Abstract
Tre-dimensjonale (3D) tumorcellekulturer dyrket i laminin-rik-ekstracellulære matriks (lrECM) er ansett for å reflektere humane tumorer mer realistisk sammenlignet med celler dyrket som monolag på plast. Her har vi systematisk undersøkt virkningen av ECM på fenotype, genekspresjon, EGFR-signalreaksjonsveien, og på EGFR-inhibering i vanlig brukt kolorektal cancer (CRC) cellelinjer. LrECM on-top (3D) kultur ble utført med CRC-cellelinjene SW-480, HT-29, DLD-1, LoVo, CACO-2, COLO-205 og COLO-206F. Morfologi av lrECM dyrket CRC-cellelinjer ble bestemt ved fasekontrast og konfokal laser scanning fluorescens mikroskopi. Proliferasjon av celler ble undersøkt ved MTT-analysen, invasiv kapasitet av cellelinjer ble analysert ved hjelp av Matrigel-belagte Boyden kammere, og vandrende aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av gjerdet analysen. Differensial-genekspresjon ble analysert på transkripsjonsnivået ved Agilent array plattform. EGFR ble hemmet ved hjelp av spesifikke lite molekyl-inhibitor AG1478. En spesifikk sfæroid vekstmønster ble observert for alle undersøkte CRC-cellelinjer. DLD-en, HT-29 og SW-480 og CACO-2 viste en klar solid svulst celle formasjon, mens Løvø, Colo-205 og Colo-206F ble karakterisert ved å danne drue-lignende strukturer. Selv om forekomsten av en sfæroide morfologi ikke korrelert med en endret trekk- eller invasive, eller proliferativ kapasitet av CRC cellelinjer, ble genekspresjon tydelig forandret i celler dyrket på lrECM sammenlignet med 2D-kulturer. Interessant, i KRAS villtype-cellelinjer, inhibering av EGFR var mindre effektiv i lrECM (3D) kulturer sammenlignet med 2D-cellekulturer. Således sammenligner både 2D og 3D-cellekultur modeller, våre data støtter påvirkning av ECM på kreftvekst. Sammenlignet med konvensjonell 2D cellekultur, byr lrECM (3D) cellekulturmodell mulighet til å undersøke faste CRC-cellelinjer i henhold til flere fysiologiske betingelser, det vil si i forbindelse med molekylære terapeutiske mål og deres farmakologisk hemning
Citation.: Luca AC, Mersch S, Deenen R, Schmidt S, Messner jeg, Schäfer KL, et al. (2013) Effekt av 3D-mikromiljøet på Phenotype, Gene Expression, og EGFR Hemming av tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 8 (3): e59689. doi: 10,1371 /journal.pone.0059689
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 29. mars 2012; Godkjent: 17 februar 2013; Publisert: 26 mars 2013
Copyright: © 2013 Luca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Forschungskommission av det medisinske fakultet, Universitetet Düsseldorf (41/09 til AK og 24/10 til KLS), Rudolf Bartling-Stiftung (II /98 til NHS) og med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB . 728) og NRW graduate school «BioStruct» (begge til RPP) de organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. den forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Faste kreft cellelinjer kan gi en nesten ubegrenset tilførsel av celler med ganske lik genotyper og fenotyper [1] og er i hovedsak det eneste alternativet for mekanistiske undersøkelser av humane kreftceller under kontrollerte betingelser [2], [3]. Derfor har menneskelige kreftcellelinjer blitt mye brukt som
in vitro
modeller for kreft hos mennesker. Et eksempel på et vellykket og godt bemerket bruksområde har vært oppdagelsen, utvikling og testing av kreftlegemidler [3]. Ikke desto mindre, avhengig av den vitenskapelige spørsmål er det også åpenbare begrensninger i å studere endringene på kreftceller som er forbundet med kreft progresjon siden de fleste faste kreftcellelinjer er blitt etablert av avansert kreft med kommet genotyper [1]. Imidlertid er en av de viktigste problemer som begrenser verdien av kreftcellelinjer som en modell for human cancer er på grunn av den vanligste metoden for å kultur cellelinjer
in vitro
, dvs. som homotypisk monolag på plastunderlag (2D ). Mens primære kreft og metastaser er komplekse heterotypic tredimensjonale strukturer innebygd i forskjellige organspesifikk microenvironments, er det velkjent at celler som er dyrket som klassiske 2D kulturer mister mange av kjennetegnene til deres
in vivo
kolleger [ ,,,0],4]. I tillegg kan viktige cellulære funksjoner som proliferasjon og differensiering være kunstig endret [5].
