Abstract
Bakgrunn
K-RAS mutasjons utgjør en spesielt vanskelig problem for kreftbehandling. Aktiverende mutasjoner i K-RAS er vanlig i kreft i lunge, bukspyttkjertel og tykktarm og er assosiert med dårlig respons på behandling. Som sådan, målrettet terapi som oppheve K-RAS-indusert onkogenisitet vil være av enorm verdi.
Metoder
Vi søkte for små molekyl kinase hemmere som fortrinnsvis påvirker veksten av kolorektal kreft celler som uttrykker mutant K-RAS. Virkningsmekanismen av en inhibitor ble undersøkt ved hjelp av kjemiske og genetiske metoder.
Resultater
Vi identifiserte BAY61-3606 som hemmer spredning i kolorektal kreft celler som uttrykker mutante former av K-RAS, men ikke i isogene celler som uttrykker vill-type K-RAS. I tillegg til sin anti-proliferative effekter i mutante celler, BAY61-3606 oppviste en tydelig biologisk egenskap i villtype-celler ved at den overdratt følsomhet for inhibering av RAF. I denne sammenheng BAY61-3606 handlet ved å hemme MAP4K2 (GCK), som normalt aktiveres NFκβ signalering i villtype-celler som respons på inhibering av RAF. Som et resultat av MAP4K2 inhibering, villtype cellene ble følsomme for AZ-628, en inhibitor RAF, da også behandlet med BAY61-3606.
Konklusjoner
Disse studiene indikerer at BAY61-3606 utøver forskjellige biologiske aktiviteter i ulike genetiske sammenhenger
Citation. Lau KS, Zhang T, Kendall KR, Lauffenburger D, Gray NS, Haigis KM (2012) BAY61-3606 Påvirker Livskraftig av tykktarmskreft celler i en Genotype -rettet Manner. PLoS ONE syv (7): e41343. doi: 10,1371 /journal.pone.0041343
Redaktør: David J. Reiner, University of North Carolina, USA
mottatt: 02.02.2012; Godkjent: 20 juni 2012; Publisert: 18.07.2012
Copyright: © 2012 Lau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute (K01-CA118425 og P30-CA006516) og American Cancer Society (MGO-114877) og en donasjon fra Merlino Family Endowment Fund. KSL er en Robert Svart Fellow av Damon Runyon Cancer Research Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RAS familie GTPases fungere som binære brytere som gjennomgår en konformasjonsendring ved binding til GTP, som tillater dem å engasjere en rekke nedstrøms signal effektorer inkludert RAF, PI3K, og RALGDS [1]. Den iboende GTPase aktiviteten av RAS hydrolyserer GTP til GDP, med hjelp av GTPase aktivere protein (GAP) kofaktorer, å inaktivere av signalanlegget evne. Missense mutasjoner i kodon 12, 13, 61, eller 146 er vanlige i kreft og er assosiert med resistens mot GAP-aktivitet, slik at RAS å vedvare i den aktiverte, GTP-bundet tilstand. Aktivering K-RAS mutasjoner forekommer hos ca. 15% av alle krefttilfeller (noe som gjør den til en av de mest muterte onkogener), men er spesielt vanlig i de mest dødelige kreftformer, slik som de som oppstår i galleveiene, tykktarm, lunge, og bukspyttkjertel [2]. I kolorektal kreft, for eksempel, er K-RAS mutert i nesten 40% av tilfellene [2]. Viktigere, svulster med K-RAS mutasjoner er spesielt motstandsdyktig for konvensjonelle og målrettet terapi og er vanligvis forbundet med dårlig prognose [3] -. [5]
Den største utfordringen for å motvirke de onkogene effekter av aktivert K-RAS er den manglende evne til direkte å inhibere det mutante proteinet. Fordi signal egenskapene til K-RAS er forbedret via inaktivering av sin GTPase aktivitet, er direkte farmakologisk hemming av RAS ikke en levedyktig terapeutisk strategi. En alternativ strategi for å motvirke muterte K-RAS er å inhibere dets nedstrøms effektorer, for eksempel, RAF-MEK-ERK (MAPK) veien. MEK-hemmere har fått oppmerksomhet på grunn av sin allosterisk virkningsmekanisme, som gir ekstrem spesifisitet, og deres effekt hos melanomer og tykktarm kreft uttrykker aktivert B-RAF [6], [7]. MEK-inhibitorer gi dårlig ytelse i cancer som uttrykker mutante K-RAS imidlertid kanskje på grunn av sekundære mutasjoner som påvirker respons eller eksistensen av MEK-uavhengig signale nedstrøms for RAF [8], [9]. Gitt presumptiveness av disse scenariene, er det klart at en bedre forståelse av hvordan K-RAS signale nettverk opererer i kreft er nødvendig for å utvikle nye behandlingsformer.
