Abstract
Nyrecellekarsinom (RCC) er den sjette vanligste kreftformen i USA. Mens RCC er svært metastatisk, er det få legemiddel alternativer tilgjengelig for pasienter med metastatisk RCC, og progresjonsfri overlevelse av pasienter selv med nyeste målrettede therapeutics er bare opp til to år. Således blir nye terapeutiske mål for denne sykdommen desperat behov. Basert på våre tidligere metabolomics studier som viser endring av peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor α (PPARa) relaterte hendelser i både RCC pasient og xenograft mus materialer, ble denne veien videre undersøkt i denne studien i innstillingen av RCC. PPARa er en nukleær reseptor protein som virker som en transkripsjonsfaktor for gener, inkludert de som koder for enzymer som er involvert i energimetabolismen; mens PPARa har blitt rapportert å regulere tumorvekst i flere krefttyper, har det ikke blitt evaluert i RCC. En spesifikk PPARa-antagonist, GW6471, induserte både apoptose og cellesyklus-stans ved G0 /G1 i VHL (+) og VHL (-) RCC-cellelinjer (786-O og Caki-1) forbundet med svekking av cellesyklusregulerende proteiner c -Myc, Cyclin D1, og CDK4; disse dataene ble bekreftet som er spesifikke for PPARa antagonisme av siRNA metoder. Interessant, da glykolyse ble blokkert av flere metoder, cytotoksisitet av GW6471 ble synergistisk økt, noe som tyder på en bryter for å fettsyre oksidasjon fra glykolyse og gir en helt ny terapeutisk tilnærming for RCC
Citation. Abu Aboud O, Wettersten HI, Weiss RH (2013) Hemming av PPARa induserer cellesyklus og apoptose, og synergizes med glykolyse Hemming i nyrekreftceller. PLoS ONE åtte (8): e71115. doi: 10,1371 /journal.pone.0071115
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 9 april 2013; Godkjent: 26 juni 2013; Publisert: 07.08.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir 1R01CA135401-01A1 og 1R01DK082690-01A1 (til RHW) og helsetjeneste USA Department of Veterans «Affairs (til RHW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er globalt den 13. vanligste kreft, og en av de få kreft hvis forekomsten er økende for grunner som ikke er helt klart, men kan være relatert til røyking og fedme (anmeldt i [1 ] og [2]). I løpet av de siste årene, har målrettet terapi blitt stadig mer tilgjengelig og har vist betydelige løftet for behandling av RCC og andre kreftformer; imidlertid, selv med en slik terapi levealder blir generelt bare utvidet med mindre enn ett år, på grunn av utvikling av medikamentresistens [3]. I lys av det økende antall pasienter med sent stadium sykdom og forekomst av resistens mot tilgjengelige legemidler, nye terapeutiske mål desperat behov. Identifisering av slike mål kan føre både til utformingen av nye legemidler og /eller til revurdering av eksisterende legemidler til bruk i RCC pasienter.
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor α (PPARa) tilhører steroid hormon reseptor super [4]. Hittil har tre undertyper av PPAR (α, ß, og γ) blitt identifisert i mange arter, inkludert mennesker [5]. Som forekommer med andre steroidhormonreseptorer, ved ligandaktivering, de PPAR’er heterodimerize med retinoid X-reseptor (RXR), bindes til det spesifikke promoter-sekvensen (den peroksisomproliferator responselementet eller PPRE), og som et resultat utløse ekspresjon av en rekke av målgener [6] inkludert de som er involvert i glukose, lipid, og amino acid metabolism [7].
PPARa reseptorene har en viktig, men sannsynligvis pleiotropisk gitt sine flere funksjoner, rolle i malignitet. Enten de fungerer som tumor suppressors eller indusere i kreft er fortsatt usikkert; slike funksjoner kan være knyttet til krefttype og /eller spesifikk mikromiljøet av tumoren. Mens tumor suppresjon av PPARa har blitt rapportert i noen kreftformer, inkludert melanom [8] og glioblastom [9], er PPARa også blitt funnet å føre til utviklingen av tumorvekst i andre krefttyper, inkludert hepatocellulært karsinom [10] og brystkreft [11]. I vår kontinuerlige studie av nyrekreft ved hjelp metabolomics fremgangsmåter, har vi funnet metabolske signaturer av PPARa modulasjon i en human celle RCC (Caki-1) xenograft modell på tvers av alle tre «matriser» (vev, serum og urin) [12]. Hvorvidt dette funnet skyldes kausalitet av PPARa aktivering i onkogenese eller om det er rett og slett en kreft «signatur» ble ikke bestemt i denne studien. Likevel er denne erkjennelse som førte oss til å vurdere PPARa-agonister og antagonister, for første gang, som potensielle RCC-terapier.
