Abstract
Aberrant aktivering av Wnt /β-catenin veien er kritisk for initiering og progresjon av de fleste tykktarm kreft. Denne aktiveringen provoserer opphopning av kjernefysisk β-catenin og induksjon av dets målgener.
Apc
min /+
mus er den mest brukte modellen for tykktarmskreft. De havn en mutert
Apc
allel og utvikle intestinal adenomer og karsinomer i løpet av de første månedene av livet. Denne fenotype er forårsaket av mutasjon av den andre
APC
allel og den derav følgende akkumulering av kjernefysisk β-catenin i de berørte celler. Her beskriver vi at vitamin D reseptor (VDR) er en viktig modulator av atom β-catenin nivåer i tykktarmskreft
in vivo
. Ved riktig avl av
Apc
min /+
mus og
VDR
+/-
mus har vi generert dyr uttrykker et mutert
Apc
allel og to , en eller ingen
VDR
villtype alleler. Mangel på
VDR
økt antall kolon Aberrant Crypt Foci (ACF), men ikke som adenomer eller karsinomer i enten tynntarmen eller tykktarmen. Viktigere, tykktarm ACF og svulster
Apc
min /+ VDR
– /-
mus hadde økt kjernefysisk β-catenin og svulstene nådd en større størrelse enn de av
Apc
min /+ VDR
+ /+
. Både ACF og karsinomer i
Apc
min /+ VDR
– /-
mus viste høyere uttrykk av β-catenin /TCF målgener. I tråd med dette,
VDR
knock-down i dyrkede humane tykktarmskreftceller forbedret β-catenin atom innhold og mål genuttrykk. Konsekvent,
VDR
utarming avskaffet kapasitet på 1,25 (OH)
2D
3 for å fremme flytting av β-catenin fra kjernen til plasmamembranen og å hemme β-catenin /TCF målgener. I konklusjonen, styrer VDR nivået av kjernefysisk β-catenin i tykktarm kreft celler og kan derfor dempe virkningen av onkogene mutasjoner som aktiverer Wnt /β-catenin veien
Citation. Larriba MJ, Ordóñez-Morán P , Chicote jeg Martín-Fernández G, Puig jeg, Muñoz A, et al. (2011) Vitamin D Receptor mangel Forbedrer Wnt /β-catenin Signalering og tumorbelastning i Colon Cancer. PLoS ONE 6 (8): e23524. doi: 10,1371 /journal.pone.0023524
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 23 mars 2011; Godkjent: 19 juli 2011; Publisert: 15 august 2011
Copyright: © 2011 Larriba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fondo de INVESTIGACION Sanitaria-Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, PI081356), Vall d’Hebron Institute of Oncology, Olga Torres Foundation, Fundación de la Asociación Española de Lucha Contra el Cancer (AECC), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-18302) og Red Tematica de INVESTIGACION Cooperativa en kreft (ISCIII, RD06 /0020/0009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste årsaken til død av kreft i utviklede land [1]. Sannsynligvis vet vi mer om de genetiske forandringer som forårsaker kreft i tykktarmen enn for noen andre faste neoplasi. Mutasjoner i
APC Twitter /adenomatøs polypose coli,
CTNNB1 Twitter /β-catenin eller
AXIN
gener som aktiverer Wnt /β-catenin vei er ansvarlig for initiering av mest colon -kreft [2]. Det første trinnet for tykktarms tumorigenesis innebærer dannelsen av Aberrant Crypt Foci (ACF), som senere utvikle seg til adenom [3]. Bakre gnise av adenom til karsinom krever tilegnelse av nye endringer i gener som er relatert til Wnt /β-catenin signal eller tilhører andre veier som virker synergistisk i prosessen [2].
Apc
min /+
mus skjuler en bakterie linje inaktivere mutasjon i ett
Apc
allel utvikle flere tarm adenomer og karsinomer etter tre måneders alder [4]. Denne fenotype oppstår som en konsekvens av spontan mutasjon av den gjenværende
APC
allel (tap av heterozygositet) og aktivering av Wnt /β-catenin signalveien. Denne musen modellen har blitt gullstandarden for tarmkreft innvielse.