I de senere årene, storskala funksjonell genomikk tilnærminger har vært ansatt for å oppdage kinase mål at når slått ned er «syntetisk dødelige» med mutant RAS. Potensielle terapeutiske mål som har blitt identifisert inkluderer TBK1 [10], STK33 [11], CDK4 [12], og PLK1 [13], selv om det gjenstår å se om noen av disse representerer
bona fide
terapeutiske mål for K-RAS mutante kreft. Mens forstå mekanismer som K-RAS-signaler gjennom disse målene er sentrale i utformingen av effektive medikamenter, en mindre studert, og ofte oversett, er spørsmålet hvorfor villtype celler, som også uttrykker disse målene, tåler tap av funksjon av disse enzymer. Dette problemet er like viktig for drug design fordi fordelen av målrettet terapi (over konvensjonelle kjemoterapi) er deres potensial selektivitet for ondartede celler.
I denne studien har vi preget aktiviteten BAY61-3606 i sammenheng med kolorektal kreft, gir innsikt i (1) potensielle terapeutiske mål for kreft som uttrykker mutante K-RAS og (2) veiene som regulerer responsen av ikke-mutante celler til målrettede inhibitorer. BAY61-3606 ble opprinnelig identifisert som en oralt tilgjengelig, ATP-kompetitiv hemmer av Spleen Tyrosin kinase (SYK) [14]. Siden SYK spiller en aktiv rolle i betennelsesreaksjon, har BAY61-3606 hovedsakelig blitt brukt til å studere immuncellefunksjon. For eksempel, undertrykker BAY61-3606 antigen-indusert luftveisbetennelse hos rotte og B-celle-migrering i mus [14], [15]. Mens alle effektene av BAY61-3606 i immunceller er knyttet til evnen til å inhibere Syk, er det ukjent om BAY61-3606 har alternative mål for biologisk relevans i andre cellulære sammenhenger. I denne studien har vi preget to SYK-uavhengige aktiviteter knyttet BAY61-3606 i kolorektal kreftceller.
Metoder
Cellelinjer, knockdowns, og medikamentell behandling
All koloncancercellelinjer ble holdt i DMEM supplert med penicillin (100 enheter /ml), streptomycin (100 ug /ml), og 10% føtalt bovint serum (FBS). Rektal kreft cellelinje (akkumulatorer1) ble holdt i DMEM /F12 supplert med penicillin (100 enheter /ml) /streptomycin (50 ug /ml), og 5% FBS. Knockdowns ble oppnådd med pSICOR eller pLKO lentiviral vektorer [16]. Måltallene sekvenser for knockdowns kan finnes i tabell S2. I behandlingsforsøk ble cellene belagt i 24 timer før eksponering for stoffet. AZ-628 ble innhentet fra Astrazeneca. CI-1040 ble oppnådd fra Pfizer. R406 ble syntetisert i Gray laboratoriet. BAY61-3606 og IKK VII ble kjøpt fra EMD Biosciences. BAY-derivater ble syntetisert for denne studien. Ble utført
Cell syklus analyse og cellelevedyktigheten assays
cellesyklusanalyse via FACS-baserte propidiumjodid kvantifiserer, ved hjelp av standardmetoder. For å måle celle-levedyktighet, ble celler dyrket i 96-brønners plater i nærvær eller fravær av medikament i 72 timer, fiksert med 4% paraformaldehyd, og deretter farget med Syto60 (Invitrogen). Platene ble fotografert og kvantifisert ved hjelp av licor Odyssey system (licor).
