Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er blant de dødeligste av kreft hos mennesker, på grunn av den sene diagnose samt sin intense motstand til nå tilgjengelige behandlingsformer. For å identifisere mekanismer for hvorfor PDAC er motstandsdyktige overfor DNA skade cellegiften cellegift og stråling, utførte vi en global avhør av DNA skade respons av PDAC. Vi finner at PDAC celler generelt båtplass høye nivåer av spontan DNA-skader. Inhibering av ikke-Homolog End Blir (NHEJ) reparere enten farmakologisk eller ved RNAi resulterte i en ytterligere akkumulering av DNA-skade, inhibering av veksten, og til slutt apoptose selv i fravær av eksogent DNA-ødeleggende midler. Som svar på stråling, PDAC celler er avhengige av NHEJ vei til raskt å reparere DNA-dobbelttrådbrudd. Mekanistisk når NHEJ er sperret er det en kompenserende økning av homolog rekombinasjon (HR). Til tross for dette oppregulering av HR, DNA-skade vedvarer og celler er betydelig mer følsomme for stråling. Sammen utgjør disse funnene støtter inkorporering av NHEJ inhibering inn i PDAC terapeutiske tilnærminger, enten alene, eller i kombinasjon med DNA-ødeleggende behandling som stråling
relasjon:. Li YH, Wang X, Y Pan, Lee DH, Chowdhury D, Kimmelman AC (2012) Hemming av ikke-homolog End Bli Reparasjon svekker Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Vekst og Forbedrer Radiation Response. PLoS ONE 7 (6): e39588. doi: 10,1371 /journal.pone.0039588
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 16 januar 2012; Godkjent: 25 mai 2012; Publisert: 18 juni 2012
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. ACK er støttet av National Cancer Institute Grant R01CA157490, Kimmel Scholar Award, og AACR-PanCAN Career Development Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. ACK er en konsulent for Forma Therapeutics og for Dainippon Pharma. Han har mottatt forskningsmidler fra Karyopharm terapi for en ikke-relaterte prosjekt og har fått en talende godtgjørelse fra Pfizer. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) forblir den fjerde ledende årsak til kreft dødelighet i USA [1], og er karakterisert ved en intens resistens mot kjemoterapi og ioniserende stråling (IR). På grunn av dette, vil de fleste pasienter etter for sykdommen sin i mindre enn ett år og nye terapeutiske tilnærminger er strengt nødvendig. Genomiske ustabilitet er et av kjennetegnene på kreft [2] og i samsvar med dette vi og andre har vist at bukspyttkjertel kreft viser ekstremt høye nivåer av genomiske forandringer [3]. Videre bukspyttkjertel kreft er dypt motstandsdyktig mot DNA-skadelige behandlingsformer som for eksempel cytostatika og strålebehandling [4]. Men den biologiske betydningen av genomisk ustabilitet i denne sykdommen, og hvordan dette kan påvirke responsen på DNA skade terapier er relativt uutforsket.
Doble strandet pauser (DSB sin), forårsaket av stråling eller andre DNA skadelige stoffer, antas å være den mest farlige DNA lesjoner som truer cellular overlevelse. Som svar på ioniserende stråling, er DSB sin oppdaget av Mre11-Rad50-Nbs1 kompleks (MRN kompleks) og Ku70 /Ku80 komplekser som raskt aktiverer ataksi telangiectasia mutert (ATM) og DNA-PK henholdsvis [5]. Aktivering av disse kinaser induserer en serie av cellulære hendelser, inkludert fosforylering av cellesyklus sjekkpunkt proteiner og initiering av DNA-reparasjonsprosessen. Histone H2AX, et viktig substrat for ATM og DNA-PK, er fosforylert på serin 139 (referert til som γH2AX), som danner brennpunkter på DSBs nettsider forbundet med andre reparasjons faktorer [6].
