Abstract
Formål
Det er behov for å supplere eller erstatte den konvensjonelle diagnostiske verktøy, nemlig cystoskopi og B-type ultralyd, for blærekreft (BC). Vi forsøkte å identifisere nye DNA metylering markører for BC gjennom genom-wide profilering av BC cellelinjer og påfølgende metylering spesifikke PCR (MSP) screening av kliniske urinprøver.
Experimental Design
metyl DNA-bindende domene (MBD) fangst teknikk, methylCap /seq, ble utført for å screene for spesifikke hypermethylated CpG øyer i to BC cellelinjer (5637 og T24). Den øverste hundre hypermethylated målene ble sekvensielt screenet ved MSP i urinprøver til gradvis å begrense målnummeret og optimalisere sammensetningen av den diagnostiske panelet. Den diagnostiske utførelsen av den oppnådde panelet ble evaluert i ulike kliniske situasjoner.
Resultater
I alt 1.627 hypermethylated promoter mål i BC cellelinjer ble identifisert av Illumina sekvensering. De øverste 104 hypermethylated målene ble redusert til åtte gener (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, og LMX1A) etter urinen DNA screening i et lite utvalg på åtte normal kontroll og 18 BC fag. Validering i et uavhengig utvalg på 212 BC pasienter aktivert optimalisering av fem metylering mål, inkludert VAX1, KCNV1, TAL1, PPOX1, og CFTR, som ble oppnådd i vår forrige undersøkelse, for BC diagnose med en sensitivitet og spesifisitet på 88,68% og 87,25 %, respektivt. I tillegg ble metylering av VAX1 og LMX1A funnet å være assosiert med BC tilbakefall.
Konklusjoner
Vi identifiserte en lovende diagnostisk markør panel for tidlig non-invasiv påvisning og påfølgende BC overvåking.
Citation: Zhao Y, Guo S, Sun J, Huang Z, Zhu T, Zhang H, et al. (2012) Methylcap-Seq avslører nye DNA metylering Markører for diagnostikk og Tilbakefall Prediksjon av blærekreft i en kinesisk befolkning. PLoS ONE 7 (4): e35175. doi: 10,1371 /journal.pone.0035175
Redaktør: Angela H. Ting, Cleveland Clinic Foundation, United States of America
mottatt: 06.01.2012; Godkjent: 09.03.2012; Publisert: 17 april 2012
Copyright: © 2012 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science foundation tilskudd (30872963); Staten Key Laboratory av onkogener og relaterte gener foundation (91-11-01); Medisinsk guide prosjekt fra Science and Technology Commission av Shanghai (114119a4100); Shanghai Science Foundation tilskudd (09ZR1429900); og Shanghai Cancer Institute, master doktorgrads foundation (SB09-07). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet og den sjette vanligste kreftformen i verden [1]. I Kina var forekomsten av BC fortsetter å stige [2]. BC forekomsten øker med alderen; gjennomsnittlig alder ved diagnosetidspunktet er ca 60 år, og det er 3 ganger mer vanlig hos menn enn hos kvinner [3]. Røyking og eksponering for kreftfremkallende har blitt identifisert som risikofaktorer [4]. Omtrent 75-80% av nye BC tilfellene oppstår som overfladisk eller carcinoma
in situ
lesjoner, mens de resterende 20-25% til stede som en mer avansert sykdom, med en dårlig prognose. Men selv i de overfladiske svulster, bare 20% er helbredelig. Omtrent 60-70% av pasientene vil få tilbakefall i løpet av 5 år, og 10-20% av tumorer vil utvikle seg til en mer aggressiv sykdom [5], noe som nødvendiggjør hyppig overvåking av tilbakefall av sykdommen [6]. Cystoskopi er den mest vanlig diagnostisk prosedyre BC, og det viser høy følsomhet (SN) og spesifisitet (SP). Imidlertid krever cystoskopi ferdighet høy operatør, og invasiv natur cystoskopi reduserer sin verdi som et screeningverktøy. Andre optimale metoder er nødvendig for tidlig, ikke-invasiv påvisning og overvåking av BC.