Vi viser nå, ved hjelp av en spesifikk PPARa-antagonist, så vel som fremgangsmåter siRNA, at spesifikke PPARa antagonisme fører begynnelsen av cellesyklus-stans og apoptose i RCC-cellelinjer. Videre gir vi bevis på at når RCC-celler blir fratatt glykolysen underlaget, blir de mer følsomme overfor PPARa-antagonister, noe som tyder på at RCC-celler endre deres energiomsetningen trasé under disse betingelser, og som peker til gjennomførbarheten av kombinasjonen av PPARa-antagonister og glykolyse inhibitor terapi for denne sykdommen.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
RCC cellelinjer, Caki-en, og 786-O ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville , MD, USA), og den «normale humane nyre» (NHK) cellelinje ble oppnådd fra Lonza (Basel, Sveits). 786-O og Caki-1 celler ble holdt i RPMI og NHK-celler ble opprettholdt i DMEM, begge supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml streptomycin, og 100 mg /ml penicillin. Cellene ble opprettholdt på 5% CO
2 og ved 37 ° C
Material
formalinfiksert parafin-embedded lysbilder (hematoxylin eosin [H E] flekker og uten flekker). av arkiv RCC vev ble hentet fra UC Davis Avdeling for patologi etter passende IRB godkjennelse. Den PPARa-agonist, WY14,643 (WY) og antagonist, GW6471 (GW) ble oppløst i DMSO. WY, GW, DMSO, 2-deoksy-D-glukose (2-DG), ble MTT-løsning, og muse-monoklonalt anti-ß-aktin-antistoff oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA). 2-DG ble oppløst i vann. Kanin polyklonalt anti-PARP-antistoff, monoklonalt muse anti-CDK4 antistoff, polyklonalt kanin anti-cyclin D1-antistoff og kanin-polyklonalt anti-c-myc-antistoff ble erholdt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA). Kanin polyklonalt anti-PPARa-antistoff ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Geit-anti-mus og geit-anti-kanin HRP-konjugert IgG ble oppnådd fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Vectashield og DAB peroxydasesubstrat Kit, 3,3′-diaminobenzidin ble kjøpt fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). ECL Plus oppløsning ble erholdt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Den PPARa og egge kontroll siRNA ble hentet fra Qiagen (Gaithersburg, MD, USA). Lipofectamine RNAiMAX ble hentet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).
Immunohistochemistry
Menneske RCC (grad 1 og 4) og tilstøtende normalt vev ble deparaffinized, forbehandlet i natriumsitrat buffer, og blokkerte i blokkeringsbuffer (5% normalt geiteserum og 0,3% Triton X-100 i PBS) i en time ved romtemperatur. Etter blokkering, ble platene inkubert med muse-monoklonalt anti-PPARa-antistoff fra Millipore (Billerica, Massachusetts) for over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket med TBST og inkubert med 0,3% hydrogenperoksyd i TBST i 15 minutter. Objektglassene ble vasket med TBST, inkubert med geite-anti-muse-IgG HRP-konjugert i to timer ved romtemperatur. Etter vask, DAB peroxydasesubstrat Kit, 3,3′-diaminobenzidin ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Hematoxylin ble brukt for telleren farging. Glassene ble coverslipped med Vectashield.
MTT-analysen
Cellenes levedyktighet assay ble utført som beskrevet tidligere [13]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, og etter de angitte behandlinger, ble cellene inkubert i MTT-løsning /media-blanding. Deretter ble MTT oppløsningen fjernet og det blå krystallinske bunnfall i hver brønn ble oppløst i DMSO. Synlig absorbans av hver brønn ved 540 nm ble kvantifisert ved hjelp av en mikroplateleser.