Bio-Plex signal analyser
Bio-Plex analysesystem ble brukt til å måle signal i medikamentbehandlede celler. Kort fortalt ble cellene inkubert i nærvær av medikament for ulike mengder tid og deretter lysert i Bio-Rad cellelyseringsbuffer (Bio-Rad). Protein kvantifisering ble utført ved anvendelse av BCA-analyse (Pierce) og 5 ug protein fra hver prøve ble anvendt for Bio-Plex analyse. Fosfo-signale analyser ble utført ved bruk av tilgjengelige fosfo-signaleundersøkelseskit og kvantifisert på en Bio-Plex 200 system (Bio-Rad): p-Iκβα (Ser32 /Ser36), p-JNK (Thr183 /Tyr185), p-MEK1 ( Ser217 /Ser221), p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), p-p90RSK (Thr359 /Ser363), p-p38 (Thr180 /Tyr182), pc-JUN (Ser63), p-ATF2 (Thr71 ), p-AKT (Ser473), p-S6 (Ser235 /Ser236), p-STAT3 (Ser727), p-STAT3 (Tyr705), og p-GSK3α /β (Ser21 /Ser9). Bio-Plex analysen for total MEK1 ble også utført som en lasting kontroll. Alle signaler ble normalisert til et felles kontrollcellelinje lysat i rekkefølge for analyser mellom platene for å være sammenlignbare.
Biokjemiske aktivitetsanalyser
biokjemisk aktivitet av BAY61-3606 og derivater ble målt på to måter . Først brukte vi Ambit er KINOMEscan ™ -teknologi for å identifisere de kinaser som er hemmet for underlaget bindende ved forbindelsene, alt analysert på en mikrometer. For det andre har vi brukt Invitrogen sin SelectScreen® Biokjemisk Kinase Profiling Service for å bestemme
in vitro
IC50s for forbindelsene mot spesifikke kinaser.
Kjemisk avledning av BAY61-3603
Detaljer på syntese av BAY derivater, og strukturer av disse derivater, kan finnes i figur S5.
Resultater
AZ-628 og BAY61-3606 undertrykke vekst i celler som uttrykker K-RAS
G13D
i et forsøk på å identifisere nye terapeutiske mål for kolorektal kreft uttrykker mutant K-RAS, utførte vi en skjerm for små molekyl kinase hemmere som påvirker levedyktighet i en genotype-spesifikk måte. I disse studiene, benyttet vi et sett av isogene tykktarmskreftcellelinjer som skiller seg bare i sin K-RAS-mutasjon status. Foreldrecellelinjer, HCT-116 og DLD-en, bære en heterozygot aktiverende mutasjon i K-RAS (G13D /+). De avledede cellelinjer, hke-3 og DKS-8, beholder villtype-allel, men har mistet den mutante allel av K-RAS i kraft av genet targeting [17]. I tråd med vår tidligere arbeid [9], fant vi at K-RAS mutante celler var overfølsom til AZ-628, en pan-RAF hemmer [18], [19], sammenlignet med vill-type celler, men ufølsom for CI-1040 , en MEK-inhibitor [6] (fig. 1a). Vi fant også at BAY61-3606, en Spleen Tyrosin kinase (SYK) inhibitor, påvirket samlet levedyktighet i HCT-116 og DLD-1 celler i forhold til HKE-3 og DKS-8 celler (Fig. 1a, fig. S1 A).
(a) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter 72 timer med AZ-628, CI-1040 eller BAY61-3606 behandling i HCT-116 (K-RAS
G13D /+, rød) eller HKE-3 (K-RAS
– /+, blå) cellelinjer. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til DMSO kjøretøy behandlet kontrollgruppe for hver cellelinje. Feilfelt representerer SEM for 3 uavhengige eksperimenter. Celler som uttrykker mutante K-RAS var forholdsvis følsomme for AZ-628 og BAY61-3606, men ikke CI-1040. (B) cellesyklus-profiler, som bestemt ved propidiumjodidfarging, av kolorektal kreftceller med mutante B-RAF (HT-29) ble behandlet med en CI-1040 eller mutant K-RAS (DLD-1) som ble behandlet med BAY61-3606. Mens hemming av MEK induserer G1 arrest i HT-29 celler, som dokumentert av tap av 4N topp, BAY61-3606 ikke ut til å endre profilen av DLD-1 celler. (C) Celleviabilitet av kolorektal kreft celler uttrykker mutant B-RAF (V600E) etter 72 timers behandling med BAY61-3606 og /eller CI-1040. Celler som uttrykker mutant B-RAF (HT-29 – solid disposisjon og RKO – stiplet linje) var følsomme for både BAY61-3606 og CI-1040 og disse to hemmere samarbeidet om å produsere en forbedret respons. (D) Phospho-MEK1 (Ser217 /Ser221) og fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) nivåer i K-RAS villtype og mutante celler etter 45 minutters eksponering til 1 uM AZ-628, 1 pM BAY61-3606, eller kjøretøy kontroll. Signaler ble målt ved hjelp av Bio-Plex analyser. Relativ signalet ble normalisert til en master kontroll lysat. AZ-628 behandling reduserte nivået av fosfor-MEK og fosfor-ERK, men BAY61-3606 ikke.