epigenetisk fasett av genomet forbinder genotype av en person til miljømessige påvirkninger som former arve gentranskripsjon mønster og derfor påvirke fenotypen av cellen [7]. Regulering på epigenetisk nivå er kritisk for utvikling av høyere eukaryoter [8], og avvikende regulering kan direkte og /eller indirekte å påvirke den genetiske integritet og genekspresjon mønster av celler, noe som resulterer i utviklingen av forskjellige typer lidelser, inkludert kreft [ ,,,0],9]. Den lokale hypermethylation av tumor-suppressor-gener [10] og det globale hypometylering av genomisk DNA [11], [12], [13] ofte forekommer i humane cancere [14], [15]. Nylige fremskritt har vist at det unormale hypermethylation av tumor-suppressor gener er en ny biomarkør for kreft diagnose og prognose. I BC har flere denaturert gener er identifisert, og deres rolle som urin markører er også vurdert [16]. Disse studier har klart vist at fordelene ved bruk av multippel-genet hypermethylation analyser i vev og urinprøver for å oppnå diagnostisk og prognostisk informasjon. For eksempel, i vårt tidligere studie har vi identifisert et panel av 11 denaturert gener som kan brukes som urin-baserte markører for BC screening; men dette panel hadde begrensninger. Genet tall i panelet var for stor for praktisk klinisk testing, og spesifisiteten var utilstrekkelig [17]. For å forbedre effektiviteten av diagnose og identifisere genet mål som kan forutsi tilbakefall eller progresjon, er det nødvendig å finne nye mål og validere deres kliniske verdi i en stor kohort. Men så langt har få BC studier brukt en genomisk skala høy gjennomstrømming tilnærming til skjermen for differensielt denaturert gener [18], [19]
MethylCap-seq er en nylig utviklet teknikk for genom-wide profilering av DNA metylering; Denne teknikken består i å fange de metylerte DNA-fragmenter ved deres metyl-CpG-bindende domener (MBDs) og den etterfølgende dype sekvensering av DNA eluert. En salt-gradient klassifiserer genomet i fraksjoner med ulike metylering stater. Resultatene oppnådd på denne måte profiler gir en detaljert genom-wide kart over denaturert regioner og tillate påvisning av DNA-metylering i forskjellige genomiske regioner [20].
genomiske sammenheng definert som de som finnes i UCSC databasen. Den inneholdt differensial metylering region (DMR) fordeling i BCC og BM: (A) generell distribusjon; (B) fordeling i refGene; (C) distribusjon i både refGene og CGI.
I denne studien, vi først ansatt MBD MethylCap-seq å få en samlet metylering profilen til BC cellelinjer (BCC), som vi trodde ville gi informasjon om BC-spesifikke avvik metylering. Deretter ble DNA fra urinen til BC pasienter screenes for de 100 hypermethylated mål fra BCC å identifisere BC-spesifikke metylering nettsteder. Dette tallet gradvis redusert, og markøren kvaliteten bedre i løpet av screening prosesstrinn. Til slutt kjøpte vi en roman sett av diagnostiske DNA metylering markører som kan brukes for tidlig, ikke-invasiv påvisning og overvåking av BC.