Wnt /β-catenin pathway regulerer muligheten for β-catenin protein for å drive regulering av spesifikke målgener [5], [6]. I korte trekk, i fravær av en Wnt signal eller aktiverende mutasjoner, er β-catenin bare til stede bundet til E-cadherin i det intercellulære
adherens veikryss
, som den frie proteinet blir hurtig fosforylert av kasein kinase-Iβ ( CK-Iα) (Ser45) og glykogensyntasekinase-3 (GSK-3β) (Ser33, Ser37 og Thr41) i et kompleks dannet også av tumorsupressorproteinene proteinene APC og Axin. Fosforylering etiketter p-catenin for ubiquitinering og nedbrytning av proteasomet [7]. I slike basale forhold DNA-bundet T-celle faktor /lymfoide enhancer faktor (TCF /LSF) proteiner samhandle med transkripsjons corepressors å blokkere målet genekspresjon i kjernen. Binding av Wnt ligander til deres celleoverflate-reseptor-kompleksene (frizzled-LRP) resulterer i rekruttering av cytoplasmatiske Axin til plasmamembranen, aktivering av Dishevelled protein og andre ikke godt karakterisert effekter som fører til hemming av β-catenin fosforylering. Dette gjør at β-catenin å akkumulere og gå inn i kjernen, hvor den kommuniserer med TCF /LEF familiemedlemmer, og fører til aktivering av deres ellers fortrengte målgener [5], [7]. Wnt /β-catenin veien er den viktigste drivkraften bak spredning av epitelceller i tykktarmen, og er viktig for vedlikehold av stamceller avdelinger [8], [9]. Imidlertid mutasjonene funnet i tykktarmskreft resultat i den avvikende aktivering av reaksjonsveien og indusere konstitutiv ekspresjon av dens målgener (hovedsakelig involvert i celleformering og dedifferentiation), som fører til dannelsen av benigne ennå langlivede adenomer. Opphopning av ytterligere genetisk og epigenetisk forandringer brensel tumorprogresjon.
Mange epidemiologiske og eksperimentelle studier viser at vitamin D
3 (kolekalsiferol), sitt mest aktive metabolitten 1α, 25-dihydroksyvitamin D
3 (kalsitriol , 1,25 (OH)
2D
3) og flere analoger beskytte mot koloncancer [10] – [12]. Vi har rapportert at 1,25 (OH)
2D
3 hemmer spredning og fremmer epitelial differensiering av menneskelige tykktarmskreftceller ved å fremkalle uttrykket av E-cadherin og ved å motvirke Wnt /β-catenin veien. Sistnevnte er et resultat av to hovedmekanismer: a) induksjon av direkte binding av vitamin D-reseptor (VDR) p-catenin, noe som utelukker dannelsen av transkripsjonelt aktive β-catenin /TCF-komplekser, og b) induksjon av β -catenin atom eksport og relocalization på plasma membran
adherens veikryss
som følge av E-cadherin oppregulering [13]. I tillegg, 1,25 (OH)
2D
3 øker ekspresjonen av DICKKOPF-1 (DKK1), et utskilt protein som inhiberer Wnt signalering fra dets plasmamembranreseptorer [14]. Vi har også beskrevet at menneskelig
VDR
genet er et direkte mål for SNAIL1 og SNAIL2 /SLUG transkripsjons repressors, og at VDR uttrykk i kolon kreftpasienter reduseres ved fremskredne stadier av sykdommen knyttet til oppregulering av disse faktorene [15], [16]. Følgelig høy SNAIL1 /2 uttrykk i dyrkede tykktarmskreftceller øker β-catenin transkripsjonen aktivitet ved å undertrykke VDR Uttrykket og antagonistisk aktivitet på Wnt /β-catenin signal [16], [17].
