Abstract
Mål
Formålet med denne studien var å undersøke apoptose -promoting effekter og mekanismer hematoporfyrin monometyleter (HMME) -sonodynamic terapi (SDT) på livmorkreftceller
in vitro
.
Metoder
livmorkreft celleprøver ble delt inn i fire grupper: 1) ubehandlet kontrollgruppe, 2) HMME gruppe, 3) ren ultralyd-gruppe, og 4) HMME kombinert med ultralyd, dvs. SDT gruppe. CCK-8-metoden ble anvendt for å vurdere den inhiberende effekt av SDT på proliferasjonen av endometrial kreft celler. Optisk mikroskop og feltemisjonstransmisjons-elektronmikroskopi ble anvendt for å karakterisere morfologien endringer av kreftceller indusert av behandlingene. Apoptose rate, reaktive oksygenforbindelser (ROS) og mitokondriemembranen potensial (MMP) ble undersøkt ved strømningscytometer. Fluorescensintensiteten målt ved laser scanning konfokal mikroskopi ble benyttet for å utforske variasjonen av intracellulære kalsiumioner (Ca
2 +) konsentrasjon. Apoptose relaterte proteiner involvert i både indre og ytre apoptose signallings ble analysert ved western blot.
Resultater
SDT effektivt kan indusere apoptose av endometrial kreft celler. Sammenlignet med ultralyd som er kjent som et effektivt anti-tumor fremgangsmåte, fører SDT til en betydelig forbedring på undertrykkelse av cellelevedyktighet og induksjon av apoptose, sammen med mer bemerkelsesverdig modifikasjoner på morfologi og underkonstruksjonen i både ultralyd sensitive og resistente endometrial kreft celler. Videre studier viser at SDT fremmer ROS produksjon, induserer tap av MMP og øker intracellulær Ca
2+ konsentrasjon mer effektivt enn HMME eller ultralyd alene. SDT-grupper viser også en ganske høy ekspresjon av apoptose-fremmende proteiner, inkludert Bax, Fas og Fas-L, og en betydelig lav ekspresjon av apoptose-suspenderende proteiner, inkludert Bcl-2 og Survivin. I mellomtiden, som begge spaltes caspse-3 og kaspase-8 er dramatisk forbedret i SDT-grupper. Flere veier er foreslått i prosessen, herunder indre aktivering av overdreven ROS og overbelastet Ca
2 +, stanse Survivin genet, og den ytre vei mediert ved døden reseptoren.
Konklusjon
Gitt sin betydelige effektivitet i både ultralyd sensitive og resistente celler, SDT kan derfor være en lovende terapeutisk metode for behandling av livmorkreft
Citation. Sun H, Ge W, Gao X, Wang S, Jiang S, hu Y, et al. (2015) apoptose bringende effekt Hematoporphyrin Monomethyl Ether-Sonodynamic Therapy (HMME-SDT) på livmorkreft. PLoS ONE 10 (9): e0137980. doi: 10,1371 /journal.pone.0137980
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, CANADA
mottatt: 29 desember 2014; Godkjent: 29 juli 2015; Publisert: 14. september 2015
Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant nr 30872650); Program for New Century gode talenter i University of China (Grant No. NCET-09-0131); MY erkjenner økonomisk støtte fra rekrutteringsprogram for Global unge eksperter, Kina
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft er en av vanlige gynekologiske maligniteter, tradisjonelt behandlet av kirurgi og supplert med kjemoterapi og strålebehandling, som dessverre har en ganske lav følsomhet for tidlig eller metastatisk stadium av livmorkreft, normalt følger med betydelige bivirkninger [1-2]. Så langt er det fortsatt et åpent spørsmål hvor tidlig livmorkreft kan behandles samtidig bevare fruktbarhet. Og det er ingen rapport i litteraturen på orgel oppbevaring for pasienter på en middels eller avansert stadium. Selvfølgelig, en effektiv tilnærming med lav toksisitet er viktig.