Materialer og metoder
Pasient og kontrollutvalget samling
med informert samtykke og godkjenning av medisinsk Institutional Review Board of Zhongshan Hospital, Fudan University, urinprøver ble samlet inn fra 212 pasienter med en bekreftet BC diagnose, 41 pasienter med noncancerous urin lesjoner på sykehus i løpet av samme tidsperiode, og 149 normale kontroller. En gruppe av sammenkoblede annullert urinprøver ble også samlet inn fra de 21 BC pasienter før og etter operasjonen som inkluderte transuretral reseksjon av blærekreft pluss intravesikal kjemoterapi (TURBC + IC). I tillegg ble en annen gruppe av 48 urinprøver samlet inn fra pasienter sterkt mistenkt for å ha en ondartet svulst blære. Alle BC pasienter og kontroller kom fra to sykehus: den Urologi avdeling ved Zhongshan Hospital, Shanghai, Kina og nr 2 Shimen Gate Community Health Center, Jingan District, Shanghai. Prøvene ble samlet inn mellom 2006 og 2009. tumor-node-metastaser (TNM) staging /klassifisering av BC pasientprøver ble bestemt i henhold til amerikanske Joint Committee on Cancer retningslinjer [21] (tabell 1). Prøvene (50 ml frisk urin) ble sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble deretter dekantert, og pelleten ble vasket en gang med en × fosfatbuffer saltvann (PBS) og umiddelbart frosset ved -80 ° C.
Wig bilde fra UCSC databasen ligger på venstre side, og BSP resultat hvor minst 5 kloner ble sekvensert for hvert locus er på høyre side. Den svarte sirkelen indikerer metylert C i CpG sammenheng; den hvite sirkelen indikerer unmethylated C i CpG sammenheng
Cellelinjer og normal blæreslimhinnevevet
To BCC, T24 (ATCC No: HTB-4). og 5637 (ATCC Nei : HTB-9), ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket inntil de nådde logaritmisk fase i L-DMEM-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en 5 % CO
2 fuktet inkubator. Cellene ble høstet ved skraping, og cellepelletene ble vasket to ganger med 1 x PBS. To normale blære slimhinnevev (BM1 og BM2) ble erholdt fra friske organdonorer. Av økonomiske årsaker ble de to BCC samles for å konstruere BCC bibliotek, som var de to BM prøver. På denne måten kan vi skaffe alt av metylering informasjon fra hver av de 2 prøvene.
MBD methylCap-seq informasjonen ble brukt til å velge gener differensielt hypermethylated i blærekreft. Prøven tall i figuren refererer til den for screening prosessen. Metyleringen status for mål-genet ble vist i prøver med forskjellige størrelser. I denne fasen, antall prøver gradvis økt, mens antall gener gradvis redusert.
MBD-methylCap-sekvense
En DNA-preparat fra frosne vev og cellelinjer ble generert ved hjelp av en konvensjonell proteinase K /organisk ekstraksjon metode som tidligere er beskrevet [22]. Like mengder av DNA fra 5637 og T24 cellene ble slått sammen for å danne BCC-biblioteket, og like mengder av DNA fra BM1 og BM2 cellene ble slått sammen for å danne BM biblioteket. I 1,5 ml sentrifugerør, 1,5 pg av de kombinerte DNA-prøvene (BCC eller BM) i 100 ul TE-buffer ble ultralydbehandlet for å gi det ønskede størrelsesområdet (200-300 bp). End-reparasjon, adenosin basen addisjon og adapter ligeringstrinn ble utført som tidligere beskrevet [23].
Den kommersielle MethylMiner ™ denaturert DNA Enrichment Kit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) ble brukt til å velge metylert DNA for sekvensering. For hver gruppe, ble 1,2 ug av det behandlede DNA behandlet i henhold til produsentens protokoll. Etter en NaCl gradient, samlet vi de to siste fraksjoner av høyt metylert DNA, noe som tilsvarte en M og 2 M NaCl konsentrasjoner. Den pigg-DNA kontroll leveres av kit ble anvendt for å bekrefte nøyaktigheten av analysen. Det gjenvunne DNA (i nanogram-området) ble kvantifisert ved qubit ™ (Invitrogen), og 12 sykluser med PCR-amplifikasjon ble utført for å oppnå nok materiale (i mikrogram området) for dyp sekvensering. Til slutt ble 1 pg av PCR-produktet påføres på Genome Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA) for å generere 75 bp-lange uparede leser. PCR duplikater ble fjernet fra analysen. Vi brukte BWA justeringsverktøy med standardinnstillingene for å kartlegge disse leser til hg19 menneskelige genom henvisning enheten (UCSC) [24]. Deretter ble toppene (hypermethylated regioner) identifisert ved hjelp av MACS programvare [25], og de menneskelige CpG øyer (CGIer) ble lastet ned fra UCSC database. Den genomisk metylering profil genereres ble lastet opp til en offentlig database (Gene Expression Omnibus: GSE 33839)
MSP og BSP
Bisulfite konvertering og PCR-analyse ble utført som tidligere beskrevet [22] . Den bisulfite sekvensering PCR (BSP) og metylering spesifikke PCR (MSP) primerpar ble utformet med hjelp av egnet programvare på nettet (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html; Tabell S1, Tabell S2). De MSP produkter ble klonet og verifisert ved sekvensering.