To store veier eksisterer å reparere DSB sin -homologous rekombinasjon (HR) og ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) [7], [8]. HR-rettet reparasjon krever en homologe kromosomer eller en søster kromatid som en mal for å reparere DNA med hi-fi, og derfor er det forekommer hovedsakelig i S- og G2- faser av cellesyklusen når malen er tilgjengelig. I motsetning til HR, NHEJ reparasjoner DSB ved ligering av to DNA ender følgende DNA sluttbehandling. Slutten behandling fører ofte til tap av nukleotider og gjør NHEJ utsatt for feil [9]. NHEJ er aktiv i løpet av cellesyklusen. Derfor cellesyklus scenen og arten av DNA-endene er to faktorer som bestemmer reparasjon valg mellom HR og NHEJ [7], [10]. I tillegg har DNA-PK-aktivitet i seg selv vært implisert i inhibering av HR [11], [12]. Viktigere, kreftceller viser ofte unormalt i DNA skade respons og defekter i DNA-reparasjon som kan korrelerer med endret uttrykk for reparasjon proteiner. For eksempel, høyere ekspresjon av NHEJ proteiner, DNA-PK og Ku70 /80 er rapportert i kreftcellelinjer [13], [14], [15], [16] Det er imidlertid den DNA-skade respons og DNA-reparasjon i PDAC celler forblir relativt uutforsket.
Her er vi undersøkt betydningen av DNA-reparasjon i PDAC biologi og finner ut at PDAC celler havn forhøyede nivåer av basal DNA-skader. Inhibering av NHEJ fører til økt DNA-skade, og til slutt redusert spredning. Som svar på NHEJ inhibering, er HR oppregulert men celler er ikke i stand til å reparere DNA-skade effektivt som respons på bestråling. Dette resulterer i økt stråling følsomhet som dokumentert av redusert klonogene overlevelse. Våre data implisere NHEJ hemming som en potensiell terapeutisk tilnærming i PDAC.
Resultater
Basal DNA-skader i PDAC
I et forsøk på å forstå hvorfor PDAC er dypt motstandsdyktig mot DNA skade behandlinger, for eksempel cytostatika og strålebehandling, foretok vi en innsats for å forstå DNA skade respons og DNA reparasjon i disse svulstene. Som et første trinn ble det basale nivåer av DNA-skader undersøkt i en samling av 18 PDAC cellelinjer, så vel som en ikke-transformert udødeliggjort human pankreatisk duktus cellelinje (HPDE) [17] som en kontroll. Western blot analyse for γH2AX, en mye brukt markør for DNA-skader, spesielt DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) [18], [19] ble utført. Påfallende, mer enn halvparten av PDAC cellelinjer viste forhøyede nivåer av γH2AX (figur 1A og 1B) sammenlignet med HPDE. For å bekrefte at de forhøyede nivåer av γH2AX var ikke bare på grunn av økte nivåer av total histoner, vi normalisert nivåene av γH2AX til total H2AX i utvalgte cellelinjer (data ikke vist) og viste at disse linjene fortsatt å ha forhøyet γH2AX forhold til HPDE celler. Som ytterligere bevis på forhøyet DNA-skade i PDAC, ble γH2AX immunfluorescens utført i representative PDAC cellelinjer. Disse analysene var stort sett i samsvar med de vestlige blot data, med brennpunktene i PDAC linjer vanligvis høyere enn i HPDE (figur 1C og 1D). For å direkte måle DNA-skade, ble nøytrale komet analyser utført for å vurdere hvor mye dobbel-strand pauser i henhold basale forhold. Igjen i samsvar med γH2AX data, fire av de fem PDAC cellelinjer analysert viste en statistisk høyere hale øyeblikk enn det som i HPDE (figur 1E), noe som indikerer økt DSB sin. Tatt sammen indikerer disse data at PDAC celler ofte har forhøyet basale nivåer av DNA-skade som kan føre til aktivering av en DNA-skade reaksjon.