Et felles trekk ved alle normale og maligne epitelceller er at de er fysiologisk i nær kontakt med den ekstracellulære matriks (ECM) . ECM, som består av fibrøse proteiner og glykosaminoglykaner, omgir epitel-celler i deres ekstracellulære rom og danner deres basalmembranen. ECM gir ikke bare fysisk styrke til organiserte epitelceller [6], [7], men også viktige nøkkel biokjemiske strukturer og signaler for polaritet og vekst [7], [8]. Et enkelt system for
in vitro
ECM modellering er en solubilisert basalmembran forberedelse hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom, en svulst rik på ekstracellulære matrix proteiner bestående laminin, kollagen IV, heparin sulfat proteoglykaner og entactin /nidogen [9] – [18]. På grunn av sin molekylære sammensetning, spesielt dens høye laminin-innhold, er det ansett å være en egnet erstatning for basalmembranen. Hvis epitelceller dyrkes innenfor dette laminin rike ekstracellulære matrise (lrECM), vokser de som tre-dimensjonale strukturer [15], [16], [19]. Banebrytende arbeid av Bissell gruppen og andre – i hovedsak gjort på primære celler bryst og brystkreft cellelinjer – demonstrerte dramatiske morfologiske og biokjemiske forskjeller, mellom normale og maligne celler dyrket 2D på plastunderlag og 3D i lrECM henholdsvis [6], [20 ], [21]. Fra et klinisk synspunkt er det viktig å merke seg at lrECM (3D) kultur – som modell nærmere
in vivo
situasjon – kan føre til ulike reaksjoner på molekylære behandlinger, som nylig vist for brystkreft celle linjer [22], [23], [24]. Overraskende, er lrECM (3D) kulturer fortsatt sjelden brukt i forsøk med kreftcellelinjer og kun få studier systematisk analysert virkningene av lrECM kulturer på faste cellelinjer som gir grunnleggende informasjon om disse modellene. Så langt slike systematiske analyser av lrECM kulturer fokusert hovedsakelig på fenotypiske karakteriseringen av brystkreftcellelinjer dyrket under lrECM 3D
vs.
2D forhold.
Her utvidet vi funksjonell forståelse av effektene av differensial lrECM (3D)
vs.
2D vekstvilkår til tykktarmskreftceller. Vi systematisk undersøkt virkningen av lrECM på cellefenotyp og genutrykksmønster i vanlig brukte tykktarmskreft (CRC) cellelinjer. Våre data indikerer at CRC-cellelinjer som oppviser forskjellige morfologiske sfæroide typer når de ble dyrket i lrECM. Selv spheroid morfologi av CRC linjer ikke korrelerer med en endret trekkfugl, krenkende eller proliferativ cellekapasiteten, cellelinjer dyrket under lrECM (3D) forhold utstilt
per se
en svekket spredning i forhold til å kontrollere 2D kulturer. Videre genekspresjon ble klart endret på CRC cellelinjer når dyrkes under lrECM /3D forhold. I tillegg ble effekten av farmakologisk EGFR inhibering svekket i CRC-celler dyrket på lrECM sammenlignet med 2D-kulturer. Dermed har 3D mikro en stor innvirkning på mobil fenotype og farmakologiske følsomheten CRC cellelinjer.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