β-catenin har et bredt spekter av pleiotrope effekter som ikke kan trolig forklares utelukkende av modulering av TCF /LEF handling. Dermed har β-catenin nylig blitt beskrevet å binde flere transkripsjonsfaktorer av de nukleære reseptor super og homeobox proteiner [13], [18], [19]. I de fleste tilfeller β-catenin binding øker transkripsjonen aktivitet av disse faktorene og påvirker ekspresjonen av alternative eller ytterligere sett av mål-gener som er involvert i celle-fate avgjørelser langs utvikling, vev homeostase, eller kreft [19], [20]. Våre innledende beskrivelsen av den direkte interaksjon mellom β-catenin med VDR i humane tarmkreftceller har blitt bekreftet i andre cellesystemer [21] – [24]. β-catenin /VDR interaksjonen omfatter aktivatoren funksjon-2 (AF-2) trans domene av VDR og det C-terminale domene av β-catenin [21]. I mus hud, styrer β-catenin /VDR målgener, epitelial stamcelle skjebne og tumor utvikling [20]. I dette systemet, økte atom β-catenin promostartfasen mens VDR ligander beskytte mot kreft ved å redusere styrken av Wnt /β-catenin signalering [20]. I samsvar med dette, behandling av
Apc
min /+
mus med 1,25 (OH)
2D
3 eller analoger reduserer tumorbelastning [25] eller polypp antall og legg i [ ,,,0],26].
det er viktig å fremheve at nivået av β-catenin i kjernen definerer styrken på Wnt signal og i følge skjebnen eller oppførselen til flere typer av normale og tumorceller [5], [27]. I tillegg til aktive mutasjoner i Wnt /β-catenin sti komponenter, andre genetiske endringer som mutasjoner i
K-RAS product: [28] eller aktivering av onkogene trasé som HGF /c-Met signale [29] forbedre atom P-catenin akkumulering under tykktarmskreft progresjon. I et slikt scenario, kan agenter i stand til å redusere β-catenin atom innhold og så for å dempe Wnt /β-catenin signal potensielt brukes i kreftbehandling så lenge kreftceller vises Wnt sti avhengighet.
I denne studien vi vurdere konsekvensene av
VDR
mangel på initiering og utvikling av intestinal kreft drevet ved aktivering av Wnt /β-catenin pathway. Effekten av
VDR
fravær har blitt analysert både
in vivo Hotell og
in vitro
: i tumorer som genereres i
Apc
min /+ VDR
– /-
mus og i dyrkede humane tykktarmskreftceller der
VDR
uttrykk ble slått ned ved hjelp av shRNA. I tillegg har vi studert effekten av VDR tilberedning i VDR-negative humane tykktarmskreftceller. Våre resultater etablere en direkte kobling mellom VDR funksjon og atom β-catenin nivåer som er avgjørende for å kontrollere aktiviteten til Wnt /β-catenin signalisering i tykktarm kreft
in vivo
.
Resultater
ved hjelp tilgjengelig
Apc
min /+ Hotell og
VDR
+/-
mus vi generert ved hjelp av egnede overganger
Apc
min /+ VDR
+ /+, Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
dyr. Histologisk analyse på fem måneders alder viste at
VDR
mangel påvirket ikke det totale antall svulster i
Apc
min /+
mus, enten i tynntarmen eller i tykktarmen (Figur 1a, 1b). I kontrast, colontumorer i
Apc
min /+ VDR
– /-
mus var betydelig større enn i
Apc
min /+ VDR
+ /+
eller
Apc
min /+ VDR
+/-
mus (Figur 1c). Selv om forskjellige i størrelse, kolon adenomer og karsinomer var histopathologically tilsvarende i alle mus uavhengig av deres VDR status (figur 1d). I tillegg har antall kolon ACF var høyere i
Apc
min /+ VDR
– /-
mus enn i
Apc
min /+ VDR
+ /+
eller
Apc
min /+ VDR
+/-
mus (figur 2a).
