,1371 /journal.pone.0113713
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 03.07.2014; Godkjent: 27 oktober 2014; Publisert: 01.12.2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
IQGAP familie proteiner finnes i en rekke organismer, inkludert gjær, fisk og pattedyr. Det er tre isoformer av IQGAP hos mennesker: IQGAP1, IQGAP2 og IQGAP3. IQGAP1 er den best karakteriserte og den mest studerte medlem av familien IQGAP. Det er et stillas protein som binder seg til trådformede aktin og funksjoner for å kryssbinde og stabilisere aktin filamenter via dens calponin homologi (CH) domene ved den N-terminale [1]. Tidligere rapporter viste at IQGAP1 påvirket cellemotilitet i forkant av trekkende celler, ved å øke nivåene av aktive Rac1 og Cdc42 [2]. IQGAP1 viser forhøyede nivåer i en rekke krefttyper, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [3]. Uttrykket og subcellulære beliggenheten av IQGAP1 i lunge adenokarsinom ble forbundet med histologisk differensiering og kan brukes til å forutsi overlevelse hos pasienter [4]. Nyere forskning tyder på at IQGAP1 er en risikofaktor for lymfeknutemetastase av lunge plateepitelkarsinom [5].
Dvl har blitt identifisert som en viktig regulator av Wnt signal (inkludert kanoniske og noncanonical trasé), som er en viktig del av fysiologisk prosess som er involvert i fosterutviklingen og tumorprogresjon [6], [7]. Mange rapporter har vist seg rollen Dvl i svulster. Dvl overekspresjon er signifikant korrelert med dårlig differensiering og lymfeknutemetastase i NSCLC [8]. DVL-en og DVL-3 påvirker NSCLC celle invasjon hovedsakelig gjennom kanoniske og noncanonical Wnt veier henholdsvis [9]. Wnt5a fremmer brystkreftcellemigrering via Dvl-2 [10].
IQGAP1 fungerer som en modulator av Dvl nukleære lokaliserings i Wnt signalering [11]. Imidlertid er sammenhengen mellom IQGAP1 og Dvl i tumorer uklart. I denne studien, utførte vi en immunhistokjemisk analyse for å identifisere de uttrykk og plassering av IQGAP1 og Dvl i NSCLC. Videre analyserte vi deres tilknytning clinicopathological parametre.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle menneskelige vev ble oppnådd i samsvar med menneske emne forskningsprotokoller som er godkjent av China Medical universitets~~POS=TRUNC Review Board. Tumorvev ble oppnådd med skriftlig informert samtykke fra voksne pasienter med NSCLC.
Vevsprøver og pasientdata
Vi har samlet 111 prøver fra NSCLC pasienter som gjennomgikk komplett reseksjon i First Affiliated Hospital of China Medical university fra januar til desember 2008. Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller cellegift før kirurgisk fjerning. Oppfølging informasjonen ble hentet fra en vurdering av pasientens journal. Den pTNM iscenesettelse system av International Union Against Cancer (7th edition) ble brukt i vår studie. Denne studien ble gjennomført med godkjenning av den lokale Institutional Review Board i Kina Medical University. De viktigste kliniske og patologiske variabler av alle pasienter er som følger: 46 tilfeller av plateepitelkarsinom, 65 tilfeller av adenokarsinom; 38 tilfeller av godt differensiering, 73 tilfeller av moderat dårlig differensiering; 67 tilfeller i stadium I, 20 tilfeller i stadium II, 24 tilfeller var stadium III; 70 tilfeller av mannlige pasienter, 41 tilfeller av kvinnelige pasienter; gjennomsnittsalderen er 57 år.