Løvø ble hentet fra Europa Innsamling av cellekulturer (ECACC, Salisbury, UK), Colo-205 fra American Type Culture Collection (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland), CACO-2, Colo-206F, DLD-en, HT-29 og SW-480 fra (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) den tyske Ressurssenter for biologisk materiale. Alle cellelinjer ble holdt under standard vev-kulturbetingelser i RPMI 1640+ Glutamax ™ -I (Gibco /Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Gibco /Invitrogen,). ble dyrket cellene enten på vevskultur plast (2D) (Greiner bio-en, Frickenhausen, Tyskland) eller 3D innenfor vekstfaktor redusert laminin rike ekstracellulære matriks (lrECM 3D) on-top kulturer etter såing av cellene på toppen av en tynn gel av Engelbreth-Holm-Swarm svulst ekstrakt (BioCoat Matrigel basalmembran, vekstfaktor redusert, BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Celler ble sådd ut i den Matrigel on-top-analysen med en tetthet på 1,8 x 10
4 celler /brønn i 24-brønners plater. Spheres ble dyrket i 7 dager før utvinne fra Matrigel. For morfologi studier ble sfærer dyrket opp til 10 dager. Medium ble endret annenhver dag i 3D kulturer. 3D-sfærer ble gjenvunnet fra Matrigel basalmembranen ved å fjerne mediet fra den Matrigel cellekultur og inkubering i 400 ul /brønn dispase (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland), forvarmet ved 37 ° C, i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. Aktiveringen av dispase ble stoppet med 10 mM EDTA i 1 x PBS. Sfærer ble sentrifugert og vasket med 1 x PBS. 2D dyrkede celler ble også vasket med PBS og skrapt av kulturskålen. For protein isolasjon 3D-kuler ble gjenvunnet fra Matrigel ved inkubasjon med 5 mM EDTA i PBS i 30 min på is etterfulgt av tre vasketrinn med PBS.
KRAS og BRAF mutasjon analyse
Standard syklus-sekvensering ble utført for å (re-) evaluere
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjonsstatus av tykktarmskreft cellelinjer (tabell 1). Exonene 2, 3 og 4 i
KRAS
ble analysert ved anvendelse av følgende oligonukleotid-primere: 5′- AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 «og 5′- AAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′ for Exon 2, 5»-GGATTCCTACAGGAAGCAAGT-3 «og 5 «-GGCAAATACACAAAGAAAGC-3′ for Exon 3 og 5»- AGACACAAAACAGGCTCAGGA-3 «og 5′- AAGAAGCAATGCCCTCTCAA-3» for Exon 4. for
BRAF
forsterkning av Exon 15 ble utført ved hjelp av forover primer 5′- – TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 «og reversprimeren 5′-AGCCTCAATTCTTACCATCCA-3». Mens reverse primere ble anvendt for DNA-sekvensanalyse av
KRAS
Exon 2 og 4, forover primere ble anvendt for
KRAS
Exon 3 og BRAF Exon 15, henholdsvis [25].
STR analyse
for STR fingeravtrykk-analyse DNA ble isolert ved anvendelse av Qiagen blod og vev Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens anbefalinger. Genomisk DNA (1 ng) ble forsterket ved hjelp av genRES® MPX-2 og genRES® MPX-3 multiplex PCR-systemer (Serac GmbH, Bad Homburg, Tyskland) for å generere 9 og 12 forskjellige STR markør sekvenser. PCR produktene ble analysert på en ABI 310 kapillær sequencer og allelotyped av «genotyper V3.1» programvare (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [26].
Cell levedyktighet, spredning og apoptose Analyser
Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater. Mens cellene ble sådd direkte på vev plast plater for 2D-kulturer, ble 3D-kulturer fremstilt ved plating av cellene på et tynt lag av Matrigel. Etter en inkubasjonstid på 48 timer ved 37 ° C og 5% CO
2, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma-Aldrich, Hamburg, Tyskland) ble tilsatt til mediene i 4 timer før fiksering over natten med MTT stoppe oppløsning inneholdende 10% SDS, 5% 1-butanol og 0,01 M HCl. Reduksjon av MTT å formazanforbindelsen ble målt ved 540 nm ved hjelp av en Tecan soloppgang ekstern kortleser (Tecan Group Ltd, Maennedorf, Østerrike).