tilskyndelse av apoptose er foretrukket i kreftbehandling [3]. Det er blitt vist at ultralyd kan forårsake apoptose av et stort utvalg av celler, slik som myeloid leukemi celler, lymfocytter og sarkomceller [4-6]. Men den forsinkede drepende virkning [7] sammen med ineffektiv effekt på ultralyd-resistente tumorceller kan i stor grad begrense dens klinikk anvendelser. Nylig, som en kombinasjon av ultralyd og sonosensitizers har sonodynamic terapi (SDT) blir en fascinerende ikke-invasiv anti-tumor fremgangsmåte med høy effektivitet og høy selektivitet i tumorcellene, og ingen åpenbare innflytelse på tilstøtende normalt vev [8-10]. Blant forskjellige kjemiske midler anvendt i SDT, hematoporfyrin-monometyleter (HMME) er særlig populær som en sonosensitizer på grunn av sin optimale optiske egenskaper og tilfredsstillende fortrinns retensjon i vev [11]. Enda viktigere, har HMME en mye høyere opptak renten med svulst enn normalt vev [10], og denne høye selektivitet sikrer ultralyd energi for å bli fokusert spesielt på kreftcellene.
Bruk av SDT på gynekologiske kreftformer er raskt voksende. Selv om en tidligere studie
in vitro
gjorde viser at metylenblått-mediert SDT kan signifikant øke de reaktive oksygenforbindelser i eggstokkreft celler og dermed indusere apoptose [12], SDT effekt på livmorkreft forblir uutforsket til nå.
i denne studien, påvirkning av HMME-SDT på begge ultralyd sensitive og resistente endometrial kreft celler har blitt undersøkt
in vitro
. Apoptose fremmende effekter og mekanismer er diskutert i lys av tilgjengelig informasjon.
Materialer og metoder
2,1. Cell Culture
Menneske endometrial adenokarsinom cellelinjer Ishikawa og HEC-1-en ble kjøpt fra Shanghai Bogoo bioteknologi. Co., Ltd. Cellene ble dyrket i et RPMI1640 (Hyclone, Thermo) oppløsning inneholdende 10% føtalt kalveserum (Hyclone, Thermo) og inkubert i en mettet fuktighet inkubator (HF240, Heal Force) ved 37 ° C med 5% CO
2. Forsøkene ble utført når cellene nådde den logaritmiske vekstfase.
2,2. Celle Overlevelse
Celler i den logaritmiske vekstfase ble plassert i 0,25% trypsin for fordøyelse og sentrifugering, og fremstilles i en enkeltcellesuspensjon med en konsentrasjon på 1 x 10
5 /ml. Cellene ble deretter sådd ut i 6-brønns plater. Det var fire eksempler på grupper som følger: 1) ubehandlet kontrollgruppe (kontroll), 2) HMME gruppe (HMME), 3) ren ultralyd gruppe (ultralyd), og 4) ultralyd kombinert HMME gruppe (SDT). For SDT gruppe, ble det tilsatt HMME en time før ultralydinterferens, som var 1,0 W /cm
2 på 1 MHz for 60 s for Ishikawa og 2,0 W /cm
2 på 1 MHz behandlet 240 s for HEC- 1-en. Og sluttkonsentrasjonen av HMME var 15 ug /ml for Ishikawa og 50 ug /ml for HEC-1-en. En våt svamp ble anbragt mellom bunnen av kulturplate og ultralydsonden for å unngå at flere refleksjoner av ultralyd. Etter bestråling ble cellene spaltet og samlet opp umiddelbart, og deretter overført til 96-brønners plater etter justering av konsentrasjonen med 100 ul i hver brønn. To timer senere ble 10 ul celletellingsleder-8-reagens (CCK-8, Dojindo) tilsatt til hver brønn. Etter en times ytterligere kultur, ble absorbans ved 490 nm målt ved anvendelse av en automatisk enzym-merket instrument (Multiskan MK3, Thermo) [13].
2,3. Forberedelse til Karakterisering av Cell morfologi og Underlag
Den morfologi og tilhenger vekst av celler ble observert 6h etter de fire ulike behandlinger ved hjelp av en invertert mikroskop (Olympus CKX4). Cellene ble digerert i 0,25% trypsin i 90-tallet, ble vasket med fosfatbufret saltoppløsning, deretter sentrifugert ved 2000 o /min i 5 min. Fjerning av supernatanten ble cellene fiksert mellom 2,5% glutaraldehyd og 1% osmic syre, dehydrert med etanol og aceton, innleiret i Epon812 epoksyharpiks, og kuttet med III ultratynne høvelen. Prøvene ble deretter dobbelt-farget med uranyl-acetat og bly-citrat, og deretter karakterisert ved anvendelse av en feltavgitransmisjonselektronmikroskopi (TEM, JEM-2010, JEOL).