Totalt antall svulster (adenom og karsinom) i tynntarmen (a) eller i tykktarmen (b) i
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt korresponderer til en mus analysert og den horisontale linje angir middelverdien. (C) Størrelse på tykktarmskreft (adenomer og karsinomer) fra
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+ /- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt korresponderer til en tumor analysert og den horisontale linje angir middelverdien. P-verdien for enveis ANOVA analyse er vist. Stjernene viser signifikante forskjeller mellom gruppene ved Bonferroni multippel sammenligning post-test. (D) Representative hematoxylin /eosin farging bilder av tykktarmskreft fra
Apc
min /+ VDR
+ /+ Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Scale bar, 300 mikrometer.
(a) Totalt antall kolon ACF i
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt korresponderer til en mus analysert og den horisontale linje angir middelverdien. (B) De øvre paneler, representative hematoxylin /eosin farging bilder av colonic ACF i
Apc
min /+ VDR
+ /+ Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Pilspisser indikerer ACF. Scale bar, 50 mikrometer. Midt paneler, representative immunofluorescence bilder som viser β-catenin uttrykk og lokalisering i colonic ACF fra
Apc
min /+ VDR
+ /+ Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Pilspisser indikerer ACF. Scale bar, 100 mikrometer. Nedre paneler er en forstørrelse av mellomplater. Scale bar, 50 mikrometer. (C) Kvantifisering av β-catenin atomnivå i colonic ACF fra
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+ /- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt tilsvarer en lesjon analysert og den horisontale linje angir middelverdien. (D) Kvantifisering av β-catenin atomnivå i kolon adenomer og karsinomer fra
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt tilsvarer en lesjon analysert og den horisontale linje angir middelverdien. (A, c, d) p-verdier for enveis ANOVA analysen er vist. Stjernene viser signifikante forskjeller mellom gruppene ved Bonferroni multippel sammenligning post-test.
Neste vi evaluert status Wnt veien aktivering i tykktarm lesjoner ved å analysere β-catenin uttrykk. Selv ACF i
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus ble utvisket av hematoxylin /eosin (H /E) farging, observerte vi en netto økning i kjernefysiske og cytosoliske β-catenin nivåer i fullstendig fravær av
VDR
(figur 2b). Mens β-catenin flekker var høy og ganske homogen blant celler i ACF (figur 2b), var det svært heterogen i karsinom av de tre typer av dyr (Figur S1 A). Dette fenomenet ble også observert i humane primære kolon karsinom (fig S1b), karakterisert ved at nivået av kjernefysisk β-catenin er heterogen og sannsynligvis definerer karsinogent potensial av forskjellige populasjoner av kreftceller som er tilstede i tumoren [29]. Denne heterogeniteten kan forklare hvorfor en statistisk signifikant økning i kjernefysisk β-catenin nivået ble funnet i ACF av
Apc
min /+ VDR
– /-
sammenlignet med
Apc
min /+ VDR
+ /+
eller
Apc
min /+ VDR
+/-
mus (figur 2c), men bare en liten trend ble observert i adenomer og karsinom (figur 2d).
For å demonstrere en årsakssammenheng mellom
VDR
tap og økningen i kjernefysisk β-catenin, vi studerte SW480-ADH menneskelige kolon kreftceller der
VDR
ble slått ned ved hjelp av shRNA. Disse cellene havn fleste av genetiske avvik som kjennetegner avanserte tykktarm kreft som mutasjon av
APC Hotell og
TP53
tumorsuppressorgener, aktivering av
K-RAS
onkogen og
c-MYC
amplifikasjon [13]. Etter avtale med
in vivo
resultater, en sterk økning i kjernefysisk β-catenin innhold ble funnet i shVDR SW480-ADH celler sammenlignet med shControl celler (figur 3a, 3b). I tillegg
VDR
knock-down avskaffet kapasitet på 1,25 (OH)
2D
3 for å indusere E-cadherin uttrykk og β-catenin flytting fra kjernen til plasmamembranen ( Figur 3a). Også,
VDR
knock-down forhindret omorganiseringen av β-tubulin cytoskjelettet og endringen i cellen morfologi indusert av 1,25 (OH)
2D
3 som fører til dannelsen av kompakte epithelioid øyer (figur 3b).