spredning av celler dyrket i 2D eller 3D kultur forholdene ble kvantifisert ved 5-brom 2-deoxyuracil (BrdU) inkorporering hjelp av 5-brom-20-deoksy-uridin Merking og Detection Kit i (Roche) etter produsentens instruksjoner. Etter en inkubasjonstid på 48 timer ved 37 ° C og 5% CO
2 media ble fjernet, og cellene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 37 ° C og 5% CO
2 med BrdU merking media. 3D-sfærer ble gjenvunnet fra Matrigel ved inkubering med 5 mM EDTA i PBS i 30 min. Celler ble vasket to ganger i 1 x PBS og sentrifugert i 5 minutter ved 400 rpm. Gjenvunne sfæroider ble belagt på objektglass og tørket over natten ved romtemperatur. Kjerner ble kontra med 40,6-diamidino-to-phenylindole (DAPI). Opp til 200 celler ble talt opp i fem forskjellige felt per forberedelse på en Axio Scope fluorescens mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland). Antallet av prolifererende celler ble beregnet som en prosentandel av det totale antallet DAPI-positive celler per felt (tre tilfeldig valgte felt per dekkglass). Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet som forholdet mellom antall DAPI-positive celler med fragmenterte kjerner, kjent som en morfologiske kjennetegn på apoptose, og alle DAPI-positive celler.
Gjerde Assay (Migration analyse)
For migrasjonsanalyser 7,5 × 10
3 celler ble sådd ut i en 16 mm gjerde (Aix Scientifics®, Aachen Tyskland). Celler ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% FBS inntil konfluens var nådd, og gjerdet ble fjernet. Celler ble dyrket i fire dager, deretter fiksert i 10% formaldehyd og farget med Mayers haemalaun fargeløsning. Diametre på farget cellemonolagene ble vurdert i mm ved hjelp av Versa Doc Imaging System (BioRad, Munchen, Tyskland). For å skille mellom celleproliferasjon og cellevandring, ble pre-eksperimenter utført i kulturmedium supplementert med 1% FBS og 10% FBS.
Invasion Assay
invasjon analysen ble utført ved anvendelse av BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences) følge instruksjonene fra produsenten. Membraner ble fiksert på objektglass og farget med krystallfiolett. Celler innenfor en definert sentralt område av membranen ble talt.
Drug Treatment og Proliferation Assay
EGF reseptoren ble hemmet av tyrosinkinasehemmer tyrphostin AG1478 (Sigma Aldrich). Celler ble sådd ut ved en tetthet på 6 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater og behandlet med AG1478 ved en sluttkonsentrasjon på 20 uM, 10 uM, 5 uM, 2,5 uM, 1 uM eller 0,1 iM for 48 timer og 96 timer i 2D og 3D cellekultursystemer. DMSO /metanol ved ekvimolare konsentrasjoner til AG1478 konsentrasjoner fungerte som kjøretøy kontroll. Førtiåtte timer etter medikamentbehandling celleformering ble målt ved å utføre MTT-analyser som beskrevet ovenfor.
Total RNA ekstraksjon og cDNA-syntese
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. RNA ble fortynnet i 50-80 pl nuklease fri og sterilt vann. RNA-konsentrasjonen ble målt spectrophometrically ved 260 nm og RNA kvalitet ble vurdert ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer. For cDNA-syntese, revers transkripsjon (RT) ble utført i et sluttvolum på 20 pl ved bruk av 1:10 fortynnet oligo (dT) primer (Invitrogen), 2 pg RNA, og 4 U transcriptor revers transkriptase i 5 x RT-buffer (Roche , Mannheim, Tyskland).
real Time PCR
Grunning og ifølge prober ble utformet ved hjelp av Universal ProbeLibrary analysen design Center (ProbeFinder versjon 2.45, Roche Applied Science). Primere ble alle syntetisert av MWG-Biotech, Ebersberg, Tyskland (tabell S1). cDNA ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 1 ng /ul. For PCR, ble 2 ul cDNA templat (eller vann som en negativ kontroll) blandes med 12,5 ul Fast Start Taq-Man Probe Master mix (Roche), 0,25 ul av hver forover og revers primer (20 uM hver) og 0,25 pl probe (Universal ProbeLibrary Set menneske, Roche). Alle prøver ble kjørt in triplo. For å normalisere ekspresjon av målgener, anvendte vi glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som indre referanse-genet. Kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) ble utført på DyadDisciple Chromo 4 (BioRad) ved anvendelse av følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser hver omfatter denaturering i 15 sekunder ved 95 ° C, glødning og forlengelse i ett min ved 60 ° C. Genekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden [27].