(A) Western blot-analyse av γH2AX i HPDE og 18 PDAC cellelinjer. Prøver fra 8988T og Panc1 bestrålt ved 4Gy ble brukt som positive kontroller og aktin tjente som lasting kontroll. Forsøkene ble utført minst tre ganger. (B) Kvantifisering av γH2AX uttrykk ved densitometri var normalisert til aktin uttrykk og presentert som i forhold til HPDE. Data vist fra tre uavhengige eksperimenter med feilfelt representerer standardavvik. (C) Immunofluoresence for basal γH2AX foci i tre representative cellelinjer (HPDE, 8988T og VVS). Grønn: γH2AX; Blå: DAPI (kjernen). Scale bar lik 10 mikrometer. Kvantifisering ble utført i (D) og er vist som prosentandelen av celler med mer enn 5 foci. Forsøkene ble utført tre ganger og gjennomsnittsverdiene ble beregnet. Feilstolpene representerer standardavviket fra tre individuelle eksperimenter. (E) Nøytral kometen analysen ble utført for å direkte vurdere DNA-dobbelttrådbrudd og dataene uttrykt som hale øyeblikk (Tail øyeblikk = hale lengde ×% av DNA i halen). For alle paneler, stjernetegn viser en statistisk signifikant økning i forhold til HPDE av t-test (p≤0.05).
DNA Repair Pathways i PDAC
De to store DNA reparasjons trasé for dobbel tråd pause reparasjon er homolog rekombinasjon (HR) og ikke-homolog ende bli reparasjon. HR reparasjon krever en homologe kromosomer eller en søster kromatid som en mal og skjer hovedsakelig i S eller G2 fasen av cellesyklus til nettopp reparere skadet DNA [7]. NHEJ imidlertid reparasjoner DNA ved direkte å ligere DNA slutter etter sluttbehandling som ofte introduserer tap av nukleotider og gjør NHEJ utsatt for feil [9]. Gitt de forhøyede basale nivåer av DNA-skader i PDAC, vurdert vi profesjonalitet av disse cellene for HR og NHEJ. For å måle den relative mengde av HR, utførte vi immunfluorescens for Rad51, en kritisk HR-protein som bindes til enkelt-trådede DNA-overheng og katalyserer prosessen med DNA-tråden utveksling. Dannelsen av Rad51 foci er en sensitiv og spesifikk indikator for HR [20], [21]. Basalnivåer av Rad51 foki var lav i 8988T PDAC celler så vel som i HPDE celler (figur 2A). Mens HPDE-celler viste en markert økning i Rad51 foci med økende doser av stråling, 8988T-celler viste en betydelig lavere økning i brennpunkter selv ved 5 Gy av stråling (figur 2A). Gitt de minimale nivåer av HR sett i denne PDAC linje, spekulert vi at disse cellene kan stole primært på NHEJ for reparasjon. For å vurdere NHEJ, benyttet vi et godt karakterisert luciferase-basert plasmid reparasjon analyse [22], [23]. I korte trekk, er et kutt luciferase plasmid (PGL2) transfektert inn i celler og reparasjon via NHEJ er målt ved relative luciferase aktivitet. Begge 8988T og Panc1 PDAC linjer demonstrert ferdigheter i NHEJ som vist i figur 2B.
(A) HR som svar på økende doser av stråling (0, 2 og 5 Gy) ble målt ved Rad51 foci dannelse og uttrykk som gjennomsnittlig foci per celle. Foci er økt i HPDE celler med økende doser av stråling, mens kun minimalt endret i 8988T celler. Dataene er hentet fra to uavhengige eksperimenter utført med replikere Dekk med feilfelt representerer standardavvik. Stjernene viser en statistisk signifikant forskjell ved t-test (p≤0.05). Representative bilder er vist nedenfor. (B) NHEJ målt ved hjelp av et plasmid luciferase reparasjon assay. Dataene er normalisert for transfeksjon effektivitet og deretter til uncut luciferase. Både Panc1 og 8988T cellene vise nevneverdig NHEJ reparasjon. Knockdown av Ku80 markert redusert NHEJ i Panc1 celler. Feilfelt representerer standardavvik av tre uavhengige forsøk.