in vitro
metylert DNA fra 5637 og T24-celler ble oppnådd med CpG metyltransferase M. Sss I (NEB) og anvendt som en positiv kontroll. Vann ble anvendt som en ikke-templat kontroll. Bisulfitt-sekvensering ble utført som tidligere beskrevet [17], og PCR-amplikoner ble gelrenset og klonet inn i en pBS-T II vektor (TianGen Incl., Beijing, Kina). Minst 5 klonene ble individuelt sekvensert for å fastslå metylering mønstre av det målrettede locus. BSP metylering prosent ble beregnet som antall denaturert cytosines dividert med det totale antall cytosines i alle de amplikonene analysert.
statistikker
De store statistiske punktene i denne studien involverte sammenligne metylering statusene gener antas å være forbundet med BC og deres relevante kliniske variabler i styre og kreftpasienter. Tilstedeværelse eller fravær av metylering ved bruk av MSP ble evaluert for å bestemme sammenhengen mellom metylering status og kreft eller dens kliniske variabler ved hjelp av krysstabeller og den passende χ
2 eller Fishers eksakte t-tester. Foreningen av BC tilbakefall med genet metylering og kliniske variabler ble vurdert ved hjelp av uni- og multivariate logis regresjonsanalyser. Utfallet valgt for oppfølging analysen var den kumulative fare for gjentakelse, som ble definert som tiden fra BC diagnose til datoen for svulst gjentakelse. Uni- og multivariate Cox modeller ble brukt for å vurdere effekten av genet metylering og andre kliniske variabler av tilbakefall av sykdommen. Den kumulative tilbakefall fare kurve ble generert av Kaplan-Meier metoden og verifisert av log-rank test. Alle de statistiske beregningene ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvarestatistikkpakke (SPSS Inc., Chicago, IL). To-sidig P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
En multippel univariate logistisk regresjon ble utført med bruk av metylering data for 9 gener for å evaluere forholdet mellom genet metylering og clinicopathological egenskapene til BC. Detaljene er beskrevet i teksten. * P. 0,05
Resultater
Genomisk metylering profilering av BCC og BM bibliotekene åpenbart karakteristiske metylering mønstre i BC
Vi profilert genome- bred DNA metylering status for BCC og BM bibliotekene ved å generere MBD-methylCap-beriket DNA-biblioteker. De MBD-anrikede fraksjoner ble utsatt for high-throughput sekvensering ved hjelp av en Illumina Genome Analyzer II for å oppnå helhet metylering kart. Konseptuelt ble hypermethylated DNA-fragmenter anriket i biblioteket byggeprosessen; Derfor leser ervervet sekvense overens med hypermethylated regionene på genomet. Deep sekvensering av de preparerte BCC og BM bibliotekene produserte cirka 6 millioner leser (75 baser /lese) for hvert bibliotek, som ble hentet fra cirka 470 millioner baser (Tabell S3). Denne mengden av sekvenserings-baser kan dekke det genomiske CGI i løpet av ca. 10 ganger dybden. Dermed setter data hell gitt genom-wide informasjon.