Immunoblotting
Celler ble homogenisert i protein lysis buffer PB1 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% Nonident P40 (Sigma) supplementert med en tablett av fosfatase inhibitor cocktail tabletter og PhosSTOP fosfatase inhibitor cocktail (begge Roche). Løselige proteiner ble separert ved sentrifugering i 10 minutter ved 4 ° C og 12000 opm. prøver inneholdende 40 ug avklart protein lysater per kjørefelt ble separert elektroforetisk på SDS-PAGE-geler og overført til nitrocellulose-membraner membraner ble probet med monoklonale kanin anti-EGF-reseptor-antistoff. (klon C74B9, Cell Signaling, Denver, MA, USA). over natten ved 4 ° C for påvisning av akt1 monoklonalt kanin anti-fosfor akt1 (Ser473) antistoff (Klon 193H12, Cell Signaling) og monoklonale kanin anti-akt1 antistoff (Klon C73H10, Cell Signaling). ble brukt MAPK P44 /42 ble oppdaget ved hjelp av monoklonalt kanin anti-fosfor P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) antistoff (Klon 20G11; Cell Signaling) og monoklonale kanin anti-P44 /42 MAPK-antistoff (Klon 137F5, Cell Signaling). Påvisning av MEK1 /2 ble utført ved bruk av polyklonalt kanin-anti-fosfo MEK1 /2 (Ser217 /221) antistoff (Cell Signaling) og monoklonale anti-kanin-MEK1 /2 antistoff (klon 47E6; Cell Signaling). For ikke-fosfor (aktiv) β-catenin (Ser33 /37 /Thr41) vi brukte monoklonalt kanin antistoff klone D13A1 (Cell Signaling) og for total β-catenin monoklonalt kanin antistoff klone D10A8 (Cell Signaling). Beta-aktin ble påvist ved anvendelse av monoklonalt mus anti-β-aktin-antistoff (klon AC-15; Sigma). Sekundær-anti-kanin-antistoff (Cell Signaling) eller anti-muse-antistoff (Sigma) koblet til pepperrot peroksidase ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur og detekteres ved hjelp av Immun-Star ™ Western C ™ Kit (BioRad) ved hjelp av Versa Doc Imaging System (BioRad).
Confocal immunfluorescens Mikros
Gjenn kuler ble belagt på objektglass, tørket over natten ved romtemperatur og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Glass ble rehydratisert i 1 x PBS og fiksert med iskald metanol /aceton (01:01) i 20 minutter ved -20 ° C etterfulgt av to vask trinn i 1 x PBS hver i 5 min. Blokkering ble utført i immunfluorescens-buffer inneholdende 4% bovint serumalbumin og 0,05% saponin i PBS i 20 minutter ved romtemperatur. Farging ble utført i PBS inneholdende 1% BSA og 0,05% saponin over natten ved 4 ° C. Mus monoklonalt anti-EpCAM-antistoff BerEp4 (Dako, Hamburg, Tyskland) ble benyttet ved en konsentrasjon på 2 ug /ml. MOPC (Sigma) tjente som isotype kontroll og ble inkubert ved en konsentrasjon på 2 ug /ml. Deretter ble prøvene vasket tre ganger med 1 x PBS. Sekundært antistoff, Alexa Fluor® 488 geit-anti-mus IgG (Invitrogen), ble inkubert i 1 time ved romtemperatur ved en konsentrasjon på 10 ug /ml, etterfulgt av to vask skritt hver i 5 min. Celler ble motfarget med 0,1 ug /ml DAPI (Sigma) i 1 x PBS i 4 minutter, vasket to ganger med PBS, og montert med VECTASHIELD® oppløsning (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Bilder ble innhentet ved hjelp av en LSM510-Meta konfokal mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland) er utstyrt med en 40 × /1,3 nedsenking objektive og eksitasjonsbølgelengdene av 364 nm og 488 nm. Confocal bilder som vises er enkle optiske lysbilder av 0,5 mikrometer tykkelse.