Representative immunfluorescens bilder som viser β-catenin og E-cadherin (a) eller β-catenin og β-tubulin (b) ekspresjon og lokalisering i SW480-ADH celler infisert med lentivirus uttrykker shVDR eller shControl og behandlet med 1,25 (OH)
2D
3 eller vehikkel i 72 timer. Scale bar, 20 mikrometer.
Vi ønsket å analysere om økningen i nivået av kjernefysisk β-catenin oversatt til en sterkere Wnt /β-catenin signalering. For å oppnå dette, studerte vi β-catenin /TCF-avhengig transkripsjon i kolon kreftceller. shControl og shVDR SW480-ADH-celler ble infisert med lentivirus som koder reporteren EGFP protein under kontroll av syv kopier av et konsensus TCF /LEF-bindingssete (figur 4a) [30]. Nærværet i lentiviral konstruksjonen av den røde fluorescerende protein mCherry styres av en konstitutiv promoter tillates å identifisere infiserte celler under et fluorescerende mikroskop og ved strømningscytometri. I likhet med p-catenin flekker i colontumorer, vi fant viss heterogenitet i β-catenin /TCF aktivitet blant cellekultur: variabel EGFP uttrykk i like infiserte celler (figur 4b). Analysen av hele cellepopulasjonen ved strømningscytometri viste at prosentandelen av høy-EGFP-celler var overlegen i shVDR enn i shControl cellekulturer (figur 4c). I tillegg shVDR cellene hadde et signifikant høyere EGFP signal gjennomsnitt enn shControl celler (figur 4d). Vi fant også at nedgangen i EGFP opphopning forårsaket av 1,25 (OH)
2D
3 i shControl celler (reduksjon av andelen av high-EGFP celler og EGFP signal gjennomsnitt) ble svekket i shVDR celler ( Figur 4c, 4d).
(a) Diagram av 7xTCF /LSF-EGFP-SV40-mCherry lentiviral konstruere brukes til å infisere shControl og shVDR SW480-ADH celler. (B) Representant fase-kontrast og fluorescens bilder som viser uttrykket av EGFP og mCherry i SW480-ADH celler infisert med 7xTCF /LSF-EGFP-SV40-mCherry vektor. Pilspisser indikerer tilsvarinfiserte celler som har variabel uttrykk for EGFP. Skala barer, 20 mikrometer. (C) Flowcytometri analyse av EGFP uttrykk i shControl og shVDR SW480-ADH celler infisert (mCherry positiv) med 7xTCF /LSF-EGFP-SV40-mCherry vektor og behandlet med 1,25 (OH)
2D
3 eller vehikkel i 96 timer. Prosentandelen av celler i hver port er indikert. (D) Kvantifisering av flowcytometri data som viser den gjennomsnittlige ekspresjon av EGFP i de infiserte mCherry-positive celler. Data tilsvarer tre uavhengige eksperimenter. P-verdien for enveis ANOVA analyse er vist. Stjernene viser signifikante forskjeller mellom gruppene ved Bonferroni multippel sammenligning post-test. (E) Analyse av QRT-PCR av
VDR
,
AXIN2
,
LEF1 Hotell og
c-MYC
mRNA uttrykk i shControl og shVDR SW480- ADH-celler behandlet med 1,25 (OH)
2D
3 eller vehikkel i 48 timer. Det geometriske gjennomsnitt av ekspresjonen av SDHA og TBP husholdningsgener ble anvendt for RNA-ekspresjonen normalisering som angitt i materialer og metoder. Tallene angir den prosentvise inhibering av 1,25 (OH) 2D3 behandling i hver celletype. Data tilsvarer tre uavhengige eksperimenter
Viktigere var heving av atom β-catenin nivåer gjenspeiles i en økt uttrykk av flere β-catenin /TCF målgener:. QRT-PCR-analyse viste høyere nivåer av
AXIN2
,
LEF1 Hotell og
c-MYC
mRNA i shVDR enn i shControl celler (figur 4e). I tillegg er inhibering av ekspresjonen av β-catenin /TCF målgener av 1,25 (OH)
2D
3 ble redusert i shVDR celler (figur 4e). Reduksjonen av VDR ekspresjon av shRNA ble også analysert ved hjelp av QRT-PCR (figur 4e) og oversettes til upåviselige nivåer av protein ([31] og data ikke vist). Som kontroll vi studerte uttrykk for
CDH1 Twitter /E-cadherin og
CYP24A1
i disse cellene, to 1,25 (OH)
2D
3 målgener. Induksjon av både gener ble drastisk hemmet i shVDR celler (figur S2A).