For å finne ut hvordan BAY61-3606 berørte levedyktighet av celler som uttrykker mutant K-RAS, vi analysert cellesyklus av celler behandlet med medikamentet. Vi fant at BAY61-3606 ikke endret cellesyklusprofil av DLD-1-celler, og heller ikke gjorde det induserer apoptose (Fig. 1b). I motsetning til kolorektal kreftceller som uttrykker mutante K-ras, cellelinjer som uttrykker mutante B-RAF var følsomme for inhibering av MEK og behandling med en CI-1040 indusert G1 rest [6] (Fig. 1 b, c). Interessant nok har vi funnet at B-RAF-mutantcellelinjer ble også følsomme for BAY61-3606 og som CI-1040 og BAY61-3606 samarbeidet for å fremstille en forsterket negativ effekt på levedyktigheten av celler som uttrykker aktiverte B-RAF (Fig. 1c). Samlet utgjør disse observasjonene foreslått (1) at BAY61-3606 hemmer et protein som er nødvendig for samlet levedyktighet i celler som uttrykker mutant K-RAS eller B-RAF og (2) at BAY61-3606 rettet mot en sti som er uavhengig av kanoniske MAPK /ERK signal.
for å teste den andre delen av denne hypotesen direkte målte vi aktiveringstilstand MEK og ERK i celler som ble behandlet med BAY61-3606. Vi fant at hemming av RAF med AZ-628 trykt MEK og ERK-fosforylering, men det BAY61-3606 var ute av stand til å gjøre det (fig. 1d). Således, mens AZ-628 og BAY61-3606 både selektivt påvirker levedyktighet i K-RAS mutante celler, de synes å gjøre det gjennom forskjellige baner, med BAY61-3606 rettet mot en sti som er uavhengig av MEK og ERK.
SYK er ikke målet for BAY61-3606 i celler som uttrykker mutant K-RAS
Gitt at BAY61-3606 opprinnelig ble utviklet som en ATP-kompetitiv hemmer av SYK [14], var det ikke overraskende at det dukket opp å målrette en MEK /ERK-uavhengig veien. Likevel gjør HCT-116 celler, som er følsomme for BAY61-3606, ikke uttrykke detekterbare nivåer av SYK, noe som tyder på at det ikke kan være målet for BAY61-3606 i denne sammenheng. For å utforske dette videre, brukte vi lentiviral shRNA å slå ned SYK i DLD-1 celler (Fig. 2a). Knockdown av SYK ikke påvirke samlet vekst heller ikke det påvirke responsen fra DLD-1 celler til BAY61-3606 (fig. 2b). Videre behandling av celler med R406, et strukturelt distinkt inhibitor av Syk, resulterte ikke i en preferensiell virkning på celler som uttrykker mutante K-RAS (fig. 2b). Samlet utgjør disse resultatene antydet at SYK var ikke relevant mål for BAY61-3606 i kolorektal kreft celler som uttrykker mutant K-RAS.
(a) knockdown av SYK protein i DLD-1 celler via shRNA, som vist ved Western blotting. Den Ramos (R) cellelinje, et hematopoetisk cellelinje med høy ekspresjon av Syk, ble anvendt som en positiv kontroll. (B) Celleviabilitet av DLD-1 celler (røde) og dets K-RAS villtype (DKS-8 – blå) og Syk knockdown (rød skygge) derivater etter 72 timers behandling med en iM BAY61-3606 eller R406, en tydelig SYK inhibitor. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til DMSO kjøretøy behandlet kontrollgruppe for hver cellelinje. Feilfelt representerer SEM for 3 uavhengige eksperimenter. DLD-1 celler og sin K-RAS vill-type derivat ikke vise følsomhet for R406, mens banket ned SYK i DLD-1 celler bare minimalt påvirket dens følsomhet for BAY61-3606.
BAY61- 3606 mål et lite antall kinaser
Vi antok at aktiviteten av BAY61-3606 i tykktarm kreft celler var på grunn av en «off-target» effekten av inhibitor, men lite var kjent om promiskuitet av denne spesielle sammensatte. For å identifisere andre potensielle mål av BAY61-3606, vi først analysert evne BAY61-3606 å hemmer kompetitivt aktive området binding i et panel av 402 kinaser. Vi fant at 1 uM BAY61-3606 hemmet binding av mer enn 90% etter bare 15 kinaser (fig. 3a, Tabell 1, Tabell S1), noe som indikerer at det er en meget selektiv inhibitor, lik i selektiviteten for to kliniske kinaseinhibitorer, imatinib og Gefitinib [20]. Siden hemming av aktive området binding kan, eller ikke kan, være direkte korrelert med hemming av kinase aktivitet, utførte vi en sekundær analyse der vi bestemt
in vitro
IC50 verdier for BAY61-3606 mot mange av disse kandidat mål. Denne studien viste MAP4K2, en STE-20 familie kinase, som kinase mest følsomme for BAY61-3606, med en
in vitro
IC50 på 11,3 nM (tabell 1).