Klassifisering av Spheroids
I et tidligere arbeid ved Bissell gruppen [2] ble det vist at permanente brystkreft cellelinjer som ble dyrket i standardisert lrECM på-topp-analyse, utviklet av denne gruppen, dannet kuler, som viste karakteristiske vekstmønster som avslørt av fasekontrastmikroskop eller konfokal laser scanning mikroskopi. Den spheroid morfologi ble klassifisert i fire forskjellige merkes grupper som beskrevet av Kenny
et al product: [2]. «Round «,» masse «,» drue-aktig «og» stel». The «runde» type danner kolonier på toppen av gels preget av kjerner som er regelmessig organisert rundt sentrum av kolonien. The «masse» type cellelinjer danner kolonier som også kan ha rund koloni skisserer på fasekontrastmikroskop, men har fylt sentre og uorganiserte kjerner. The «drue-lignende» kuler vises løse celle-celle kontakter med et typisk druelignende morfologi. «Stel» kulene ble preget av en invasiv fenotype med stel projeksjoner invaderende gelen [2]. Vi brukte dette systemet for å klassifisere CRC cellelinje kuler
genuttrykk Analyser:. Agilent Array Analyser
Totalt RNA preparater ble analysert for RNA integritet ved Agilent 2100 Bioanalyzer. Alle prøvene i denne studien viste vanlig høy kvalitet RNA Integrity Numbers (Rins) av 10. RNA ble kvantifisert ved fotometrisk Nanodrop måling. Syntese av cDNA og påfølgende fluorescerende merking av cRNA ble utført i henhold til produsentens protokoll (One-Color Mikromatrise-basert Gene Expression Analysis, Low Input Hurtig Amp Merking, Vers 6.5;. Agilent Technologies). Kort sagt ble 100 ng av total RNA omdannet til cDNA, etterfulgt av
in vitro transkripsjon
og inkorporering av Cy3 merkede nukleotider til nylig syntetiserte cRNA. Etter fragmentering, var merket cRNA hybridisert til Agilent Menneskelig 8 × 60 K High Density oligonukleotid Mikromatriser. Dataanalyser ble utført med GeneSpring GX programvare (Vers 10,5. Agilent Technologies). Signalintensitet distribusjoner over prøvene ble normalisert ved quantile normalisering. Input data pre-prosessering ble avsluttet med baseline transformasjon til medianen av alle prøvene. Etter gruppering av prøver i henhold til kultur tilstand (lrECM 3D
vs.
2D kultur, 24
vs.
25 prøver, henholdsvis) en gitt transkripsjon måtte uttrykkes i minst 75% av prøvene i hvilket som helst av to eller begge grupper for å bli ytterligere analysert. Påvisbare genekspresjon over bakgrunnen ble dermed preget av «Present» flagg i henhold til GeneSpring standardinnstillingene for Agilent mikromatriser. Differensial genekspresjon ble statistisk bestemt av Mann-Whitney-U-test. Resulterer
P
-verdier ble korrigert for multippel testing i henhold til Benjamini-Hochberg. Transkripsjoner viser en korrigert
P
korr-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som blir uttrykt forskjellig. Hierarkiske klase analyser ble enten utført på prøver eller på utskrifter, henholdsvis ved hjelp av Manhattan avstand beregninger og komplett kobling.
statistikker
Alle forsøk ble gjort uavhengig i tre paralleller med mindre annet er angitt. Data representerer middel ± SD, med mindre annet er angitt. Sammenheng mellom spheroid morfologi og cellelinje kilde (primærtumor
vs.
Metastase) ble bestemt ved hjelp av Fishers eksakte test (prisme 5, Graph pad Software, Inc. La Jolla, CA, USA). Forskjeller i celle-levedyktighet målt ved hjelp av fargestoff absorbans ved 540 nm, celleproliferasjon, apoptose og i genekspresjon målt ved hjelp av RT-PCR ble analysert ved anvendelse av enten en paret t-test eller de parametriske tosidige Mann-Whitney-U-test. Et
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. IC
50 verdiene ble beregnet med Prism 5 (Graf pad Software, Inc.).