Når disse leser ble kartlagt i genomet, den ujevne fordelingen dannet toppene som representerer de hypermethylated regioner av genomet. Totalt fikk vi 210,051 topper (gjennomsnitt lengden på topper: 778 BP) i BCC og 229,538 topper (gjennomsnittlig lengde på toppene: 659 bp) i BMS (
P
0,001, MACS2.0; Tabell S3).
For å oppnå den relative metylering informasjon, sammenlignet vi toppene mellom BCC og BMS. Nesten to tredjedeler av de totale toppene var felles mellom de to bibliotekene, og vi ignorerte dem for denne analysen. Den gjenværende en tredjedel av toppene var unike for enten BCC eller BMS, som vi har betegnet den differensielt-metylert regioner (DMRs) som representerer den relativt høye metylering status av de genomiske regioner sammenlignet med dens motstykke. Vi fikk 70,432 og 83,690 DMRs i BCC og BMS, henholdsvis (tabell S3, figur 1 A). Denne store mengden av DMR ble spredt innenfor ulike genomiske sammenhenger, og vi analyserte foreningen av DMR med de ulike genomiske sammenhenger. Den refGene relaterte DMR var 55 237 og 45 522 i BCC og BMS, henholdsvis, noe som indikerer en omtrent balansert fordeling i begge bibliotekene (tabell S3, figur 1 B). Men når DMRs innenfor CGIer ble undersøkt, fant vi at BCC beholdt 21,179 DMRs, mens BMS beholdt bare 1945; Dette representerer en ti-gangers forskjell. Når DMRs som oppstod i CGIer av refGene ble studert, de BCC og BMS inneholdt 4,256 og 201 DMRs for hvert bibliotek, henholdsvis. Til slutt, når arrangøren engasjement ble beregnet, ble 1.627 og 66 DMRs forbundet i denne regionen i BCC og BMS, henholdsvis (tabell S3, figur 1 C). Til sammen avvik hypermethylation forekom oftere i CGIer og promotorområdene på BCC. Følgende studier av metylering markør utvalget fokusert på BCC arrangører.
Validering av den distinkte BCC metylering profil ved hjelp bisulfite sekvense
For å bekrefte at biblioteket nøyaktig reflekterte den reelle metylering status for studert materialet valgte vi 24 forskjellige hypermethylated mål for bisulfite sekvense verifisering. Av disse ble 22 mål spredt innenfor de 1.627 promoter-relaterte DMRs i BCC, inkludert 17 fra de 100 målene og 5 fra 100 til 1627 serien; de andre 2 mål var fra 66 DMRs i BMS. Oppmuntrende, blant de 24 målene som blir bekreftet, BSP resultatene av 23 gener var svært konsistent med metylering informasjon som erverves i biblioteket (et representativt resultat er vist i figur 2, tabell S4), noe som tyder på at BCC og BM bibliotekene var svært pålitelig for metylering informasjon. For å vurdere potensialet i biblioteket for å foreslå kliniske diagnostiske mål, vi søkte metylering informasjon om mål identifisert i vårt tidligere arbeid i disse to bibliotekene [17]. Totalt 90% (19/21) av disse målene ble hypermethylated i BCC biblioteket (data ikke vist). I tillegg har vi også undersøkt BC-spesifikke markører rapportert av andre [19], [26]. Åtte av de 9 målene ble plassert i vår BCC bibliotek som hypermethylation loci. Til sammen dagens BCC og BM bibliotekene gitt lyd hypermethylation informasjon med hensyn til BC status.