(a) TREEspot bilde som representerer den hemmende aktivitet av BAY61-3606. Kinaser som er hemmet for ATP-binding av BAY61-3606 er angitt med røde prikker på fylogenetisk tre av kinaser. Størrelsen på rød prikk tilsvarer mengden av inhibering ved 1 uM BAY61-3606. Identiteten til de enkelte kinaser kan finnes i tabell S1. (B) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter shRNA-mediert knockdown av de potensielle BAY61-3606 målene i DLD-en (rød) eller DKS-8 (blå) cellelinjer. Relativ cellelevedyktighet er normalisert til foreldrecellelinjer infisert med vektor bare. Feilfelt representerer SEM for 2 uavhengige eksperimenter.
Genetiske analyser av potensielle BAY61-3606 mål
For å følge opp på vår biokjemisk analyse av BAY61-3606 aktivitet, vi brukt lentiviral shRNA for å bestemme hvorvidt knockdown av noen av de potensielle mål var i stand til å phenocopy behandling med medikamentet (dvs. for selektivt å påvirke levedyktigheten av K-RAS mutante celler) (fig. S1c, Tabell S2). For disse studiene, benyttet vi DLD-1 /DKS-8 isogene cellelinjer fordi vi har brukt dette par for genetisk analyse av SYK (fig. 2). Knockdown av bare en av de mulige mål som vi analyseres, HIPK2, var i stand til selektivt å påvirke levedyktigheten av K-ras mutante celler (Fig. 3b). Likevel, vi bare kunne identifisere en enkelt shRNA sekvens som produserte tilstrekkelig knockdown av dette målet. Som et resultat av denne studien var tankevekkende, men ikke avgjørende, med en rolle for HIPK2 som et mål for BAY61-3606 i celler som uttrykker mutante K-RAS. Vi søkte en uavhengig måte å identifisere målet for BAY61-3606.
Identifikasjon av biologisk aktive BAY61-3606 derivater
Sekundært til vår genetiske analyser, tok vi en kjemisk tilnærming til å studere BAY61-3606 . I denne studien genererte vi 30 strukturelt beslektede derivater av BAY61-3606 og analysert deres evne til selektivt å påvirke levedyktigheten av celler som uttrykker mutante K-RAS (fig. S2). Av disse 30 derivatene, bare en (-derivat 6) beholdt sin selektivitet med styrke tilsvarende moderforbindelse (fig. 4a, b, fig. S1b). Annet (f.eks derivat 8) beholdt selektivitet, men tapte potens. For å møte den selektivitet BAY derivat 6 i videre forstand, vurdert vi sin aktivitet i et panel av kolorektal kreft cellelinjer som enten var mutant for villtype for K-RAS. I samsvar med vår analyse av isogene par, uttrykker 4/5 cellelinjer mutasjons aktivert K-RAS svart på BAY derivat 6, mens 0/3 cellelinjer som uttrykker villtype K-RAS svarte (Fig. S3).
(a) GI50-verdier for BAY61-3606 derivater utført i HCT-116 (rød) eller hke-3 (blå) celler. Derivative seks ble valgt for videre studier for sin økt styrke og spesifisitet for K-RAS mutante celler. (B) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter 72 timer eksponering for BAY derivat 6 i HCT-116 (rød) eller HKE-3 (blå) celler. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til DMSO kjøretøy behandlet kontrollgruppe for hver cellelinje. Feilfelt representerer SEM for 3 uavhengige eksperimenter. HCT-116 celler var relativt følsom for BAY derivat 6.
For å sammenligne med BAY61-3606, analysert vi muligheten av flere derivater for å hemmer kompetitivt aktive området binding i et stort panel av kinaser. Bemerkelsesverdig, hver av de derivater som ble testet i det vesentlige mistet sin evne til kompetitivt å inhibere aktive sete binding av 402 kinaser som ble analysert, inkludert HIPK2 (fig. S4). I samsvar med denne observasjonen,
in vitro
aktivitetsanalyser viste et underskudd på kinase hemming aktivitet for de to derivatene som ble testet (Fig. S5).