Resultater
CRC cellelinjer Exhibit to ulike morfologiske spheroid Typer når Cultured i lrECM
Først testet vi om CRC cellelinjer som vokser på lrECM vise en bestemt morfologi som kan klassifiseres i henhold til de fire kategoriene beskrevet av Kenny
et al product: [2]. Bruke på-topp-analysen alle undersøkte CRC-cellelinjer dannet kreft kuler i løpet av to dager. I løpet av tre dager sfæroidene utviklet en bestemt morfologi, som var repliserbar i minst ti uavhengige eksperimenter. Mens sfæroider ble langsomt voksende i størrelse, dette morfologi var stabil i opptil 10 dager med dyrking. Lengre observasjons eksperimenter ble ikke gjort. Blant disse cellelinjene, ble tre forskjellige vekstmønstre observert ved fasekontrastmikroskopi (figur 1A): «runde», «masse» og «druelignende». Spesielt ble CACO-2 kategorisert som «runde», HT-29, DLD-en, og SW-480 som «masse» og Løvø, Colo-206F og Colo-205 som «drue like».
A) Vekst morfologi CRC cellelinjer dyrket i henhold til 2D (øvre panel) og lrECM 3D analysebetingelser on-top (nedre panel). Celler dyrket i 3D tilstand enten viser en rund (CACO-2), masse (DLD-1, HT-29, SW-480) eller en druelignende morfologi (COLO 205, COLO-206F, LoVo) i kontrast fase. Skala barer: 100 mikrometer. B) Confocal laserskanning fluorescens mikroskopi bilder av CRC kuler. Spheroids ble dyrket i lrECM 3D microenvironments i syv dager. I etterfølgende isolering, ble den membran EpCAM protein (grønn) farges ved hjelp av Alexa Fluor® 488 geit-anti-mus IgG. Kjerner ble kontra med DAPI (blå). Skala barer 10 mikrometer.
For å øke romlig oppløsning og morfologiske utseende av de ulike 3D-kulene, vi utførte konfokal mikroskopi av celler ved lokalisering av epitelceller adhesjonsmolekyl EpCAM og nukleinsyre farging med DAPI (Figur 1B). Følgelig CACO-2 kuler vises tydelig uorganiserte kjerner og en samlet kompakt struktur med kolonisentre om vises tett fylt, blir derfor omklassifisert som «masse». I alle andre cellelinjer confocal bildebehandling validert sine første klassifiseringen av fasekontrastmikroskop. Interessant, observerte vi at cellelinjer med ganske forskjellige 2D morfologi (dvs. Colo-205 og Løvø) utstilt lignende morfologi i lrECM og
vice versa
.
spheroid morfologi ikke korrelerer med Migratory, Invasive eller Proliferativ kapasitet CRC cellelinjer
Etter at vi definert de to divergerende sfæroide morfologi av lrECM dyrkede CRC cellelinjer, dvs. «masse» eller «drue-aktig», vi var interessert hvis denne observasjonen var knyttet til ulike cellulære egenskaper i form av en endret ondartet potensial. I denne sammenheng er det verdt å merke seg at alle undersøkte CRC-cellelinjer med «druelignende» morfologi avledet fra metastatiske celler, mens alle CRC-cellelinjer med «masse» sfæroid morfologi ble etablert fra primær tumorvev (Fishers eksakte test, p = 0,028) (tabell 1).
Først cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Ingen signifikante forskjeller i cellelevedyktighet mellom celler av «masse» fenotype sammenlignet med celler i den «druelignende» fenotype ble klart. Interessant nok, når man sammenligner levedyktighet, proliferasjon og apoptose av celler som vokser todimensjonalt på vevskultur plast (2D) med lrECM 3D-on-top-analysen, har vi funnet en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet og proliferasjon i henhold lrECM 3D-forhold (figur 2A og B ). I kontrast, ble ingen forskjell opplagt når kvantifisere apoptotiske celler i 2D og lrECM 3D-kultur-systemer (figur 2 C).