2,4. Apoptose Analyse
6 timer etter behandlingene, celler av de fire gruppene som er nevnt ovenfor, ble oppsamlet og tellet, deretter bevart unngå lys i 15 min etter tilsetning av 10 ul fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket AnnexinV (20 ug /ml) for 1 × 10
6 celler. Deretter ble 5 ul propidiumjodid (PI) (50 ug /ml) tilsatt. Etter reaksjon i 5min, 400 mL bindende buffer var blandet. Prøvene ble testet av flowcytometeret (BD FACSCanto) umiddelbart.
2,5. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) og mitokondriemembranen potensial (MMP)
Etter ultralyd bestråling, ble cellene inkubert i 2 timer. 2’7′-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA, Beyotime) og Rhodamine123 (Sigma) med en sluttkonsentrasjon på 10 umol /L og 200 nmol /l ble tilsatt til hver prøve for ROS og MMP test. I begge tilfeller ble cellene dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 å unngå lys i 30 min. Fluorescensintensitet ble deretter målt ved hjelp av et flowcytometer ved en eksitasjon og emisjonsbølgelengde på 480 nm og 520 nm for ROS test, og 490 nm og 530 nm for MMP test, respektivt.
2,6. Bestemmelse av intracellulært kalsium (Ca) Ion Konsentrasjon
endometrial cancer celler av kontroll og SDT gruppe ble vasket tre ganger med fosfatbufferoppløsning, lastet med Fluo-3 /AM (Bio-Rad) med en sluttkonsentrasjon på 10 umol /l ved 37 ° C i 45 minutter, og deretter overført til et spesielt lite spor. Fluorescens intensitet ble testet av en laser scanning confocal mikroskop (Meridian, Insight-PlusIQ) på en argon laser eksitasjon av 488 nm. Den frie Ca
2 + konsentrasjonen i cellene ble kalibrert med ligningen: [
Ca
2+] =
K
d product: [ ,,,0],(
F Anmeldelser –
F
min) /(
F
max –
F
)], der
K
d
er 400 nmol,
F
er den målte relative fluorescens verdi,
F
max
er maksimal fluorescens verdi etter tilsetning av 10 umol /l 4-Br-A23187 høy Ca væske (10 mmol /LK
2CaEGTA, 10 mmol /L K-mopper og 100 mmol /l KCl, Bio-Rad Company),
F
min
er den minimale fluorescens-verdi etter tilsetning av 10 mmol /l 4-Br-A23187 Ca-fri løsning [14]. Dette er en relativt enkel og rimelig metode normalt til grunn for intracellulær Ca
2+ konsentrasjon.
2,7. Uttrykket av apoptotisk relaterte proteiner
apoptose-relaterte proteiner ble analysert 24 timer etter hver behandling av western blot. I korthet ble cellene høstet etter forskjellige behandlinger. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE-gel og så overført til PVDF-membraner, som ble først blokkert med 5% skummet melk og deretter inkubert med spesifikke antistoffer som indikert på figurene ved 4 ° C over natten. De pepperrot peroksidase-konjugerte second ble lagt etterpå. Uttrykket av proteiner ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) system (Thermo Scientific Pierce).