MSP screening på en liten kohort av urinprøver for potensielle biomarkører generert 8 genet mål
Presentert med stor avvik metylering informasjon fra methyCap-seq, vi trengte en metode for å filtrere BCC metylering resultatene til å identifisere mulige BC markører. Vi vedtatt strategi begynner screening prosessen med et stort antall mål i noen få prøver og gradvis redusere målene med en økning i prøvene (figur 3). Når det utsettes for MSP begrensninger, bare den øverste 104 av 1.627 hypermethylated promotorene av BCC ble screenet i urinen DNA-prøver fra 8 normale kontroller (BNS); de samme BCC og BM prøver som brukes i MethylCap-seq del av undersøkelsen ble inkludert som kontroller. Under disse betingelser, vil bare de mål som viste metylering i det minste en av de to BCC, men ikke i mer enn to av de åtte BN fortsatte til den neste screening (en representativ MSP Resultatet er vist i figur S1). Fordi de ikke oppfyller disse kriteriene, ble 55 mål fjernet fra den første runden av screening. Førti-ni mål gikk videre til andre runde av urin DNA screening fra ytterligere 8 BNS og 18 BC pasienter. Vi valgte de målene som viste metylering i minst tre av de 18 BC prøvene, men 0 eller 1 av de 8 BN prøvene. I denne fasen, 8 gener (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, og LMX) oppfylt vilkårene og ble valgt for deres potensial til å diskriminere BC fra BN (figur 3).
Assessment av diagnostisk verdi av de 8 mål i en stor kohort
for å sikre at ble evaluert pålitelig potensialet i BC kandidat målene vi vist de 8 kandidatene i en uavhengig test kohort med en stor utvalgsstørrelsen. Vi fikk urinprøver fra en stor kohort (n = 402) som inkluderte 212 BC pasienter, 149 normale kontroller, og 41 pasienter med noncancerous urin lesjoner.
metylering frekvensen av de 8 nye gener i urinen DNA fra BC pasienter (212 tilfeller) varierte fra 9,43% til 42,45%, mens metylering frekvensen i normale kontroller (149 tilfeller) varierte fra 1,34% til 6,04%. Alle 8 mål viste en signifikant forskjell mellom de svulster og normale kontroller (
P
0,0001)., Som gunstig argumenterte for sitt potensial bruk som diagnostiske markører (tabell 2)
For å skille tumor -spesifikk metylering fra mulig metylering forbundet med benign sykdom, ble 41 noncancerous urin lesjoner inkludert i vår studie (tabell 1 og 2). Metylering frekvens av de 8 gener hos denne pasientgruppen varierte fra 0,00% til 12,19%, støtter ideen om at opprinnelsen til hypermethylation ble tettere knyttet til svulster enn godartet sykdom (
P
0,04; Tabell 2). Derfor kan disse 8 mål som potensielt tjene som markører for klinisk påvisning av BC og å skille BC fra friske kontrollpersoner og godartede urin lesjoner.
Gitt den heterogene natur svulst metylering, kan en enkelt metylert markør ikke gir tilstrekkelig SN og SP for tumor-diagnostikk [27]. Derfor kombinerer en gruppe gener som et panel var et alternativ [28]. Tar arealet under kurven (AUC) som en dom av diagnostisk evne, en kombinasjon av 4 gener (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1) ble valgt for å danne et diagnostisk panel, som viste en SN på 76,89% og SP på 88,59% (tabell S5).
for ytterligere å forbedre den diagnostiske potensialet i dette panelet, la vi CFTR og SALL3, de to øverste BC mål fra vårt tidligere arbeid [17], som ble også ligger innenfor de 1.627 arrangører knyttet til DMRs i BCC. CFTR oppviste bart potensiale for diagnostisering av BC, med en SN og SP på 52,36% og 96,64%, henholdsvis (tabell 2). Men SALL3 ikke presentere en god SP i en stor kohort evaluering og ble derfor fjernet (data ikke vist). Til slutt ble en 5-gen panel (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1 og CFTR) vedtatt som avslørte diagnostiske effektivitet, med SN, SP, positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) på 88,68%, 87,25% , 90,82% og 84,42%, henholdsvis (tabell 2). De tilsvarende resultater ble også obtaind i en selvstendig liten kohort validering analyse besto av 24 BC og 22 kontroller (data ikke vist).