Celler ble dyrkes under 2D eller 3D-forhold. A) Cellelevedyktigheten ble målt 48 timer senere ved anvendelse av MTT-analysen. Verdiene representerer den midlere absorbans ved 540 nm ± SD av triplikater. Hvite linjer representerer celler dyrket på plast (2D); Svarte striper celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Mann-Whitney-U test (** indikerer en
P
-verdi 0,001; ns = ikke signifikant). B) Celleproliferasjon ble kvantifisert ved beregning av prosentandelen av celler med BrdU-inkorporering og det totale antall DAPI-positive celler i hvert felt (i det minste tre tilfeldig valgte felter pr dekkglass). Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD fra tre replikater. Hvite linjer representerer celler dyrket på plast (2D); Svarte striper celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed
P
-verdier ble beregnet av paret t-test (* indikerer en
P
-verdi 0,05; ns = ikke signifikant). C) Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet som forholdet mellom DAPI-positive celler med fragmenterte kjerner og alle DAPI-positive celler. Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD fra tre replicates.White søylene representerer celler dyrket på plast (2D); Svarte striper celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed
P
-verdier ble beregnet av paret t-test (ns = ikke signifikant). D) Migrering av CRC cellelinjer ble kvantifisert ved hjelp av gjerdet analysen. Data representerer middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Hvite linjer representerer cellelinjer som er klassifisert som masse type; svarte striper drue-lignende klasse.
Ifølge morfologiske typer observert i lrECM 3D kulturer, utforsket vi den vandrende og invasiv kapasiteten på CRC cellelinjer. Ved hjelp av et gjerde analyse for å utforske migrasjon og en Boyden kammer analysen belagt med Matrigel å kvantifisere invasjonen, gjorde disse forsøkene ikke avsløre noen åpenbare forskjeller i forhold til den vandrende eller invasiv kapasitet når man sammenligner det «masse» og «drue-lignende» CRC cellelinjer (figur 2D og tabell 2). Dermed vil en korrelasjon mellom invasivitet og morfologiske typen ble ikke tydelig.
Gene Expression endres i lrECM 3D «On-top» Dyrket CRC Cells
observasjonen at CRC cellelinjer ikke bare danner typiske kuler i lrECM 3D, men også vise en redusert spredning i lrECM, antyder en generell forskjell i genuttrykk nivåer mellom 2D- og lrECM 3D kulturer. For å identifisere differensielt uttrykte gener når man sammenligner 2D og lrECM 3D dyrkede celler, undersøkte vi transkriptomet av celler vokse under 2D og lrECM 3D-forhold ved hjelp av Agilent Menneskelig 8 × 60 K High Density oligonukleotid Microarray plattform. Derfor ble fire uavhengige eksperimenter utført der SW-480, HT-29, DLD-en, Løvø, CACO-2, Colo-205 og Colo-206F-cellene ble dyrket i henhold til 2D eller lrECM 3D forhold, henholdsvis. I alt ble 49 prøver fra 7 ulike cellelinjer analysert, 25 hentet fra 2D og 24 fra lrECM 3D kulturer. Først spilte vi en hierarkisk klyngeanalyse av celler dyrket med 2D eller lrECM 3D-forhold. Som vist i figur 3A, hver cellelinje oppviste et karakteristisk transkriptomet profil, uavhengig av celledyrkningsmetode. Men bortsett fra HT-29 og Løvø, innenfor hver cellelinje klynge, 2D versus lrECM 3D kultur forholdene ble klart adskilt, noe som indikerer annerledes regulerte gener mellom 2D- og lrECM 3D kulturer. Påfølgende analyse viste at 225 gener ble uttrykt ved signifikant forskjellige nivåer når man sammenligner celler opprettholdt i 2D og lrECM 3D kulturer (Figur 3B). Pathway analyse ved hjelp GeneSpring GX 10,5 programvare identifiserte 14 differentially regulerte gener som er kjent for å samhandle med hverandre.