Neste, vi utvidet våre studier til andre menneskelige kolon kreft cellelinjer.
VDR
knock-down i HCT116 og HT29 celler også fremmet en økning i kjernefysiske β-catenin nivåer (figur S2B) og aktivering av TCF /LEF-avhengig transkripsjon (figur S2C), som fører til et høyere uttrykk av de β-catenin målgener
AXIN2 Hotell og
DKK1 plakater (figur S2D). Slik genregulering ble ledsaget av et generelt tap av epitelial organisasjon (figur S2B). Som forventet, reduksjon av
VDR
uttrykk blokkert kapasiteten på 1,25 (OH)
2D
3 for å indusere sin target gen
CYP24A1 plakater (figur S2D). Imidlertid, og ordreantallene til data fra SW480-ADH-celler, 1,25 (OH)
2D
3 hadde ingen virkning på β-catenin sted eller transkripsjonen aktivitet i HCT116 og HT29-celler (figur S2D og data ikke vist) . Årsaken kan være at disse cellene uttrykker høyt nivå av E-cadherin og således β-catenin er plassert på plasmamembranen i fravær av 1,25 (OH)
2D
3.
forbi~~POS=TRUNC uttrykk for eksogen villtype VDR i VDR-negative menneskelige SW620 metastatiske tykktarm kreft celler redusert sine høye atom β-catenin nivåer (Figur S3). I motsetning VDR- ΔAF2 og VDR-L417S mutanter som ikke er i stand til å binde β-catenin og rekruttere klassiske coactivators [21] ikke endre atom innhold av β-catenin (Figur S3). Likeledes kan ekspresjon av en VDR mutant ute av stand til å binde klassiske coactivators, men i stand til å binde β-catenin (VDR-E420Q) [21] ikke hadde noen effekt på β-catenin atominnholdet i SW620 celler (figur S3).
den observerte økningen i atom β-catenin innhold av
VDR
knock-down ikke er en konsekvens av den reduserte aktivitet av kinaser CK-Iα eller GSK-3P siden nivået av β-catenin fosforylering ved Ser45 eller Ser33 /Ser37 /Thr41 var uendret i shVDR SW480-ADH celler (Figur S4A). Som β-catenin fosforylering ved Ser552 og Ser675 av proteinkinase A og /eller AKT har blitt foreslått for å fremme β-catenin nukleær lokalisering og /eller transkripsjonen aktivitet [32] – [34], vi også analysert på muligheten for at disse kinaser var involvert i effekten av VDR knock-ned på β-catenin. Vi fant ut at β-catenin fosforylering på Ser552 og Ser675 ble redusert i shVDR SW480-ADH celler (figur S4).
Neste, vi forsøkte å bekrefte effekten av VDR mangel på β-catenin mål gener
in vivo
. For å oppnå dette, analyserte vi ved immunfluorescens og kvantifisert nivået av uttrykk for to β-catenin /TCF målgener (
Ccnd1 Twitter /Cyclin D1 og
Lef1
) i tykktarmen ACF og karsinom av
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Følgelig med data fra dyrkede celler, ble en betydelig økt uttrykk av begge genprodukter funnet i lesjoner av
Apc
min /+ VDR
– /-.