2,8. Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjengitt tre ganger uavhengig av hverandre i de forskjellige cellene. SPSS versjon 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois) ble anvendt for dataanalyser. Data er presentert som gjennomsnitt ± kvadratisk avvik (SD). Datoen ble analysert ved anvendelse av uparede t-test. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
3,1.. Effekt av SDT på overlevelse av endometrial kreft celler
For å evaluere effekten av SDT på cellenes levedyktighet, en CKK-8-analysen ble brukt til Ishikawa og HEC-en-a-celler ved forskjellige behandlinger som indikert i figur 1. overlevelses~~POS=TRUNC er redusert med enkel behandling av enten HMME eller ultralyd i både Ishikawa og HEC-en-en-celler (fig 1). Interessant er celleviabilitet av Ishikawa-celler ble redusert til 33,99 ± 4,06% med en MHz ultralyd (1,0 W /cm
2) i 60 s; mens ingen åpenbare veksthemming er observert i HEC-en-en-celler under samme tilstand (se S1A figur). Videre er det funnet at cellelevedyktigheten av HEC-en-a-celler opprettholdes ikke mindre enn 81,39 ± 4,83% ved behandling, selv med sterkere ultralyd (2,0 W /cm
2) i en lengre varighet fra 60 s til 240 s (S1B Fig). Dette indikerer direkte følsomheten av Ishikawa og motstand av HEC-1-en ved ultralydbehandling. Viktigere, som vist i figur 1, selv om ultralyd inhiberer cellelevedyktigheten for endometrial kreft celler til forskjellige forlenge, synergien av ultralyd med HMME kan konsekvent og vesentlig vekke en stor grad forbedret drepe effektivitet, det vil si 165% og 115% som for ultralyd alene HEC-1-en og Ishikawa-celler, respektivt.
CCK-8-analysen ble anvendt for å vurdere celle viabilities i kontroll, HMME, ultralyd og SDT-grupper i Ishikawa (a) og HEC-1-en (b ) -celler. HMME eller ultralyd viser en tydelig hemmende virkning på celle-overlevelse. SDT inhiberer cellelevedyktighet mer effektivt enn enten enkel behandling. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3), ** P 0,01.
3,2. Effekt av SDT på morfologi og Underlag av livmorkreft Cells
Sett fra bildene i figur 2, for kontroll og HMME grupper, er de fleste celler dyrket adherently og jevnt inn i en «rydder stein «struktur, viser tydelig kontur, god gjennomsiktighet og vitalitet; mens celler av ultralyd og SDT gruppe er lite gjennomsiktig, ikke er godt festet eller suspendert, og morfologien av delen celler blir sirkulær.
Morfologien og vedhengende vekst av Ishikawa (a) og HEC-1-en (b) celler ble observert 6 timer etter at de fire forskjellige behandlinger ved hjelp av et invertert optisk mikroskop (Olympus CKX4). Kontrollgrupper viser adherently vokst celler med tydelig kontur og god gjennomsiktighet; ultralyd og SDT gruppe viser dårlig gjennomsiktige celler som ikke er godt festet eller suspendert. Forstørrelsen av alle bildene er 40 ganger, skala bar = 100 pm.
Flere detaljer kan utforskes fra TEM bilder i figur 3. Det er funnet at cellene i kontroll og HMME gruppe besitter intakt celle- og kjernefysiske membraner, klare organelle strukturer og komplette mitokondrielle strukturer uten åpenbar endring. Med hensyn til ultralyd gruppe, er cellekjernen kromatin åpenbart kveilet eller stivnet og marginalisert; mitokondriene blir hovne, deformert og vacuolar, og lysosome er økt, som alle skiltene mot celle apoptose. For SDT gruppe, kan typiske fenomener av apoptose allerede observeres fra cellene, hvor kjernene er under innlysende pyknosis inn i en heterogen blokkstruktur, som viser små apoptotiske legemer, forstørrede perinukleære hull og nukleære porer, ekspandert Golgi-apparatet og endoplasmatisk retikulum etter degranulering, samt uskarpt eller forsvant mitokondrie cristae. Noen celler også vise akkumulert glykogen granulat i sitt cytoplasma med en redusert cellevolum.
konstruksjonen av de fire gruppe celler ble preget av transmisjonselektronmikroskopi (TEM, JEM-2010, JEOL). (A) kontroll og (b) HMME gruppe, som viser intakt cellemembran og kjernemembranen, klar organeller struktur og fullstendig mitokondriestruktur uten åpenbar modifikasjon; (C) ultralyd gruppe, viser tendenser til celle apoptose, inkludert kveilet eller stivnet og marginaliserte cellekjernen kromatin, deformert og vacuolar mitokondrier og økt lysosome; (D) SDT gruppe, som viser typiske fenomener av apoptose, hvor kjernene er under innlysende pyknosis inn i en heterogen blokkstruktur, med små apoptotiske legemer, forstørret perinukleær gap og atom pore, ekspandert Golgi-apparatet og endoplasmatisk retikulum etter degranulering, samt uklare eller forsvant mitokondrie cristae. Målestokken i alle bildene er 2 mikrometer.