Cell Cycle Analysis
Cellesyklus analyse ble utført utnytte Muse ™ Cell Analyzer fra Millipore (Billerica, MA) etter produsentens anvisninger . I korthet, etter de angitte behandlinger, ble cellene vasket med PBS og farget med propidiumjodid (PI). Etter farging ble cellene behandlet for cellesyklus analyse
apoptose analysen
Annexin V Død Cell analysen ble utført utnytte Muse ™ Cell Analyzer fra Millipore (Billerica, MA) etter produsentens anvisninger. Kort fortalt, etter de angitte behandlinger, ble cellene inkubert med Annexin V og Døde Cell Reagens (7-AAD) og hendelsene for døde, sent apoptotiske, tidlig apoptotiske og levende celler ble talt opp.
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført som tidligere beskrevet [13]. I korthet, etter de angitte behandlinger, ble cellene vasket med PBS, lysert i lyseringsbuffer, og cellelysater ble immunoblottet. Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk i en time ved romtemperatur, inkubert med angitte antistoffer, og deretter probet med pepperrot peroksidase merket anti-mus eller anti-kanin-IgG-antistoffer. Signalet ble oppdaget ved hjelp av ECL Plus løsninger.
siRNA Transfeksjon
De angitte celler ble sådd ut i en seks brønn plate for immunoblottingforsøk eller T25 kolber for cellesyklus analyser og apoptose analyser. Etter 24 timer ble cellemonolagene på omtrent 75% konfluens kastet siRNA transfeksjon. Transfeksjonsmetoden Blandingen ble utarbeidet i Opti-MEM Glutamax medium fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) med siRNA og Lipofectamine RNAiMAX henhold til produsentens protokoll. Den endelige konsentrasjonen av siRNA tilsatt til cellene var 100 nM. Cellene ble dyrket i nærvær av transfeksjon blandingen i 24 timer, og den følgende dag, transfeksjon blandingen ble erstattet med friskt RPMI-medium, og cellekultur ble fulgt i ytterligere 48 timer. Etter transfeksjon ble celler samlet opp for immunblotting, cellesyklusanalyse, eller apoptose-analyse.
Statistical Analysis
Sammenligninger av gjennomsnittsverdier ble utført ved anvendelse av uavhengige utvalg t-test. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
PPARa viser økt uttrykk i High Grade I forhold til lav Grade RCC
For å begynne å bestemme relevansen. av PPARa i RCC, vi først evaluert sine proteinnivåer i klasse 1 og klasse 4 RCC vev ved immunhistokjemi. Arkiverte RCC-vev tatt fra nefrektomi prøvene ble evaluert ved immunhistokjemi med en spesifikk PPARa antistoff. RCC vev med en histologisk diagnose av Fuhrman grad 4 viste markert farging av PPARa mens det var minimal farging av klasse 1 vev (Fig. 1). Av interesse, ble mesteparten av cytosol i klasse 1 celler består hvis en «klar» bestanddel, kjent for å være glykogen og lipider, som ikke flekken med PPARa antistoff [14].
RCC tumorvev av ulik Fuhrman karakterer var forberedt for immunhistokjemi som beskrevet i materialer og metoder, og analysert med PPARa antistoff. Mikrofotografiene vises er representative for minst tre pasienter i hver gruppe. Bar = 50 mikrometer.
En Spesifikk PPARa Antagonist, men ikke en agonist, svekket RCC celleviabilitet
De økte nivåer av PPARa observert i høy klasse vev gir lite informasjon om funksjonell status eller signale egenskapene til denne reseptoren. For å begynne å svare på dette spørsmålet, vurderte vi den funksjonelle rollen PPARa på RCC celle levedyktighet ved MTT-analyse. Både Caki-1 (VHL vill type) og 786-O (VHL mutert) celler ble inkubert separat med en spesifikk PPARa-agonist, WY14,643 [15], eller en spesifikk antagonist PPARa, GW6471 [16] ved konsentrasjoner 12,5 til 100 uM i 72 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt. Mens WY14,643 enten hadde ingen effekt på, eller litt øket, celleviabilitet, GW6471 signifikant og doseavhengig inhibert av cellenes levedyktighet (opp til ca. 80%) i begge cellelinjer (Fig. 2).
RCC celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO, WY14,643 (WY), eller GW6471 (GW) ved de angitte doser fra 12,5 til 100 uM i 72 timer og en cellelevedyktighet assay ble utført som beskrevet i Materialer Metoder. Dataene som vises, er representative for minst tre gjentagelser. * P 0,05 sammenlignet med DMSO. Feilfelt angir standardavvik.