Immunohistochemistry
Kirurgisk skåret vevsprøver ble fiksert med 10% nøytral formalin, innstøpt i parafin og 4 mikrometer tykke seksjoner ble utarbeidet. Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av avidin-biotin-peroksidase kompleks metode (UltrasensitiveTM, MaiXin, Fuzhou, Kina). Seksjonene ble deparaffinized i xylen, rehydrert med gradert alkohol, og deretter kokt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 2 min med en autoklav. Hydrogenperoksid (0,3%) ble anvendt for å blokkere endogen peroksyd aktivitet og delene ble inkubert med normalt geiteserum for å redusere ikke-spesifikk binding. Vevssnitt ble deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer (mus anti-humane) er som følger: IQGAP1 monoklonalt antistoff (1:40, sc-376 021, Santa Cruz Biotechnology, USA), Dvl monoklonalt antistoff (1:25, sc-166 303, Santa Cruz), cyklin D1 monoklonalt antistoff (1:100, sc-20044, Santa Cruz), c-myc monoklonalt antistoff (1:500, cat.ab32, Abcam). Biotinylert geite-anti-serum-IgG ble brukt som et sekundært antistoff. Som en isotype-kontroll, mus IgG (Maixin Biotechnology, Fuzhou, Fujian, Kina, ved den samme konsentrasjonen av det primære antistoff) ble anvendt i stedet for det primære antistoff (figur S1). Etter vasking, ble seksjonene inkubert med streptavidin-biotin konjugert med pepperrot peroksidase, og peroksydasereaksjonen ble utviklet med 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid. Kontra ble gjort med hematoksylin, og delene var så dehydrert med etanol før de blir montert.
Evaluering av flekker
Den fargeintensitet og prosentandel av celler farget i representative områder av hvert bilde ble uavhengig evaluert og scoret av to etterforskere, som var blindet for de kliniske data om pasienter. Fem visningene ble undersøkt per lysbilde, og 100 celler ble observert per view på 400 × forstørrelse. For IQGAP1 eller Dvl de immunhistokjemiske Resultatene viste at positiv farging lokalisert i kjernen, cytoplasma, og (eller) membran. Tumorer ble definert som cytoplasmatisk ekspresjon når 20% eller flere av tumorceller viste cytoplasmatisk farge; tumorer ble definert som atom ekspresjon når 20% eller flere av tumorceller viste nukleær farging, enten cytoplasmisk farging eller ikke; tumorer ble definert som membranøs ekspresjon når 20% eller flere av tumorceller viste membranfarging, enten cytoplasmisk farging eller ikke. Regionene med positive uttrykk var gul eller brun-gule, og regioner med negativ uttrykk var ingen farging. For cyklin D1 eller c-myc, de immunhistokjemiske Resultatene viste at positiv farging lokalisert i kjernen eller kjernen /cytoplasma.
Statistisk analyse
SPSS versjon 16.0 for Windows ble brukt for alle analyser. Chi-kvadrat-testen ble anvendt for å undersøke forskjellige mulige sammenhenger. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse ble brukt til å anslå sannsynligheten for pasientens overlevelse, og forskjellene i overlevelse mellom undergruppene av pasientene. Den Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell ble brukt for å estimere mulig prognostisk betydning clinicopathological variabler. Alle P-verdiene var basert på tosidig statistisk analyse, og P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant i forskjell
Resultater
1.. Koekspresjon av IQGAP1 og Dvl hovedsakelig i cytoplasma og cellekjernen
Den positive uttrykk frekvensen av IQGAP1 var 89,2% (99/111), og 48,6% (54/111) for sin cytoplamic uttrykk, 9,0% (10 /111) for atom uttrykk og 31,5% (35/111) for membran uttrykk. Den positive uttrykk frekvensen av Dvl var 86,5% (96/111), og 65,8% (73/111) for cytoplamic uttrykk, 9,9% (11/111) for atom uttrykk og 10,8% (12/111) for membran uttrykk (tabell S1).