DNA-PK er nødvendig for PDAC vekst
Gitt resultatene fra DSB reparasjon analyser, neste spurte vi om PDAC celler er avhengige av NHEJ for normal spredning og vekst. Fokuserte vi på inhibering av DNA-PK, som består av Ku70 /Ku80 heterodimert protein og den katalytiske subenhet, DNAPKcs, og er essensiell for NHEJ [24]. Ved hjelp shRNAs, undertrykt vi uttrykk for de regulatoriske subenheter av DNA-PK, Ku70 og Ku80 i 8988T celler. Begge shRNAs produsert en sterk reduksjon av ekspresjonen av Ku70 eller Ku80 i 8988T-celler, som ble påvist ved QRT-PCR for Ku70 og Ku80 og ved western blot for Ku70 (figur 3A). Uttømming av Ku70 eller Ku80 vesentlig hemmet forankringsuavhengig vekst av 8988T vurdert ved softagar analyser, samt spredning av vekstkurven analysen (figur 3B og 3C). Undertrykkelse av Ku70 eller Ku80 også redusert vekst på ytterligere to PDAC cellelinjer, HupT3 og BXPC3 (figur 3C). I motsetning til PDAC, uttømming av Ku70 eller Ku80 i HPDE, MCF7- (en brystkreft cellelinje) eller H460 (en lungekreft cellelinje) viste mer beskjedne effekter på spredning (figur 3C). Disse dataene antyder at PDAC celler krever Ku70, Ku80 for vekst. For ytterligere å analysere kravet om NHEJ for å opprettholde PDAC vekst, et farmakologisk DNA-PK-inhibitor, NU7026 [25], [26], ble anvendt for å undersøke involveringen av DNA-PK i PDAC vekst. NU7026 behandling signifikant redusert på forankrings-uavhengig vekst av celler PDAC, mens veksten av H460 og MCF7 ikke ble påvirket selv ved de høyeste doser (20 pM) (Figur 4A). I tillegg bestemmes vi følsomheten til en samling av PDAC linjer til NU7026 ved å bestemme IC50s (fig 4C). Mer enn halvparten av linjene var følsomme for DNA-PK hemming. NU7026 også redusert klonogene overlevelse av 8988T PDAC celler (figur 4B). Sammen dataene støtter at PDAC celler er avhengige av NHEJ DNA-reparasjon for vekst under basale forhold.
(A) Undertrykkelse av Ku70 eller Ku80 uttrykk i 8988T celler ved shRNAs oppdaget av kvantitativ real-time PCR (til venstre) og western blot (til høyre). (B) Øvre panel: representative bilder av myk agar-kolonidannelse 8988T celler infisert med enten en kontroll shRNA til GFP eller to ulike shRNAs til henholdsvis Ku70 eller Ku80. Nedre panel: kvantifisering av soft agar-kolonidannelse 8988T celler i forhold til shGFP infiserte celler. Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk og feilfelt representerer standardavvik. To stjerner indikerer statistisk signifikans:
P
0,01 ved t-test (C) vekstkurve analysene ble utført for å vurdere effekten av hemming av NHEJ av Ku70 og Ku80 knockdown på PDAC vekst. Legg merke til robust undertrykkelse av vekst i PDAC cellelinjer (8988T, HupT3, BXPC3) og bare beskjedne effekter på andre cellelinjer (MCF7, H460 og HPDE).
(A) Soft agar analyser i 8988T PDAC celler og tumorcellelinjer av andre histologier (H460 og MCF7) med økende doser av DNA-PK-inhibitor NU7026 viser den doseavhengige inhibering av forankrings-uavhengig vekst i PDAC celler, men bare minimale virkninger på andre cellelinjer analysert. Stjernene viser en statistisk signifikant forskjell ved t-test (p≤0.05). (B) klonogene overlevelse av 8988T celler behandlet med NU7026 viste nedsatt klonogene vekst. (C) IC50s til NU7026 over et større panel av PDAC cellelinjer viser de fleste er følsomme for DNA-PK hemming. Feilfelt representerer standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter. (D) NU7026 behandling av 8988T celler indusert DNA-skade og apoptose målt ved γH2AX og spaltes caspase-3 respektivt. 8988T-celler ble behandlet med NU7026 eller DMSO som en kontroll for en dag eller i syv dager, etterfulgt av western blot analyse. Økt DNA-skade ble observert på et tidlig (dag 1) endepunktet med økende skader og til slutt apoptose sett på dag 7. (E) HPDE-celler i sammenligning viser en liten økning i γH2AX uttrykk, men meget minimal økning i spaltede caspase-3.