Mus (figur 5)
Kvantifisering av cyclin D1 (a) og Lef1 (d) protein uttrykk i colonic lesjoner fra
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Hvert punkt tilsvarer en lesjon analysert og den horisontale linje angir middelverdien. P-verdier for enveis ANOVA analysen er vist. Stjernene viser signifikante forskjeller mellom gruppene ved Bonferroni multippel sammenligning post-test. Representative immunfluorescens bilder som viser β-catenin og Cyclin D1 (b, c) eller β-catenin og Lef1 (e, f) ekspresjon og lokalisering i tykktarm ACF (b, e) og karsinomer (c, f) fra
APC
min /+ VDR
+ /+ Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Skala barer, 50 um (b, e) og 200 um (c, f). Stjernene viser en uspesifikk farging.
Til slutt analyserte vi graden av differensiering av ACF og karsinomer stede i tykktarmen av
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Antistoffer mot cytokeratins (pan-cytokeratin) og villin1 som markører for epitelial differensiering ble brukt (figur S5). ACF uttrykte meget lave nivåer av disse proteiner som forventet fra progenitor-fenotypen pålagt av høy Wnt /β-catenin signalering (figur 6a, 6b). I karsinomer ekspresjonen av begge markører var heterogen (figur 6c, 6d), som stemmer overens med den heterogene ekspresjon av β-catenin som tidligere beskrevet (figur S1A). Ingen vesentlige forskjeller i uttrykket av cytokeratins og villin1 ble funnet mellom lesjoner av
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/- Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus, noe som tyder på at disse to differensiering markører tapt tidlig i tykktarm tumorigenesis, trolig som en konsekvens av den første aktiveringen av Wnt /β-catenin veien.
Representative immunofluorescence bilder som viser β-catenin og villin1 (a, c) eller β-catenin og pan-cytokeratin (b, d) uttrykk og lokalisering i tykktarm ACF (en , b) og karsinom (c, d) fra
Apc
min /+ VDR
+ /+ Hotell og
Apc
min /+ VDR
– /-
mus. Prikkede linjer avgrense ACF. Tallene angir områder med forskjellig mønster av uttrykk av de analyserte proteiner i samme tumor: 1) høy β-catenin, lav villin1 /cytokeratins; 2) lav β-catenin, høy villin1 /cytokeratins. Skala barer, 50 mikrometer (a, b) og 200 mikrometer (c, d).
Diskusjoner
Nivået av kjernefysisk β-catenin definerer styrken av Wnt /β -catenin signalering og som følge skjebnen og fenotypen av mange typer av normale celler og kreftceller. Avvikende aktivering av Wnt /β-catenin signalering på grunn av endringer i komponentene av reaksjonsveien er ansvarlig for initiering av de fleste humane tykktarmkreftformer, noe som understreker viktigheten av å kontrollere atom β-catenin opphopning [28], [29], [35] . Selv om oppstart av tykktarmen tumorigenesis anses klonal [36], tykktarmskreft viser stor grad heterogen kjernefysisk β-catenin uttrykk. Dette er kjent som den β-catenin paradoks og har ført for å søke etter alternative reaksjonsveier moduler β-catenin plassering og aktivitet. Blant dem,
K-RAS
mutasjon og myofibroblasts-avledet HGF har nylig blitt foreslått å øke β-catenin atom innhold [28], [29].
Svært lite er kjent om mekanismer for å minske nivået av β-catenin i kjernen. Vi har beskrevet at 1,25 (OH)
2D
3 og flere mindre kalsemiske analoger forstyrrer Wnt /β-catenin banen i en serie av human koloncancer cellelinjer i flere modi: de øker bindingen av VDR p-catenin hindrer dannelsen av β-catenin /TCF komplekser, indusere ekspresjon av Wnt inhibitor DKK1, og fremme flytting av β-catenin fra kjernen mot plasmamembranen hvor det binder E-cadherin på
adherens veikryss product: [13], [14]. Antatte mekanismer for denne siste effekten inkluderer induksjon av β-catenin atom eksport eller Sequester av nylig syntetisert og /eller cytosolic β-catenin protein ved E-cadherin, hvis uttrykket er sterkt indusert av 1,25 (OH)
2D
3. En annen mekanisme for Wnt /β-catenin inhibering i tykktarmskreft er blitt foreslått av Kaler og kolonner .: 1,25 (OH)
2D
3 minker syntesen og sekresjonen av THP-1-makrofager av interleukin-1β, et cytokin som aktiverer Wnt /β-catenin banen i tykktarm kreft celler gjennom blokaden av β-catenin fosforylering av GSK-3β [37]. Men funksjonen av alle disse celle-autonome og ikke-celle-autonome mekanismer
in vivo
forble ukjent.