BAY61-3606 mål MAP4K2 å påvirke responsen vill -type celler til AZ-628
i analysere relative aktivitetene til AZ-628 og BAY61-3606, testet vi hvorvidt disse to forbindelsene vil samarbeide for å produsere en forbedret effekt på celler som uttrykker mutant K-RAS, lik samarbeidende effekt sett med CI-1040 og BAY61-3606 i celler som uttrykker mutant B-RAF. AZ-628 og BAY61-3606 ikke samarbeide i HCT-116 celler (fig. 5a), men noe som tyder på at de kan være rettet mot en felles vei. Interessant disse to hemmere gjorde samarbeide for å negativt påvirke levedyktigheten av celler som uttrykker villtype K-RAS. I hovedsak HKE-3 celler som var formelt motstandsdyktig mot AZ-628 ble følsom når de ble også behandlet med BAY61-3606 (Fig. 5a). BAY-derivat 6, som beholdt sin evne til selektivt å undertrykke proliferasjon i celler som uttrykker mutante K-RAS (fig. 4b), mistet sin evne til å samvirke med AZ-628 in-celler som uttrykker villtype-K-RAS (Fig. 5b).
(a) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter 72 timer med kombinatorisk behandling med varierende konsentrasjoner av BAY61-3606 og 1fiM AZ-628 i HCT-116 (rød linje) eller HKE-3 (blå linjer) celler. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til DMSO kjøretøy behandlet kontrollgruppe for hver cellelinje. Feilfelt representerer SEM for 3 uavhengige eksperimenter. De to inhibitorene samarbeider i villtype-celler, men ikke i celler som uttrykker mutante K-RAS. (B) Celleviabilitet etter 72 timer med kombinatorisk behandling med varierende konsentrasjoner av BAY avledede seks og en mikrometer AZ-628 i HCT-116 og HKE-3 celler. BAY derivat 6 gir ikke ekstra følsomhet for AZ-628 på HKE-3 celler. (C) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter 72 timer med AZ-628 behandling i HCT-116 eller HKE-3 cellelinjer med MAP4K2 knockdown. Tap av MAP4K2 påvirker ikke AZ-628 respons i celler som uttrykker mutante K-RAS, men forsterker effekten av AZ-628 i celler som uttrykker vill-type K-RAS. (D) Celleviabilitet etter 72 timer med kombinatorisk behandling med en mikrometer BAY61-3606 og 1fiM AZ-628 (skyggelagt) eller 1fiM AZ-628 alene (klar) i HKE-3 celler med MAP4K2 knockdown. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til 1 uM AZ-628 behandlede prøver. I foreldre HKE-3 celler, overfører BAY61-3606 følsomhet for AZ-628. Ved tap av MAP4K2, BAY61-3606 ikke lenger sensitizes.
Med unntak av Syk, BAY61-3606 var mer enn 10 ganger mer effektiv ved å hemme MAP4K2 enn noen annen kinase. Videre BAY derivat seks mistet sin evne til effektivt å hemme
in vitro
kinase aktivitet MAP4K2 (Fig. S5). Basert på disse observasjonene, utforsket vi hvorvidt MAP4K2 spiller en rolle i følsomheten av villtype og K-RAS mutante celler til BAY61-3606. Hke-3 og DKS-8 celler som mangler MAP4K2 var hypersensitive for AZ-628, mens MAP4K2 knockout hadde ingen virkning på responsen hos HCT-116 eller DLD-1-celler (fig. 5c, fig. S6a). Vi antok at hvis inhibering av MAP4K2 ved BAY61-3606 stod for den endrede respons av villtype-celler til AZ-628, og K-ras villtype celler som mangler MAP4K2 vil ikke bli ytterligere sensibilisert for AZ-628 ved behandling med BAY61- 3606. Som spådd, BAY61-3606 og AZ-628 ikke klarte å samarbeide påvirke levedyktigheten i HKE-3 celler mangler MAP4K2 (Fig. 5d). Resultatene antyder sterkt at BAY61-3606 endrer responsen av celle som uttrykker vill-type K-RAS til AZ-628 ved å inhibere kinaseaktiviteten av MAP4K2.