3,3. Effekt av SDT på ROS Produksjon og MMP Reduksjon
Som vist i figur 4, den apoptotiske frekvensen av SDT, ultralyd, HMME og kontrollgruppen er 96,66 ± 0,45% 91,21 ± 3,44% 4,75 ± 1,10% og 0,42 ± 0,35%, henholdsvis, i Ishikawa-celler og 67,54 ± 12,65%, 18,88 ± 3,73% 43,50 ± 5,02% og 3,09 ± 1,37%, henholdsvis, i HEC-en-a-celler. Det induserte apoptose er inverst korrelert med cellelevedyktigheten bestemmes ved CCK-8-analyse i de fire forskjellige grupper (S1 Fig, og figur 4), noe som tyder på at apoptose er en av hovedmekanismene som attributt til den lave cellenes levedyktighet ved behandlinger. Apoptose priser i SDT grupper er betydelig økt sammenlignet med enten HMME eller ultralyd behandling alene i begge Ishikawa celler (p 0,05, figur 4B) og HEC-en-en-celler (p 0,01, figur 4D). Ikke desto mindre, SDT fremmer hovedsakelig tidlig apoptose i Ishikawa-celler (figur 4A), mens senere apoptose i HEC-1-et tilfelle (figur 4C).
apoptose nivåer er mye høyere i SDT-grupper enn kontrollen, HMME eller ultralyd grupper i Ishikawa (a og b) og HEC-1-en (c og d) celler. Representative FACS profiler ble vist i en og c. Histograms stede gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (b og d, * P 0,05, ** P. 0,01)
Intracellulær ROS er viktige formidlere av apoptose [15]. For å forstå hvorvidt SDT indusert apoptose er på grunn av ROS produksjon, ble ROS-nivåer visualisert ved DCF-A, en sonde som fluorescerer når oksidert. Det er funnet at blant fire forskjellige grupper, kan SDT mest betydelig øke ROS-nivåer i både Ishikawa og HEC-en-a-celler (P 0,01, figur 5). Sammenlignet med ultralyd, er det ROS generasjon frekvensen av SDT grupper økes opp til 1,48 ganger i Ishikawa celler (p 0,01) og 4,7 ganger i HEC-en-en-celler (p 0,01), henholdsvis
ROS-nivået er signifikant forbedret i SDT-grupper sammenlignet med kontrollgruppen, HMME, og ultralyd-grupper i Ishikawa (a og b) og HEC-1-en (c og d) celler. Representative FACS profiler ble vist i en og c. Histograms stede gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (b og d, ** P. 0,01)
Forbedret ROS kan indusere endringer av MMP, noe som ytterligere fremmer apoptose progresjon [16]. Mitochondrial membranpotensiale ble således målt fra celler behandlet med rhodamin. Som vist i figur 6, er en lett reduksjon av MMP observert i HMME og ultralyd grupper for både Ishikawa og HEC-en-a-celler. Viktigere, blir tapet av MMP mye mer tydelig i SDT-gruppen sammenlignet med den mono-behandlingsgruppene i begge cellelinjer som er involvert. (P 0,01)
Ishikawa (a og b) og HEC-1-en (c og d) ble utsatt for fire forskjellige behandlinger: kontroll, HMME, ultralyd og SDT. Tap av MMP ble mer tydelig i SDT-gruppen enn de andre gruppene. Representative FACS profiler ble vist i en og c. Histograms stede gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (b og d, ** P 0,01.)
3,4. Effekt av SDT på intracellulær Ca Ion Konsentrasjon
Som vist i figur 7 og tabell 1, Ca-konsentrasjon i Ishikawa endometriale celler for kontroll, HMME, ultralyd og SDT gruppe er over 92,533 nmol, 204,539 nmol, 2991,485 nmol og 3455.750 nmol hhv. Tilsynelatende intracellulær Ca
2+ konsentrasjon av ultralydbehandling kan økes til 32,3 ganger i forhold til den av kontrollgruppen, og SDT kan forårsake en ytterligere økning av konsentrasjonen til omtrent 37,3 ganger.