En mulig utfall, når skadet DNA er igjen ureparert er at cellene vil etter hvert gjennomgå apoptose [27], [28]. For å vurdere de cellulære konsekvensene av DNA-PK hemming på PDAC celler, så vi på markører for DNA-skade og apoptose etter kort (1 dag) eller lang sikt (7 dager) behandling med NU7026. Ja, vi fant at DNA-PK hemming for en dag forårsaket ytterligere skade på DNA analysert ved γH2AX. Men på syv dagers endepunktet, økt kløyvet caspase-3 uttrykk ble klart indikerer at apoptose kan være forhøyet i NU7026 behandlede celler, men ikke i DMSO behandlet kontrollceller (Figur 4D). I kontrast til behandling av HPDE celler med NU7026 viste økt γH2AX med svært minimal kløyvde caspase-3 uttrykk (Figur 4E). Dermed hemming av NHEJ sti fører til en ytterligere akkumulering av DSB sin, sjekkpunkt aktivering og til slutt apoptose i PDAC celler.
DSB reparasjon i PDAC etter IR er avhengig av DNA-PK
For ytterligere utforske responsen av PDAC celler til DNA-skade, målte vi reparasjonskinetikken av tre PDAC cellelinjer følgende IR ved overvåking γH2AX foci i 30 min, 2, 6 og 12 timer etter IR med en klinisk relevant dose av 2Gy. γH2AX foci toppet seg på rundt 30 minutter etter IR. Ved 12 timer etter IR, antall γH2AX foci i alle tre PDAC cellene returnert til basalnivået. Vi fant videre at reparasjon av alle tre PDAC cellelinjer ble betydelig svekket ved inhibering av DNA-PK, hvilket indikerer at reparasjon av DSB i PDAC-celler er svært avhengig av NHEJ (figur 5A). Interessant, inhibering av DNA-PK hadde bare en minimal effekt på reparasjon av HPDE celler (figur 5A). Vi neste undersøkt hvordan HR reparasjon ble påvirket av hemming av NHEJ. Som vist tidligere, HR var lavere i 8988T cellene selv etter IR forhold til HPDE. Imidlertid HR var signifikant økt i nærvær av NU7026 i 8988T-celler etter IR (figur 5B). Til tross for den tilsynelatende kompensatorisk økning i HR i 8988T celler hvor NHEJ inhiberes, antallet γH2AX foci er fremdeles høy (figur 5A), som indikerer at dette er fremdeles ikke er tilstrekkelig for fullstendig reparasjon.
(A) Reparasjon kinetikken av tre PDAC cellelinjer (8988T, Panc1 og BXPC3) ble målt ved γH2AX farging ved forskjellige tidspunkter etter stråling. Dataene er vist som foci nummer per celle, normalisert til 30 min endepunktet når foci dannelsen var maksimal. Hver cellelinje ble behandlet med NU7026 (20 uM) eller DMSO. I hver linje oppløsningen av foci ble vesentlig forsinket med NU7026 behandling. Lignende eksperimenter ble utført i HPDE-celler (høyre panel). Merk at NU7026 ikke dempe foci oppløsning i disse cellene. (B) HR er økt som en kompensatorisk respons på NHEJ hemming i PDAC celler. Rad51 foci-dannelse markert øket når DNA-PK-aktivitet inhiberes av NU7026. Venstre panel: Rad51 foci i grønt og kjernen i blått vist ved DAPI farging. Høyre panel: kvantifisering av foci per celle ved de angitte betingelser. Data er vist fra to uavhengige forsøk med feilfelt representerer standardavvik av gjennomsnittet.
NHEJ hemming sensitizes PDAC til IR
Hemming av NHEJ øker DNA-skader som fører til redusert vekst og apoptose i PDAC celler, så vel som resulterer i forlenget nærvær av DNA-skade foci følgende stråling. Derfor ville NHEJ hemming være forventet å forbedre effekten av stråling. Både 8988T og Panc1 celler viste økt følsomhet for IR når de ble behandlet med NU7026, som vist ved redusert klonogene overlevelses (figur 6A). Tilsvarende 8988T og Panc1 celler med Ku70 eller Ku80 knockdown var også mer følsomme overfor IR (figur 6B). I samsvar med den reduserte klonogene celleoverlevelse, en økt andel av 8988T celler ble arrestert i G2 /M-fasen av cellesyklusen når cellene ble behandlet med NU7026 og IR (71,88% mot 27,26% i den bestrålte kontroll) sammenlignet med kontroll behandles eller bestrålte celler (figur 6C).