Den PPARa Antagonist forårsaket Både Cell syklus og apoptose i begge cellelinjer
redusert celleviabilitet observert etter inkubasjon av både RCC cellelinjer med PPARa antagonist GW6471 kan forekomme som et resultat av enten redusert proliferasjon, induksjon av apoptose, eller begge deler. For å begynne å svare på dette spørsmålet, først evalueres vi celleproliferasjon ved hjelp av flowcytometri metoder. Begge celletyper ble inkubert med GW6471 eller DMSO kjøretøy i 24 timer, hvoretter cellesyklusanalyse ble utført. GW6471 arrestert cellesyklus ved G0 /G1 fase i begge Caki-1 og 786-O-celler (Fig. 3), noe som tyder på at den MTT-analysen er i det minste delvis, noe som indikerer cellesyklus-stans.
RCC-celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO (forts) eller GW6471 (GW) 25 uM i 24 timer og cellesyklusanalyse ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene som vises er representative for minst tre repetisjoner.
For å avgjøre om PPARa antagonisme resulterte i apoptose i tillegg til cellesyklus arrest, neste evaluert vi annexin V flekker under lignende forhold som ovenfor. Etter behandling av begge cellelinjer med GW6471 eller DMSO i 24 timer ble cellene underkastet flyte cytometery analyse etter annexin V-farging som beskrevet i Materialer og Metoder. Som bestemt ved cellesortering, øket GW6471 mengden av totale apoptotiske celler i begge Caki-1 og 786-O-cellelinjer (Fig. 4A). For å bekrefte apoptose under disse betingelser, ble PARP spalting i cellene behandlet med GW6471 sammenlignet med DMSO også vurdert (Fig. 4B). Tatt sammen indikerer disse data at det reduserte signal sett i MTT-analysen etter inkubering av cellene med GW6471 skyldes både cellesyklus og apoptose-induksjon.
A. RCC-celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO eller GW6471 (GW) ved de angitte doser i 24 timer og et annexin V-baserte apoptose assay ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. B. RCC-celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO eller GW6471 (GW) ved de angitte doser i 24 timer og immunblotting ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. ß-aktin ble immunoblottet som en lasting kontroll. Dataene som vises er representative for minst tre repetisjoner.
For å ytterligere evaluere mekanismen av cellesyklus og apoptose induksjon av GW6471, vi målte nivåene av cellesyklus og apoptose relevante signalering proteiner som er involvert i å regulere G0 /G1 sjekkpunkt. Begge cellelinjer ble behandlet i 24 timer med GW6471, og deretter cellelysatet ble immunoblottet med CDK4, cyklin D1, og c-Myc-antistoffer; alle disse proteiner ble betydelig redusert med den PPARa antagonist, som støtter den observerte G0 /G1 arrest og som tyder på en mekanisme for samme (fig. 5).
RCC-celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO (forts) eller GW6471 (GW) 25 mikrometer i 24 timer og immunoblotting ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Bildene som vises er representative for minst tre pasienter i hver gruppe.
siRNA transfections Bekreft spesifisitet av PPARa Inhibitor
For å bekrefte at effekten observert med GW6471 hemming er spesifikke for PPARa hemming, brukte vi en siRNA tilnærming. Caki-1 celler ble transient transfektert med en PPARa siRNA eller kryptert sekvenskontroll siRNA som beskrevet i Materialer og Metoder. Når sammenlignet med kontrollen siRNA, PPARa siRNA dempes proteinnivåer av PPARa (Fig. 6A) i likhet med det som ble observert med GW6471 i denne cellelinjen (se fig. 6A til fig. 5 til venstre panel), noe som bekrefter både effekten av siRNA og spesifisitet av GW6471 mot PPARa. Flere forsøk ble gjort for å transfektere 786-O-celler med identisk siRNA, men disse var ikke vellykket.
Caki-1 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller PPARa siRNA på 100 nM i 72 timer og behandlet for immunblotting, celle syklus analyse, og apoptose-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. A. PPARa proteinnivået ble svekket i cellene transfektert med PPARa siRNA. B. PPARa siRNA transfeksjon arrestert cellesyklus ved G0 /G1 fase. C. CDK4, cyklin D1, og c-myc proteinnivåer ble dempet i cellene transfektert med PPARa siRNA. D. PPARa siRNA transfeksjon indusert apoptose. Dataene som vises er hver representative for minst tre repetisjoner.