Fluorescence intensiteten av Ishikawa livmorkreftceller 1 time etter behandlingene ble testet av en laser scanning confocal mikroskop (Meridian, Insight-PlusIQ) på en argon laser eksitasjon av 488 nm. (A) Kontroll og (b) SDT gruppe, som viser intracellulært kalsium-ion-konsentrasjon i SDT er mye høyere enn i kontrollgruppen.
3,5. Effekt av SDT på Ekspresjon av apoptotisk-relaterte proteiner
For å forstå de molekylære mekanismer av SDT-indusert apoptose, aktivering av kaspase-3 og kaspase-8 ble først påvist ved western blotting etter forskjellige behandlinger. Som vist i figur 8, som begge spaltes caspase-3 og kaspase-8 blir betydelig forbedret i SDT-grupper, noe som tyder på begge casapses blir aktivert ved behandlingen. I tillegg er anti-apoptotiske protein Survivin og Bcl-2 og reduserte den pro-apoptotiske Bax økes med SDT. Videre død reseptor pathway markører, slik som Fas og Fas-L, blir også forsterket av SDT (figur 8). Disse dataene sammen antydet at både indre og ytre trasé har vært involvert i SDT-indusert apoptose
Ishikawa (a) og HEC-en-en (b) ble utsatt for fire forskjellige behandlinger:. Kontroll, HMME, ultralyd og SDT. Apoptose relatert markører ble påvist ved Western blotting med spesifikke antistoffer som angitt. β-actin ble brukt en lasting kontroll.
Diskusjoner
Selv om ultralyd har vært ansett som en effektiv behandling for kreft, utilfredsstillende å drepe effekter har blitt foreslått av HEC-en-en-celler i denne studien, og også ved tidligere arbeid [7]. Viktigere, SDT virker ikke bare effektivt på ultralydsensitive Ishikawa-celler, og også de ultrasounds resistente HEC-en-a-celler, noe som indikerer at SDT kan ha anvendelser på bredere spekter av kreftceller. Den synergistisk pro-apoptose effekt av kombinasjonen av HMME og ultralyd i livmorkreft kan tilskrives to forhold, det vil si den høye effektiviteten av HMME som sonosensitizer og drapet effekten av ultralyd.
SDT har normalt to drap moduser på kreftceller, dvs. nekrose og apoptose [17]. Den dominerende apoptotiske lignende endring av cellemorfologi og underkonstruksjonen vist i invertert mikroskop og TEM-bilder påpeker at apoptose er den viktigste døds måte av endometrial kreft celler i det foreliggende tilfelle. På grunnlag av våre eksperimentelle resultater, er mulige mekanismer for SDT på apoptose av endometrial kreft celler foreslått som følger:
(1) Tap av MMP av ROS generasjon og Bcl-2-familien vekslingen kan være en av SDT-indusert apoptose trasé.
Det er åpenbart at ROS i celler behandlet av SDT er mest overdreven blant alle prøvene. Under normale forhold, cellene selv kan slette kontinuerlig små molekyler som genereres under aerob respirasjon, inkludert singlett oksygen [18,19]. Men på en ubalansert tilstand, intracellulær ROS kan akkumuleres, skade mitokondriemembranen og redusere membranpotensialet [20-22]. Dette stemmer overens med de eksperimentelle resultatene, hvor ble observert den mest signifikante ROS genereringshastighet og MMP reduksjonsforhold samtidig i SDT-grupper. I tillegg er mitokondriemembranpotensialet også underkastet BCL-2 familiemedlemmer regulering. I denne studien er Bcl-2-familiemedlem, Bax øket og Bcl-2 er redusert i SDT-grupper. Den økte Bax kan dermed danne Bax /Bax homodimerer eller fiendskap BCL-2 anti-apoptose effekt gjennom forming Bax /BCL-2 heterodimerer på ytre membran av mitokondriene [23]. Slike endringer kan deretter øke membranpermeabilitet slik at apoptose-fremmende faktorer, slik som cytokrom c, vil frigjøre fra mitokondrier til cytosol, hvor de utløser kaspase-kaskader, og til slutt føre til apoptose av endometrial kreft celler. Derfor konkluderer vi at overdreven ROS og endringer av BCL-2 familiemedlemmer i SDT kan aktivere den iboende apoptose vei ved å påvirke mitokondriene membranpotensialer.