(A) hemming av DNA-PK med NU7026 radiosensitizes 8988T og Panc1. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater i triplikat og behandlet med DMSO eller NU7026 20 uM neste dag. Celler ble underkastet IR- etter over natten behandling med DMSO eller NU7026. Etter 9 dager, ble cellene fiksert, farget, og kolonier telles. Den overlevende fraksjonen ble beregnet ved hjelp av plating effektivitet. (B) Undertrykkelse av Ku70 eller Ku80 radiosensitized PDAC cellelinjer, 8988T og Panc1. 8988T eller Panc1 celler ble infisert med shKu70 eller shKu80 og shGFP ble brukt som kontroll. Analyser ble utført som i (A). (C) Typisk cellesyklusfordelingen av 8988T ved angitte behandlinger. 8988T-celler ble behandlet med NU7026 eller DMSO i to dager etterfulgt av IR på 2Gy og farget med propidiumjodid 24 timer senere. Cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri. Forsøkene ble gjentatt tre ganger og vist er representativt resultat.
Diskusjoner
bukspyttkjertel kreft er dypt resistente mot dagens terapeutiske tilnærminger, inkludert de som jobber via indusere DNA-skade som ulike cytotoksiske chemotherapies og stråling. Dermed forstå responsen av disse svulstene til DNA-skader kan gi viktige terapeutiske innsikt. Vårt arbeid viser at bukspyttkjertelcancercellelinjer ofte ha forhøyet nivå av basal DNA-skade i fravær av eksogene skadelige stoffer. Selv om den nøyaktige etiologien til øket basal DNA skader ikke er kjent, er det fristende å spekulere at den konstante genomiske ustabilitet at disse tumorene tåle [3] kan være delvis ansvarlig. For eksempel, under prosessen med genomisk forsterkning, brudd-fusjons-bro sykler forekomme noe som resulterer i dannelsen av kontinuerlige transiente DSB [29]. Disse og andre genomiske hendelser ofte sett i PDAC, for eksempel translokasjon, kan fremme en stabil tilstand av DNA-skader.
Våre funn tyder også på at NHEJ er den viktigste veien ansvarlig for DSB reparasjon i kreft i bukspyttkjertelen celler som hemming av NHEJ opphever den raske reparasjon kinetikk. Sammen vil bevisene tyder på et scenario der disse svulstene har utviklet en avhengighet av NHEJ å overleve kontinuerlig genomisk ustabilitet og den resulterende DNA-skader som følger. Valg av DSB reparasjon sti og forholdet mellom HR og NHEJ er av stor vitenskapelig interesse, og mens de nøyaktige molekylære grunnlaget for veien utvalget er under utarbeidelse, er det sannsynlig at minst en del av reparasjons valget er diktert av cellesyklus , som HR kan bare fungere i S /G2 /M [7]. Vi viser at HR er ganske lav i PDAC celler, selv i respons på IR. Det er imidlertid en kompensatorisk økning i HR når NHEJ hemmes, men, det er utilstrekkelig til å forhindre genotoksiske nivåer av DNA-skade.
I tillegg er resultatene er også i linje med den siste terapeutiske tilnærminger i BRCA1 og 2 mutante svulster ved hjelp av PARP-inhibitorer. Denne «syntetiske dødelighet», hvor tumorer med et enkelt DNA-reparasjon reaksjonsvei som er svekket HR er sensitive for hemning av en andre reparasjon bane (f.eks BER), har fått mye oppmerksomhet [30], [31], [32]. I tråd med begrepet hemme DNA reparasjon trasé som en terapeutisk tilnærming, PDAC viser en følsomhet for NHEJ hemmere. En mulig forklaring er at den forhøyede basal DNA skade tjener til å overvelde DSB reparasjon noe som gjør dem utsatt for hemming av NHEJ eller andre DNA reparasjons veier.