For å bekrefte at cellesyklus og apoptotiske hendelser observert med GW6471 inkubasjon var faktisk på grunn av PPARa hemming og ikke til off-target effekter av antagonist, undersøkt vi cellene under betingelser med siRNA transfeksjon parallelt med GW6471 inkubering. siRNA transfeksjon av Caki-1 celler arrestert cellesyklusen ved G0 /G1 (fig. 6B), svekkede protein nivåer av CDK4, cyklin D1, og c-Myc (fig. 6C), og induserte apoptose (fig. 6D) i en identisk måte til det som ble observert med GW6471 behandling, noe som indikerer at cellesyklus arrest og demping av disse proteinene ved GW6471 var faktisk på grunn av PPARa antagonisme. Således virkningene av GW6471 på cellesyklusen, dets regulatoriske proteiner, og apoptose et resultat av spesifikk PPARa antagonisme.
PPARa-antagonisme og glykolyse Inhibition synergistisk Demper RCC celleviabilitet
Siden PPARa har vært kjent å aktivere fettsyre oksidasjon (FAO) og for å redusere glukoseutnyttelsen [17], hypotese vi at PPARa antagonisme kan føre til at celler for å redusere deres avhengighet av FAO og således være avhengig av utsøkt glykolysen for deres energikilde; et slikt funn ville foreslå en ny tilnærming for klinisk nytte av PPARa antagonister, spesielt med hensyn til RCC terapi. For å evaluere denne hypotesen, behandlet vi RCC-celler med GW6471 og /eller den glykolyse inhibitoren 2-DG og deretter målte cellelevedyktighet. Under disse betingelser var det en synergistisk svekkelse av cellelevedyktighet med GW6471 og 2-DG. For å bekrefte at to-DG, som konkurrerer med glukose og dermed demper mobil glykolyse, var årsaken at cellene til å redusere glukose utnyttelse, behandlet vi cellene med GW6471 dyrket i glukose utarmet media. Både 2-DG behandling og glukose-uttømming lysfølsomt RCC-celler til PPARa antagonisme (fig. 7), noe som tyder på basal avhengighet av RCC-celler på PPARa-indusert FAO slik at cellene bytte til glukose avhengighet når FAO blir dempet med PPARa hemming. For å evaluere potensielle forskjeller i RCC kontra «normale» RTE cellelinjer utførte vi parallelle forsøk i en «normal» menneskelig nyrecellelinje (NHK) oppnådd kommersielt og funnet lignende endringer (figur S1). Disse data tyder på at den doble hemming av PPARa og glykolyse er en potensiell ny og kraftig kombinasjon terapeutisk tilnærming for RCC.
A. RCC-celler (Caki-1 og 786-O) ble behandlet med DMSO (forts), GW6471 (GW) 25 uM, og /eller 2-DG (5 mM) i 72 timer og cellelevedyktighet Assayet ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. B. RCC celler (Caki-en og 786-O) ble behandlet med DMSO (forts), GW6471 (GW) 25 mikrometer, lav glukose media (Lo Glu), eller GW6471 i lav glukose i 72 timer og celle levedyktighet ble vurdert av en MTT-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene som vises, er representative for minst tre gjentagelser. ** Synergistisk effekt sammenlignet med hver behandling for seg. Feilfelt angir standardavvik
Diskusjoner
RCC er den sjette vanligste kreftformen i USA og er en av de få kreft hvis forekomsten er i ferd med å øke.; 5-y overlevelse for pasienter med metastatisk RCC er et dystert 26% (TNM Stage IV basert på statistikk 2005) [18]. For omtrent en tredjedel av pasienter som har metastatisk sykdom, er det flere FDA-godkjente legemidler tilgjengelig, blant dem multi-kinase hemmere (f.eks sorafenib og sunitinib) [19] og mammalian target of rapamycin (mTOR-hemmere) [ ,,,0],20]. Siden progresjonsfri overlevelse selv med disse nye stoffene er en ussel ett til to år, og fordi nesten alle pasienter i utgangspunktet presentere med metastatisk kreft dør av sin sykdom [21], er det viktig å utforske nye terapeutiske tilnærminger for pasienter med metastatisk RCC.