(2) Overbelastede Ca-ioner i celler kan være en annen stor egenverdi faktor for cellen apoptose i SDT.
overbelastning av Ca-ioner involverer ulike apoptose prosesser, særlig oppstrøms regulerings seg. Ca-ioner er normalt lagret i endoplasmatisk retikulum. Det endoplasmatiske retikulum spenning på grunn av overdreven ROS [14] kan øke Ca
2+ lagringskapasitet av celler, så vel som aktiveringshastigheten av Ca
2+ inn i cellene. Som vist av de nåværende konfokalmikroskop resultater, Ca
2 + overbelastning i cellene er ganske alvorlig for SDT gruppe. Siden utgivelsen av cytokrom c har en positiv tilbakemelding på Ca
2+ konsentrasjon [24-26], Ca
2 + overbelastning i SDT kan være en annen stimulerende for den store utgivelsen av cytokrom c, som så aktiverer caspase-3 og indusere celle apoptose som nevnt ovenfor.
(3) SDT kan effektivt dempe overleve genet.
Nylig har det blitt vist at survivin uttrykk satsen i livmorkreft vev er (100%) høyere enn det i lengre endometrial hyperplasia (73%) [27], noe som tyder på at survivin kan være nært knyttet til malign transformasjon av endometrium. Enda viktigere, har tidligere arbeidet påpekt at overlevelsen protein survivin kan sterkt hemme apoptose stimulert av ulike faktorer [28]. Dempe survivin kan derfor bryte beskyttelse og favorisere apoptose av kreftceller. I dette arbeidet har SDT blitt demonstrert å være en effektiv måte for å undertrykke dette genet, som fører til en usedvanlig svekket ekspresjon av Survivin og mer effektiv aktivering av kaspase-8 og caspase-3, sammenlignet med de tre andre gruppene.
(4) ytre vei kan bistå de indre faktorene for apoptose i SDT.
tilstedeværelsen av Fas /Fas-l er et tegn på død reseptor-mediert ytre apoptose sti hvor caspase-8 fungerer som en viktig innvielse caspase og caspase-3 er den utøvende caspase. Våre resultater viser at døden reseptorproteiner Fas /Fas-l signifikant økt i SDT-grupper og både caspase-8 og caspase-3 aktiveres med den samme behandling, som direkte angir aktivering av ekstrinsiske apoptotiske baner i respons til SDT.
Oppsummert kan SDT hemme proliferasjonen av endometrial kreft celler, mye mer effektivt enn HMME eller ultralyd alene i både ultralyd sensitive og resistente celler. Den apoptose indusert av HMME-SDT involverer flere veier, inkludert indre apoptotiske sti aktiveres av ROS generasjon, MMP reduksjon og Ca
2 + overbelastning, effektiv stillhet survivin genet, sammen med Fas /Fas-l-mediert ytre apoptose veien. Tatt i betraktning den bemerkelsesverdige effektivitet i både ultralyd sensitive og resistente celler, kan HMME-SDT derfor har åpnet opp en ny rehabilitering veien for pasienter som ikke kan overleve fra kirurgi, strålebehandling eller kjemoterapi, og som trenger bevare organer og selv reproduktive funksjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Ultralyd følsomhet av endometrial kreft celler analysert ved CKK-8-analyser. Product: (a) Ishikawa og HEC-1-en-celler ble behandlet med ultralyd (1 MHz) ved intensitet på 1,0 W /cm
2 til 60 s og deretter underkastet en CKK-8-analyse. Ishikawa er mer følsom for ultralydbehandling enn HEC-1-en. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3), ** P 0,01. (B) ultralyd motstandsdyktig HEC-1-en-celler ble behandlet med ultralyd ved en øket intensitet på 2,0 W /cm
2 i 0 s, 60 s, 120 s og 240 s, henholdsvis. En svak og tidsavhengig cellelevedyktighet inhibering observert med behandlingene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137980.s001 plakater (TIF)