Til slutt, hemming av NHEJ viser en sterk synergi med stråling. Dette er ikke uventet fra et mekanistisk synspunkt, men kan ha klinisk betydning ved behandling av sykdommen. Mens fjernt sykdom er en vesentlig årsak til dødelighet i bukspyttkjertelkreft, viser nyere data at så mange som 30% PDAC dødsfall er direkte knyttet til lokal progresjon [33]. Dessverre, er operasjon ikke er mulig for de fleste av disse pasientene og de eneste andre tilgjengelige lokal terapi, bestråling, er ineffektiv i de fleste tilfeller, selv når de kombineres med kjemoterapi [34]. Derfor øker sensitiviteten av disse svulstene for stråling kan ha en transformerende virkning i denne pasientpopulasjonen. Faktisk er utviklingen av inhibitorer til DNA-reparasjonsproteiner komme raskt og mange er på vei inn i klinikken som komponenter i kreftbehandling [35]. De mekanistiske innsikt identifisert i denne studien, gir en overbevisende molekylær begrunnelsen for å utforske utviklingen av slike midler for behandling av bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
de humane tumorcellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection eller den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer. HPDE-celler ble oppnådd fra M.S. Tsao. [17]. Celler ble dyrket i enten DMEM eller RPMI supplert med 10% kosmisk kalveserum, antibiotika og glutamin. HPDE-celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt (KSF) medium supplert med bovint hypofyseekstrakt og epidermal vekstfaktor (Gibco). NU7026 (Sigma) ble brukt på 20 mikrometer med mindre annet er angitt.
Real-time PCR
RNA ble isolert med TRIzol (Invitrogen), DNase-behandlet og revers transkribert til cDNA ved hjelp MMLV Høy ytelse revers transkriptase (Epicentri) etter produsentens anvisninger. PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn deteksjonsreagensen (Applied Biosystems) i en Bio-Rad Chromo4 Thermocycler. PCR-amplifikasjon ble utført ved 95 ° C i 2 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 30 sek. Endelig et smeltekurve ble generert fra 55 ° C til 95 ° C, leser hver 0,5 ° C. Primerne var som følger:. Ku70, frem 5’AGTCATATTACAAAACCGAGGGC -3 «og omvendt 5’CCTTGGAGGCATCAACCAAAAA -3» Ku80 frem 5’CCTTTCTGGTGGGGATCAGTA -3 «og omvendt 5’ACCTGGTTGGATTTTGCTTTCAA -3»
IC50 assay
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet ved seriefortynning av NU7026 den neste dag i 72 timer. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Cell-Titer-Glow analyse (Promega, G7570) i henhold til produsentens instruksjoner. IC50 ble beregnet ved hjelp av en sigmoidal modell ved hjelp BioDataFit 1.
shRNA transfeksjon
pLKO.1 plasmider som inneholder shRNA sekvens for Ku70 og Ku80 ble hentet fra The RNAi Consortium (sekvenser tilgjengelig på forespørsel). Lentivirus innehold Ku70, Ku80 og GFP kontroll shRNAs ble produsert i HEK293T emballasje celler og anvendt for å infisere celler i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma H9268). Ved puromycin utvalg i 2-3 dager, ble cellene tilbake til vanlig medium for eksperimenter.
Celleproliferering analysen
Celler infisert med lentivirus inneholder shGFP, shKu70 og shKu80 ble sådd i tre eksemplarer i 24- brønners plater på 2500-5000 celler per brønn. Celler ble fiksert i 10% formalin og farget med 0,1% krystallfiolett på dagen som angitt. Fargestoff ble ekstrahert med 10% eddiksyre og proliferasjon ble bestemt ved måling av OD ved 595 nm. Relativ proliferasjon ble beregnet ved normalisering til dag 0.