MAP4K2 aktiverer NFkB veien for å motvirke AZ628-avhengig vekstinhibering
Gitt at MAP4K2 er viktig for responsen til villtype-celler til AZ-628, ved spurte vi hvordan MAP4K2 funksjoner for å regulere reaksjonen på RAF inhibering. For å identifisere veien ansvarlig for MAP4K2 action, brukte vi Bio-Plex fosfor-protein analyse for å måle effekten av MAP4K2 knockdown på ulike cellulære signalveier. Totalt profilert vi 13 fosfo-proteiner: Iκβα (Ser32 /Ser36), JNK (Thr183 /Tyr185), MEK1 (Ser217 /Ser221), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), RSK (Thr359 /Ser363) , p38 (Thr180 /Tyr182), c-Jun (Ser63), ATF2 (Thr71), AKT (Ser473), S6 (Ser235 /Ser236), STAT3 (Ser727), STAT3 (Tyr705), og GSK3α /β (Ser21 /Ser9 ) (fig. S7). Vi har funnet to forskjeller mellom hke-3 og HCT-116 som vi fremføres kan være relatert til funksjonen av MAP4K2. Først fant vi at basalnivået Iκβα fosforylering var betydelig lavere i HCT-116 enn i HKE-3 celler, noe som tyder på at NFκβ signale er undertrykt i celler som uttrykker aktivert K-RAS (Fig. S7). Iκβα fosforylering ble ytterligere indusert i hke-3-celler etter behandling med AZ-628, og denne induksjon var avhengig MAP4K2 (fig. 6a). Denne observasjonen er i overensstemmelse med tidligere studier som forbinder MAP4K2 til NFκβ signalering [21]. For det andre har vi funnet at JNK ble sterkt aktivert i HKE-3-celler etter behandling med AZ-628 (Fig. S7). Selv MAP4K2 har tidligere blitt koblet til JNK signalering, gjorde denne aktiveringen ikke ut til å kreve MAP4K2 (Fig. S6b).
(a) Tid løpet av fosfor-Iκβα (Ser32 /Ser36) aktivering etter 1fiM AZ- 628 behandling i HCT-116 (røde linjer) eller HKE-3 (blå linje) celler med MAP4K2 slå ned, målt via Bio-Plex. Relativ signalet ble normalisert til en master kontroll lysat. Feilfelt representerer SEM for 3 uavhengige eksperimenter. NFκβ signale ble forbedret i hke-3-celler etter eksponering for AZ-628, og dette var avhengig av MAP4K2. (B) Celleviabilitet kvantifisert ved Syto60 etter 72 timer med kombinatorisk behandling med IKK inhibitor VII og 1fiM AZ-628. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til DMSO kjøretøy behandlet kontrollgruppe for hver cellelinje. Som BAY61-3606, forsterket IKK-inhibitor VII virkningen av AZ-628 spesifikt i K-ras villtype-celler. (C) Celleviabilitet etter 72 timer med kombinatorisk behandling av en mikrometer IKK inhibitor VII og 1fiM AZ-628 (skyggelagt) eller 1fiM AZ-628 alene (klar) i HKe3 celler med MAP4K2 knockdown. Relativ cellelevedyktighet ble normalisert til 1 uM AZ-628 behandlede prøver. Tap av MAP4K2 avskaffet evnen til IKK inhibitor VII bevisst HKE-3 celler til AZ-628.
Siden NFκβ ble vist til hyper-aktivert i villtype celler i en MAP4K2 avhengig måte, vi antatt at hemming av NFκβ veien ville ha samme effekt som BAY61-3606 eller MAP4K2 knockdown. Det vil si at vi ventet at inhibisjon av NFκβ vil øke følsomheten av K-ras villtype-celler til AZ-628 uten å påvirke følsomheten av K-RAS mutante celler. Som forutsagt, hemming av NFκβ øket følsomheten av hke-3 og DKS-8 celler til AZ-628, i det vesentlige phenocopying MAP4K2 knockdown (Fig. 6b Fig. S6c). I motsetning til dette, har inhibering av JNK ikke endre følsomheten av hke-3-celler til AZ-628 (fig. S6d). Videre, som med BAY61-3606 behandling, knockdown av MAP4K2 avskaffet evne NFκβ hemming å sensibilisere villtype-celler til AZ-628 (fig. 6c). Fra disse dataene, konkluderer vi med at MAP4K2 funksjoner oppstrøms i NFκβ vei å regulere responsen av kolorektal kreft celler til hemming av RAF.