Den diagnostiske evne til fem-genet panel kan sammenlignes med cystoskopi
Utførelsen av de fem målene i evalueringen av mistenkte kliniske pasienter er kritisk. Derfor brukte vi MSP å vurdere urinen til pasienter som hadde mistanke uroepithelial maligniteter. Av de 48 pasientene ble 32 BC pasientene til slutt bekreftet ved systoskopi, og 25 av disse var MSP-positive for minst ett av de fem gener. Av de 16 pasientene som ikke viser malignitet ved cystoskopi, 14 var negative for MSP. Derfor 5-genet målet viste god overensstemmelse med cystoskopi (81,25%, 25 positive og 14 negative i alt 48 pasienter av begge prosedyrer).
De fem-genet panel kan også forutsi effekten av kirurgisk reseksjon
Alle 21 (100,0%) av BC pasientene var MSP-positive i minst ett av de 5 gener før operasjonen, mens bare to av de 21 (9,5%) BC pasienter beholdt MSP-positive genetiske loci etter operasjonen (
P
0,0001). Disse resultatene legge ekstra støtte til våre tidligere funn og hypotese [17] og bekrefte ideen om at et nært forhold eksisterer mellom metylering observert i urinsediment og tilsvarende blære svulst.
Den hypermethylation av VAX1 og LMX1A er viktig for å forutsi kreft tilbakefall
i tillegg til forholdet mellom genet metylering status og den ondartede fenotype av selve svulsten, vi også studert assosiasjonen mellom metylerte mål og ulike kliniske parametere.
multiple univariat logistisk regresjonsanalyse av 9 genet mål (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, LMX1A og CFTR) viste at VAX1 og LMX1A metylering var mer vanlig i urinprøver fra tilbakevendende tilfeller enn i prøver fra primær tilfeller i den innledende analyse av 212 BC pasienter (primær: 157; tilbakefall: 55), med HR = 2,37 (KI 95%, 1,27 til 4,44, P 0,05) og HR = 2,59 (KI 95%, 1,01 til 6,65, P 0,05 ), respektivt (figur 4). Multivariate logis regresjonsmodeller avdekket at HR for VAX1 og LMX1A var 2,27 (95% KI, 1,20 til 4,32;
P
= 0,047) og 2,63 (95% KI, 1,01 til 6,85;
P
= 0,012), henholdsvis (tabell 3). Og foreningen var mer tydelig når disse to genene ble analysert i kombinasjon med HR på 4,73 (95% KI, 1,39 til 16,08;
P
= 0,013). Den nære tilknytningen av disse to gener med tilbakefall var tydelig i oppfølgingsdata basert på 145 tilfeller (ingen gjentakelse: 108; tilbakefall: 37) med intakt oppfølging informasjon. Multivariat Cox proporsjonal fare modeller viste at HR for VAX1 og LMX1A var 2,11 (95% CI, 01.08 til 04.11;
P
= 0,029) og 3,31 (95% KI, 1,27 til 8,59;
P
= 0,014; tabell 4), henholdsvis. Kombinasjonen av de to genene viste en mer høy HR på 7,25 (95% KI, 2,41 til 21,79;
P
= 0,014). Videre Kaplan-Meier plott avslørte at den kumulative fare for tilbakefall i metylert og unmethylated VAX1 og LMX1A signifikant forskjellig (
P
= 0,034 og
P
= 0,013, henholdsvis). Mer sigficance ble oppnådd når VAX1 og LMX1A analysert sammen (
P
0,0001, figur 5). Validerings i en liten uavhengig kohort besto av 24 BC og 22 kontroller avslørte den samme tendensen med HR 9,11 (95% KI, 0,89 til 93,7,
P
= 0,063) for de to genet kombinasjon med marginal betydning eie til den lille utvalgsstørrelse kanskje (data ikke vist). Disse observasjonene understreker viktigheten av å bestemme metylering status for VAX1 og LMX1A for prognosen for tilbakefall av sykdommen.