myk-agar assay
2 ml av medium inneholdende 1% agarose (Nobel agar, BD 214 230) ble plassert i 6-brønners plater som bunnlag . 2 ml av cellesuspensjon med 5000 celler i medium inneholdende 0,5% agarose ble plassert på toppen av størknet bunnsjikt. Etter 9-14 dager ble kolonier farget med p-iodonitrotetrazolium fiolett (Sigma, 18377), telles og fotografert. Hvis nødvendig, ble NU7026 tilsatt både bunn og topp-agar før den ble plassert i platene. 200 mL av medium som inneholder hemmere ble lagt på toppen hver 3 dager. For RNAi eksperimenter ble celler sådd ut to dager etter transfeksjon.
klonogene overlevelsesanalyse
Cellene ble sådd ut i triplikat i 6-brønners plater på 100 celler /brønn i vekstmedium, behandlet med den NU7026 neste dag, og utstråles ved 2, 4 og 6 Gy. Etter 10-14 dagers inkubering ble cellene fiksert i 80% metanol og farget med 0,2% krystallfiolett, og kolonier ble tellet. Den overlevende fraksjonen ble beregnet ved hjelp av plating effektivitet.
Nøytrale komet analyser
Nøytrale komet analysene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Trevigen). I korthet ble cellene sammen med lavtsmeltende agarose (katalog nr. 4250-050-02), og deretter montert på CometSlide (katalog nr. 4250-200-03). Etter cellelyse (katalog nr. 4250-050-01) og avvikling av DNA ble cellene underkastet elektroforese i 40 min ved 21 volt i TBE-buffer. Lysbilder ble fiksert med etanol, farget av SYBR og bilder tatt av AutoComet maskin (TriTek Corp). Minimal ett-hundre tilfeldig utvalgte celler fra hver prøve ble analysert ved hjelp CometScore programvare (https://autocomet.com). DNA-skade ble bestemt ved hale øyeblikk (hale lengde multiplisert med andelen av DNA i halen).
Western blot analyse
Celler ble vasket med PBS, telte og lysert i 2x SDS lasting buffer . Western blot-analyse ble utført ifølge standardprotokoller. Følgende antistoffer ble benyttet for Western: Actin (Sigma, A2066), γH2AX (Millipore, 05-636), Ku-70 geit (Santa Cruz, sc-1487), Phospho-Chk1 (S345) (cellesignalisering, # 2348) og kløyvet caspase-3 (Asp175) (cellesignalisering, # 9664).
Immunofluorescent flekker
Celler dyrket på Dekk eller åtte-brønns mikros lysbilder ble løst i 20 min med 4% paraformaldehyde og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 3 min. Cellene ble så inkubert over natten ved 4 grader med mus-monoklonale antistoffer mot γH2AX (Millipore, 05-636), eller Rad51 (Santa Cruz, sc-8349, H-92), etterfulgt av geit-anti-mus-IgG-FITC (Santa Cruz, 1 :300) eller geite-anti-kanin-IgG-FITC (Santa Cruz, 1:300). Celle bildene ble tatt under en Zeiss mikroskop ved hjelp av et 63x objektiv og analysert for foci /kjernen.
In vitro pGL2 plasmid -basert NHEJ analysen
pGL2-kontroll plasmid (Promega) ble fullstendig linearisert ved restriksjonsendonukleasen Hindlll og det lineariserte DNA ble ekstrahert fra agarose-gel med gel Extraction kit (Invitrogen). Rundskriv plasmid og linearisert DNA ble så ko-transfektert med PRT-RL plasmidet inn i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668). De transfekterte celler ble lysert og undersøkt for luciferase-aktivitet med Dual Luciferase Assay (Promega). Firefly signalet ble normalisert til at av Renila som fungerte som en transfeksjon referanse. Samlet NHEJ kapasiteten ble beregnet ved ildflue luciferase-aktivitet fra celler transfektert med Hindlll-spaltet DNA i forhold til den av intakte plasmid.
Strømningscytometri-analyse
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater, behandles med NU7026 den følgende dagen i 48 timer, og utstråles ved 2 Gy og fast etter 24 timers med iskald 70% etanol i PBS over natten. Etter sentrifugering, ble pelletene resuspendert i PBS, farget med propidiumjodid løsning i 30 minutter og analysert ved strømningscytometri (FACS BD Calibur) i mørket.