I denne studien har vi undersøkt om
VDR
mangel Endrer β -catenin atom innhold og Wnt /β-catenin banen i den mest brukte dyremodell for tykktarmskreft,
Apc
min /+
mus. Våre resultater viser at
VDR
mangel på
Apc
min /+
mus øker atom β-catenin nivåer og uttrykk av Wnt /β-catenin målgener, og i tråd med disse effektene forbedrer total kolon tumor belastning. Konsekvent, banket ned
VDR
av shRNA i menneskelige tykktarmskreftceller øker kjerneinnholdet i β-catenin, sin transkripsjonen aktivitet, og uttrykk for Wnt /β-catenin målgener. Videre forbigående restaurering av vill type VDR uttrykk i VDR-negative menneskelige SW620 tykktarmskreftceller synker kjernefysisk β-catenin nivå, mens VDR-ΔAF2, VDR-L417S eller VDR-E420Q mutanter, ute av stand til å binde klassiske coactivators og aktivere gentranskripsjon [21 ], gjorde ikke. Merkelig, blant dem bare VDR-E420Q er i stand til å binde β-catenin [21] og sin re-uttrykk i
VDR
– /- mus redder alopecia men ikke rakitt fenotype [38]. Det synes derfor at kjernefysisk β-catenin nivå og aktivitet avhenger av kapasiteten til VDR å rekruttere klassiske transkripsjons coactivators.
Våre data viser at VDR knock-down in SW480-ADH celler ikke påvirker β-catenin fosforylering av CK-Iα eller GSK-3β, forkaster en rolle VDR regulere total β-catenin akkumulering. Mens atom β-catenin nivå øker i fravær av VDR, er det totale cellulære mengden av β-catenin proteinet ikke forandres (fig S4a). Uventet, fant vi også at fosforylering av β-catenin på Ser552 og Ser675 foreslått å øke β-catenin transkripsjonen aktivitet er redusert i shVDR SW480-ADH celler. Men den antatte hemmende virkning at reduksjonen av disse phosphorylations kan ha på β-catenin transkripsjonen aktivitet synes å være overpassed ved virkningen av VDR mangel økende β-catenin nukleær translokasjon. Til sammen disse data tyder på at VDR ikke kontrollerer β-catenin degradering, men mest sannsynlig favoriserer sin omfordeling til cellekjernen.
Våre resultater viser en roman
in vivo
funksjon av VDR som avgjørende modulator av Wnt /β-catenin signalstyrke i tykktarmskreft. Oppdagelsen av at
VDR
mangel endrer ikke antallet svulster men øker tumor belastning indikerer at VDR ikke blokkerer de første mutasjoner som provoserer tidlig aktivering av Wnt /β-catenin vei, men at det fortrinnsvis har en langvarig beskyttende effekt på tumorvekst ved å begrense styrken av Wnt /β-catenin onkogen signal. Konkordant med våre resultater, har en meget fersk rapport viser at
Apc
min /+ VDR
– /-
mus presentere større tarmsvulster enn
Apc
min /+ VDR
+ /+
mus, selv om de molekylære mekanismene bak dette fenotype ikke ble undersøkt [39]. Den konkordans av de to parallelle studier bekrefter deres viktigste funnene.
Resultatene fra vår studie er relevant for klinikken, som VDR uttrykket er nedregulert i omtrent to tredjedeler av avanserte colontumorer knyttet til oppregulering av
SNAI1 Hotell og
SNAI2
gener som koder for SNAIL1 /SNAIL2 transkripsjons repressors [15], [16], [40]. Scale bar, 100 mikrometer.