PPARa er en ligand-aktiverte transkripsjonsfaktor som hører til kjernefysiske hormon reseptor super [22]. Denne reseptor er blitt vist å stimulere fettsyremetabolisme [17], for å dempe glykolyse [17], og for å regulere tumorgenese gjennom å fremme transkripsjon av dens målgener [23] – [28]. Til tross for utstrakt kunnskap om de forskjellige målene for PPARa, er fortsatt usikkert den nøyaktige rollen til denne reseptor i reguleringen av kreft.
PPARa-agonister er blitt vist å redusere veksten av melanom, glioblastom, og fibrosarkom, og disse effektene har vært forbundet med PPARa-indusert inhibering av endotelial celleproliferasjon, så vel som PPARa-avhengig nedregulering av cytokrom P450, noe som resulterer i inhibering av neoangiogenesis [29], [30]. På den annen side har aktivering av PPARa er vist å øke spredningen i brystkreftcellelinjer [11]. Videre langsiktig forvaltning av PPARa agonister forårsaket leverkreft hos gnagere [31], og
Pparα-
null mus var resistente mot leverkarsinogent effektene av PPARa agonister [31], [32]. Disse data viser at PPARa spiller en rolle i pleiotropisk kreft, men om den fungerer som en tumor suppressor eller et oncoprotein synes å være sterkt avhengig av krefttype eller celletype.
Som grunnlag for denne studien vi har nylig oppdaget en metabolsk signatur av RCC i mus xenopodet med humane RCC (Caki-1) celler [12]. Vår studie er støttet av en annen i urin kreft sammenligne mRNA og miRNA profilering, som viste dokumentert av en beriket PPARa sti i RCC, men ikke i blærekreft [33]. Selv om disse studiene støtter en onkogen effekt av PPARa i RCC, har de molekylære mekanismene for tumordannelse ved PPARa og en potensiell terapeutisk tilnærming av PPARa hemming ikke blitt evaluert i RCC. I den foreliggende undersøkelse viser vi for første gang at PPARa antagonisme demper RCC cellevekst gjennom G0 /G1 fasecellesyklus-stans og induksjon av apoptose assosiert med redusert CDK4, cyklin D1, og c-myc nivåer.
mens det har vært studier som viser oppregulering av PPARa relaterte metabolitter [12] og gener [33] i RCC, ingen studier har vist endring av selve PPARa protein nivåer forbundet med tumorigenesis. I denne studien viser vi økt PPARa nivåer på høygradig RCC vev vs lav karakter vev, noe som tyder på at PPARa protein nivåer er assosiert med aggressivitet RCC. Fordi PPARa regulerer fettsyre oksidasjon (FAO) gjennom dens target gentranskripsjon [34], og i lys av det faktum at karakteren avhengige forandringer av energibanene (inkludert FAO) proteiner er blitt rapportert [35], er det mulig at PPARa minst spiller delvis en rolle i aggressivitet og energi metabolisme forskjeller som en funksjon av karakter i RCC. Denne muligheten er støttet av funn at lavgradig RCC celler har mer omfattende klart cytosol, som består av lipid og glykogen, enn høyere grad celler [14], [36].
For å vurdere om PPARa er en levedyktig potensielt terapeutisk mål for avansert RCC, analyserte vi effekt av PPARa antagonisme anvendelse av en spesifikk antagonist PPARa, GW6471, i RCC-cellelinjer. Våre data viser for første gang at en slik manipulering forårsaket G0 /G1 cellesyklus-stans, så vel som induksjon av apoptose. Det er mulig at disse hendelsene er relatert til energiomsetning forandringer som har blitt godt undersøkt i normale celler og i mange sykdommer, innbefattende kardiovaskulære sykdommer og kreft, hvori PPARa er blitt foreslått som et terapeutisk mål [10], [17], [ ,,,0],37], [38]. Så vidt vi vet, er vår første studien som viser cellesyklus arrest etter PPARa hemming i RCC.