Koekspresjon hastighet på IQGAP1 og Dvl var 77,8% (42/54) i cytoplasma (tabell 1, figur 1), 80,0% (8/10) i kjernen (tabell 1, figur 2A -D). Koekspresjon i cytoplasma korrelerte signifikant (Tabell 1, p = 0,009, r = 0,246), også i kjernen (tabell 1, p = 0,000, r = 0,738); koekspresjon frekvensen av IQGAP1 og Dvl i membranen var bare 8,6% (3/35), og koekspresjon i membranen var ikke korrelert (tabell 1, P 0,05, Figur S2)
A-B. adenokarsinom ; C-D: plateepitelkarsinom. Original forstørrelse, 400 ×; skala bar, 20 mikrometer.
koekspresjon av IQGAP1 (A) og Dvl (C) i kjernen av lunge adenokarsinom. Koekspresjon av IQGAP1 (B) og Dvl (D) i kjernen av lunge plateepitelkarsinom. Positive ekspresjon av Cyclin D1 (E) og c-myc (G) i lunge adenokarsinom. Positivt uttrykk for cyclin D1 (F) og c-myc (H) i lunge squamous cell carcinoma. Original forstørrelse, 400 ×; skala bar, 20 mikrometer.
uttrykk for cyclin D1 og c-myc var signifikant positiv i gruppen av IQGAP1 og Dvl koekspresjon i kjernen (figur 2E-H), og deres positive uttrykk priser var 100% (8/8) og 87,5% (7/8), henholdsvis. I gruppen av IQGAP1 og Dvl koekspresjon i cytoplasma, de positive ekspresjonshastigheter av cyklin D1 og c-myc var 52,4% (22/42) og 35,7% (15/42), respektivt. De positive ekspresjonshastigheter av cyclin D1 og c-myc i gruppen av kjernefysiske koekspresjon var betydelig høyere enn for cytoplasma koekspresjon (P 0,05)
2.. Koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma eller kjernen var korrelert til lymfatiske metastasering av NSCLC
Som vist i tabell 2, koekspresjon hastighet på IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen var 63,3% (19/30) i gruppe med lymfe nodemetastaser (N1-3) og 38,3% (31/81) i gruppen med primære vekster (N0). Nodemetastaser viste høyere koekspresjon rate av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen enn primærsvulster (P 0,05). Ingen statistisk signifikant forskjellig hastighet ble vist mellom gruppen av T1 og T2-4 (tumorstatus) (P 0,05, Tabell S2), også mellom gruppen av adenokarsinom og plateepitelkarsinom (histologiske typer) (P 0,05, tabell S3 ).
3. Koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma eller kjernen var korrelert til dårlig prognose av NSCLC
Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste en betydelig lavere overlevelsestiden hos pasienter med koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen enn de med ingen koekspresjon. Fem års overlevelse etter reseksjon i gruppen med sine koekspresjon i cytoplasma og kjernen var betydelig lavere enn uten koekspresjon (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 måneder, p 0,05, figur 3A), og gruppen av kjernefysisk koekspresjon var signifikant lavere enn den til cytoplasmatisk koekspresjon (36.000 ± 6.329 46.528 ± 3.758 vs måneder, P 0,05, figur 3B).
(A) a.The gruppe med IQGAP1 og Dvl noncoexpression i cytoplasma og cellekjernen ( 61 tilfeller); b.the gruppe med IQGAP1 og Dvl koekspresjon i cytoplasma og nucleus (50 tilfeller) (B) a.The gruppe med IQGAP1 og Dvl noncoexpression i cytoplasma og cellekjernen (61 tilfeller); b.the gruppe med IQGAP1 og Dvl koekspresjon i cytoplasma (42 tilfeller); C. Den gruppen med IQGAP1 og Dvl koekspresjon i kjernen (8 tilfeller).
For å avklare om koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen ble uavhengig assosiert med prognosen for pasienter med NSCLC, vi ansatt Cox proporsjonale hazard regresjonsmodell. Resultatet viste at cytoplasmatiske og atom coexpressions var uavhengige risikofaktorer for prognosen for pasienter med NSCLC (P 0,05, tabell 3).