Diskusjoner
K-RAS er mutasjons aktivert i ca 40% av kolorektal kreft [2]. Aktivert K-RAS er tenkt å gi onkogenisitet via sine kanoniske nedstrøms signalveier, for eksempel RAF-MEK-ERK (MAPK) signalkaskade. I samsvar med denne ideen, aktiverende mutasjoner i B-RAF forekommer i 15% av kolorektal kreft, og de er gjensidig utelukkende med K-RAS-mutasjoner [22]. Ikke desto mindre inhibering av MAPK-signalering, for eksempel ved direkte inhibering av MEK, har vært stort sett ineffektive ved behandling av K-RAS mutant kolorektal kreft [9], [23]. Den manglende effekt av MEK-inhibitorer i denne sammenheng kan skyldes den pleiotropisk funksjon av K-RAS, som har vist seg å fremme transformasjon gjennom PI3K og RAL effektor-baner i tillegg til MAPK [24], [25]. Likevel, PI3K pathway mutasjoner forekommer også i kolorektal kreft og er ofte sammenfallende med K-RAS-mutasjoner, noe som tyder på at PI3K er ikke en vanlig effektor av K-RAS signalering i tykktarm kreft [26]. Og mens PI3K mutasjoner er forbundet med resistens overfor MEK-inhibitorer i kreftcellelinjer [27], [28], K-ras-mutant coloncancere fra genetisk modifiserte mus er egentlig resistente overfor inhibering av MEK [9]. Våre data er konsistente med en alternativ forklaring på den manglende effekt av MEK-hemmere i kolorektal kreft uttrykker mutant K-RAS -. At det finnes en alternativ /parallell vei nedstrøms av B-RAF som formidler K-RAS-indusert onkogenisitet
i vårt studium, karakterisert vi aktiviteten til et lite molekyl, BAY61-3606, som fortrinnsvis påvirkes levedyktighet i kolorektal kreftceller som uttrykker mutante K-RAS i forhold til isogene celler som uttrykker bare vill-type K-RAS (fig. 1a, fig. S1 A). Siden BAY61-3606 er en ATP-konkurrerende kinase inhibitor, dens evne til fortrinnsvis å påvirke celler som uttrykker mutante K-RAS innledningsvis antydet at det er rettet mot en kinase fungerende nedstrøms av K-RAS for å fremme proliferasjon. Vi har tidligere vist at K-RAS fremmer colon cancer celleproliferasjon gjennom en RAF-avhengig, men MEK-uavhengig, signalveien [9]. Tre stykker av bevis impliserer BAY61-3606 som en inhibitor av denne MEK-uavhengig reaksjonsvei nedstrøms for RAF. Først BAY61-3606 ikke samarbeide med AZ-628 i celler som uttrykker mutant K-RAS (Fig. 5a), noe som tyder på at disse hemmere rettet en felles vei. For det andre, BAY61-3606 påvirket vekst i KRAS mutante celler, men i motsetning til AZ-628, påvirket ikke fosforyleringstilstanden av MEK og ERK (Fig. 1d). Endelig BAY61-3606 bremset veksten av kolorektal kreft celler uttrykker mutant B-RAF og samarbeidet med en MEK hemmer for å produsere en forbedret respons i disse cellene (Fig. 1c).
Selv om BAY61-3606 ble først karakterisert som en ATP-konkurrerende kinase inhibitor, dens selektivitet for reduksjon av levedyktigheten av K-RAS mutante celler kan ikke kreve denne aktiviteten. Våre studier av BAY61-3606 derivater viser at de mangler evnen til å påvirke aktive sete binding kan fortsatt opprettholde deres evne til selektivt å påvirke cellenes levedyktighet. En mulig forklaring på denne observasjonen er at den aktuelle målet for BAY61-3606 og dets biologisk aktive derivater er en ikke-kinase protein. Bortsett fra å hemme kinaser, kan ATP-analoger påvirke biologi gjennom andre prosesser, inkludert nucleic syrer syntese [29], [30] og microtubule motorvogner [31]. Alternativt kan det relevante målet ikke være blant de 402 kinaser som er undersøkt i vår analyse eller BAY61-3606 og derivater kan hemme kinase aktivitet uten å påvirke aktive området bindende. I så fall ville de ikke scorer i vår skjerm
I tillegg til sin aktivitet i celler som uttrykker mutant K-RAS eller B-RAF, vi også identifisert en sekundær biologiske effekten av BAY61-3606.; det overdratt til villtype-celler, som normalt er resistente mot AZ-628, følsomhet for RAF-inhibering (fig. 5a). Ved hjelp av en rekke tilnærminger, identifiserte vi MAP4K2 som mål for BAY61-3606 i villtype celler.