I additioin til LMX1 /VAX1, Vi har også forsøkt å vurdere involvering av de andre 7 gener i formatet to -Gene par kombinasjon. Den hypermethylation status i noen av disse genene viste høy sammentreff med BC tilbakefall, men denne foreningen kan ikke opprettholdes i analysen av oppfølgingsdata. Derfor avvik metylering i disse genene kan være resultatet snarere enn satt av BC tilbakefall.
metylering status for ECEL1 og TMEM26 var signifikant relatert til en høy grad av tumor differensiering, med HR = 2,43 (95% CI, 1,19 til 4,97; P = 0,01) og 2,32 (95% KI, 1,11 til 4,85;.
P
= 0,03), henholdsvis (figur 4), noe som tyder på at de er involvert i BC malignitet og progresjon
Diskusjoner
i denne studien, rapporterte vi detaljene etablere biomarkører knyttet til BC metylering, som er som følger: (i) den globale metylering profilen til både BCC og BM av MBD methylCap-seq ; (Ii) avvikende DNA-BC-metylering kart gjennom sammenligning av metylering profilen til BCC med BM; (Iii) et panel av lovende metylering mål som er spesifikke for BC; (Iv) to informative genet mål informative for BC gjentakelse; og (v) to metylering gener assosiert med BC histologisk differensiering.
Etablert kreftcellelinjer er generelt forventet å dele mange (om ikke alle) genetiske og epigenetiske funksjoner med svulster
in vivo
, og kreftcellelinjer er mye brukt til tumorgenese studier. En studie av human kolorektal kreft funnet at seks cancercellelinjer hadde metylering mønstre som var meget lik den primære tumor med hensyn til 60 metylering gen målene [29]. Derfor begynte vi vår genome-wide metylering profilering med BCC og brukt den kliniske prøven screening for å samle BC-spesifikke metylering informasjon.
Kaplan-Meier beregninger av tilbakefall overlevelse i oppfølgingen kohort av 145 pasienter i henhold til tilstedeværelsen av metylert VAX1 og LMX1A (A og B). VAX1 eller LMX1A metylering var signifikant assosiert med dårlig prognose for BC pasienter (p = 0,034 og p = 0,013, henholdsvis). Analyse av to gener kombinert viser mer statisk effekt (P 0,0001).
Mange gener har blitt rapportert å være hypermethylated i BC. Nylig har studier med nye screening tilnærminger, for eksempel metylering arrays, identifisert metylering markører med høy SN og SP [30], [31], [32]. Dette genomisk screening tilnærmingen gir en effektiv og pålitelig fremgangsmåte for å etablere en avvikende metylering profil assosiert med sykdom. Vi vedtok MBD methylCap-seq teknikk i våre studier fordi det er en åpen plattform for romanen metylering loci uten forutgående lokal sekvens kunnskap. Derfor skjermet vi BCC og sammenlignet dem med SD-anlegg for å forsøke å avdekke avvikende BC metylering informasjon.
I tillegg til genet arrangøren metylering status, fikk vi den samlede genom-wide metylering profilinformasjon, som omfatter ulike genomiske sammenhenger , slik som forsterkere, nedstrøms regulatorer, den 5’UTR, eksoner, introner og microRNAs. Gyldigheten av de komparative metylering statusene ble bekreftet av BSP og MSP. Dette representerer flere DNA-metylering informasjon for forskjellige genomiske kontekst funksjoner enn matrise metode, som er begrenset av probesekvenser.
En diagnostisk fremgangsmåte med høy SN og SP er viktig for en hvilken som helst klinisk relaterte test. Det har vært flere rapporter om metylering profileringen av urinsedimenter for påvisning BC [17], [19], [26], [33], [34], [35], [36]. Teknikkene som brukes i disse studiene omfatter konvensjonell MSP, qPCR, nestet-MSP, og MethyLight. De diagnostiske markør Panelene er vanligvis sammensatt av 3 til 11 gen mål som varierer i SN fra 77% til 94% og SP fra 67% til 100% (tabell S6).