Diskusjoner
Som en viktig effektor av Rho GTPases, er IQGAP1 et stillas protein og spiller grunn funksjon i celle bevegelse ved å modulere aktin cytoskjelettet gjennom Rac1 og Cdc42 [12] – [14]. Dvl er en viktig formidler av den kanoniske Wnt signalveien, og dens kjernefysiske lokalisering er nødvendig for kanonisk Wnt signal [15], [16]. I Xenopus embryo, IQGAP1 samhandlet med Dvl og regulert sin kjernefysiske lokalisering til moderat uttrykk av Wnt målgener under tidlig embryo [11]. Imidlertid har forholdet mellom IQGAP1 og Dvl i tumorer ikke blitt rapportert.
Denne studien undersøkte IQGAP1 og Dvl uttrykk for NSCLC (adenokarsinom og plateepitelkarsinom). Vi fant ut at IQGAP1 og Dvl ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma. Koekspresjon hastighet på IQGAP1 og Dvl i cytoplasma eller kjernen var signifikant høyere enn i membranen; koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen ble signifikant korrelert (P 0,05), men ikke i membranen (P 0,05). Den koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og kjernen var assosiert med lymfeknutemetastase og dårlig prognose i NSCLC. Overlevelsen i gruppen av kjernefysiske koekspresjon var vesentlig dårligere enn for cytoplasma koekspresjon. Den membran koekspresjon av IQGAP1 og Dvl var ikke korrelert (P 0,05). Disse resultatene antydet at IQGAP1 interaksjon med Dvl i cytoplasma og cellekjernen av NSCLC, og rollen i cytoplasma kan være en av de kritiske trinn i modulering av nukleære lokaliserings Dvl, men ikke i membranen. Disse funnene er i tråd med tidligere studie [11].
Nuclear lokalisering av Dvl er nødvendig for kanonisk Wnt signal [15]. Dvl samarbeider med c-Jun å regulere gentranskripsjon stimulert av den kanoniske Wnt signalveien i kjernen [16]. I denne studien fant vi at målgener av kanoniske Wnt signal, cyclin D1 og c-myc, de positive tallene for dem i gruppen med IQGAP1 og Dvl koekspresjon i kjernen var mye høyere enn i cytoplasma. Overlevelsesanalyse viste også at pasienter med koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i kjernen hadde en signifikant lavere overlevelse enn pasienter som i cytoplasma (p 0,05). Disse resultater antyder at atom koekspresjon av IQGAP1 og Dvl er assosiert med aktiveringen av kanoniske Wnt svei.
Basert på de ovenfor angitte resultater vi konkludere med at koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og cellekjernen er korrelert med lymfeknutemetastase og dårlig prognose i NSCLC. IQGAP1 modulerer Dvl nukleære lokaliserings i cytoplasma, men ikke i membranen. Den koekspresjon av IQGAP1 og Dvl i kjernen er forbundet med ekspresjon av cyclin D1 og c-myc, noe som tyder på at atom koekspresjon av IQGAP1 og Dvl er assosiert med aktiveringen av kanoniske Wnt svei. Derfor hemming av binding av IQGAP1 og Dvl i cytoplasma og hindre Dvl kjernefysisk translokasjon, kan være en av strategiene for forebygging og behandling av lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
validering av antistoff (IQGAP1, A og D; Dvl, B og E) for immunhistokjemi. A-C: adenokarsinom; D-F: plateepitelkarsinom; C og F: muse-IgG ble anvendt i stedet for det primære antistoff. Original forstørrelse, 400 ×; . Skala bar, 20 mikrometer
doi: 10,1371 /journal.pone.0113713.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Koekspresjon av IQGAP1 (A, C) og Dvl (B, D) i membranen av NSCLC. A-B: adenokarsinom; C-D: plateepitelkarsinom. Original forstørrelse, 400 ×; . Skala bar, 20 mikrometer
doi: 10,1371 /journal.pone.0113713.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
IQGAP1 og Dvl uttrykk i NSCLC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s003 plakater (DOC)
Tabell S2.
IQGAP1 og Dvl koekspresjon i ulike tumorstatus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s004 plakater (DOC)
tabell S3.
IQGAP1 og Dvl koekspresjon i ulike histologiske typer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s005 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne ønsker å takke Dr. Weinan Li, for utmerket teknisk assistanse.