PPARa antagonisme av både GW6471 og en bestemt siRNA viste nedgang i c-myc, cyclin D1, og CDK4. Disse funnene støttes av en studie som viste økning av c-myc, cyclin D1, og CDK4 protein [39] PPARa-avhengige av PPARa agonist WY-14643 i villtype mus leverceller, men ikke i PPARa null-celler. Den cellulære proto-onkogen,
c-myc, etter er forbundet med et utvalg av humane kreftformer og er sterkt implisert i kontrollen av celleproliferasjon, programmert celledød, og differensiering [40]. PPARa har vist seg å stabilisere c-Myc-proteinet gjennom undertrykkelse av la-7c miRNA [41]. Det er således mulig at dempningen av c-Myc-proteinet i RCC-celler ved PPARa antagonisme var gjennom økt la-7c som resulterer i redusert stabilitet i c-Myc. Cyklin D1 /CDK4 kompleks fremmer cellesyklusprogresjon gjennom fosforylering av dets substrat, inkludert pRb (oversikt i [42]). Demping av c-Myc undertrykker cyclin D1 /CDK4 ekspresjon og aktivitet ved G1 /S overgang [43], [44]. Disse funnene tyder på at vår observasjon at PPARa hemming resulterer i redusert c-myc nivåer kan forklare nedgangen i cyclin D1 /CDK4 og dermed forårsake den observerte cellesyklus arrest i G0 /G1 i RCC celler.
En betydelig finne fra vår studie var at PPARa hemming ikke bare arrestert cellesyklusen, men også forårsaket apoptose i RCC celler. Interessant nok har CDK4 inhibering blitt rapportert å indusere apoptose [45] ved å forårsake at translokasjon av rela, hovedbestanddelen av NFkB, fra cytoplasma til nukleoplasma og deretter til den kjerne som resulterer i undertrykkelse av anti-apoptotiske proteinproduksjon med Survivin. Fordi vi observert dyp CDK4 hemming etter PPARa antagonisme, er det mulig at PPARa hemming-indusert apoptose var et resultat av CDK4 demping minst i RCC celler.
For ytterligere å utvide mulighetene for PPARa hemming som en terapeutisk tilnærming, vi har søkt kombinasjonsbehandlinger som øker effekten av PPARa antagonist. Siden en av rollene til PPARa innebærer å øke FAO [10] samt avtagende glykolyse på transkripsjons og funksjonsnivåer som fører til en reduksjon av pyruvat og laktatproduksjon [17], har vi antatt at PPARa antagonisme kan resultere i økt avhengighet av cellene på glykolyse grunn av demping av FAO. Våre funn at effekten av GW6471 var signifikant høyere i glukose-fattige medier enn de vanlige media ytterligere bekreftet denne antakelse og videre foreslått at den synergistiske effekten av PPARa antagonist og 2-DG kombinasjonsbehandlingen var spesielt på grunn av hemming av glykolyse og ikke til off-target effekter av 2-DG. Videre støtter dette funnet fremtiden evaluere dobbel therapeutics som kan brukes samtidig og dermed angripe RCC på sitt akilleshæl av energiomsetningen.
Våre funn at NHK celler viste lignende endringer under disse forholdene bør være herdet av flere problemer . Først oppførselen til alle cellelinjer, spesielt celler som hevdes å være «normal», må evalueres i deres in vivo sammenheng før bastante konklusjoner kan trekkes om deres atferd, på grunn av slike spørsmål som stromal celle innflytelse samt cytokin slipp og andre autokrine påvirkninger. For det andre administrering av GW6471 i en kaninmodell (4 mg /kg som en bolusinjeksjon IV-injeksjon) [46] gav ingen grove endringer i nyre eller endringer i urinmengde, sammenlignet med kontrolldyrene etter 5 timer (Christopher Lotz, personlig kommunikasjon ).
i konklusjonen, viser vi her for første gang at (1) PPARa er oppregulert i høy klasse RCC vev sammenlignet med lav grad av vev, (2) PPARa hemming demper RCC celleviabilitet gjennom c-myc, CDK4 og cyclin D1 nedgang mediert cellesyklus og apoptose induksjon, og (3) glykolyse hemming synergizes med PPARa mot celle levedyktighet. Samlet utgjør disse dataene tyder PPARa hemming som en roman terapeutisk tilnærming for avansert RCC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Glukose uttømming synergi med PPARa antagonist skjer i primær normal menneskelig nyre epitel (NHK) celler. NHK-celler ble behandlet med 2-DG og underkastes ingen glukose medier som beskrevet i fig. 7. Dataene som vises, er representative for minst tre gjentagelser. ** Synergistisk effekt sammenlignet med hver behandling for seg. Feilfelt angir standardavvik
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071115.s001 plakater (TIFF)
