Abstract
Selv om JOderingen av salt er den vanligste metoden som brukes for å skaffe jod-beriket mat, jod mangel lidelser er fortsatt et globalt helseproblem og dypt påvirker menneskers livskvalitet. Jod er nødvendig for syntesen av thyreoideahormoner, som er viktige regulatorer av menneskets metabolisme, cellevekst, spredning, apoptose og har blitt rapportert å være involvert i kreftutvikling. I denne studien, for første gang, evaluerte vi virkningen av jod-biofortified salat på transcriptomic profilen til Caco-2-kreftcellelinje ved å anvende Antall Human Genome Microarray-analyse. Vi viste 1326 forskjellig uttrykt Caco-2 transkripsjoner etter behandling med jod-biofortified (BFL) og ikke-forsterkede (NFL) salat ekstrakter. Vi analyserte trasé, molekylære funksjoner, biologiske prosesser og protein klasser basert på sammenligning mellom BFL og NFL spesifikke gener. Jod, noe som var forventet å virke som en fri ion (KI-NFL) eller i det minste delvis for å bli inkorporert i salatmakromolekyler (BFL), forskjellig regulerte veiene for en rekke transkripsjonsfaktorer som fører til forskjellige cellulære effekter. I denne studien viste at det inhibering av Caco-2-celler proliferasjon etter behandling med BFL, men ikke kaliumjodid (KI), og BFL-mediert induksjon av mitokondriell apoptose og /eller celledifferensiering. Våre resultater viste at jod-biofortified plantene kan effektivt brukes av celler som en alternativ kilde til denne sporstoffet. Dessuten kan de observerte forskjellene i aksjon både jod kilder antyder et potensial på BFL i kreftbehandling
Citation. Koronowicz AA, Kopec A, Master A, Smoleń S, Piątkowska E, Bieżanowska-Kopec R, et al. (2016) transkriptomet Profilering av Caco-2 Cancer Cell linje etter behandling med ekstrakter fra jod-Biofortified Salat (
Lactuca sativa
L.). PLoS ONE 11 (1): e0147336. doi: 10,1371 /journal.pone.0147336
Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
mottatt: 30 juli 2015; Godkjent: 31 desember 2015; Publisert: 22 januar 2016
Copyright: © 2016 Koronowicz et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Dataene er tilgjengelig fra Gene Expression Omnibus. GEO Nummeret er: GSE7160
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av 2012-2015 Polish National Science Center, gi no. Desember-2011/03 /D /NZ9 /05560, «Jeg og Se biofortification av utvalgte grønnsaker, inkludert påvirkning av disse micro på utbytte kvalitet samt evaluering av absorpsjon jod og utvalgte biokjemiske parametere hos rotter som ble matet med grønnsaker biofortified med jod. «
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
for lite inntak av kosttilskudd jod kan føre til jod mangel, noe som kan føre til mange helseskader. effekter [1, 2, 3, 4]. I dag er den mest effektive måten å kontrollere jod mangler er en utbredt JOderingen av bordsalt. Men i de fleste industrialiserte land dreven saltforbruket blir en risikofaktor for hjerte- og karsykdommer, osteoporose eller til og med magekreft [5, 6]. Videre skal det tas i betraktning at visse mengder av jod kan gå tapt under fremstilling og bearbeiding av mat, for eksempel på grunn av bruk av høye temperaturer [7]. Uorganisk jod er flyktig, og det er vanskelig å kontrollere dens tap under lagring og transport, samt koking, spesielt med bruk av høy temperatur oljer. I denne sammenheng biofortification av grønnsaker med jod i løpet av kultiveringen er en betydelig måte å øke forbruket jod, spesielt fordi jod til stede i mat kan lett assimilert [8] og nesten fullstendig absorbert [7]. Biofortification av planter er velkjent og realisert gjennom noen bioteknologiske eller agronomiske metoder [9, 8, 10, 11, 12]. Gulrøtter, tomater, poteter og salat forbrukes daglig i de fleste familier. Derfor, styrkende disse grønnsaker med jod er en fordelaktig måte for å forbedre den ernæringsmessige status jod forbrukere, uten risiko for dens overdrevent inntak. Salat er en grønn grønnsak, som vanligvis spises rå uten risiko for jod tap, derfor er det en god avling for jod-biofortification studie [13].
I våre tidligere studier viste vi høy effektivitet av jod biofortification av salat med jord gjødsling med kaliumjodid (KI). Videre har vi også observert øket konsentrasjon jod i urinen så vel som i utvalgte vev hos eksperimentelle rotter, som et resultat av å supplere dietten med slike jod-biofortified bladsalat [14].
Tilgjengelig litteratur viser at jodmangel øker risikoen for thyroid [15, 7], mage [16, 17], bryst [18, 19] og prostata [20] kreft. Antitumor effekt av jod kan resultere fra dets antioksidant, anti-proliferative, anti-inflamatory, såvel som pro-apoptotiske og pro-differensierende [21, 22, 23] effekter. I studien, fant vi ut at ekstrakter fra jod-biofortified salat (BFL) redusert spredning av tykktarmskreft cellelinje. Vi mistenker at det kan være relatert til endring i uttrykket av gener involvert i spredning og cellesyklus.
For bedre å forstå underliggende molekylære mekanismen av BFL handling vi søkte, for første gang, en hel genom microarray analyse av den transkripsjonelle profilen av humane Caco-2-celler. Vi sammenlignet annerledes regulert gener i celler behandlet med utdrag fra enten jod-biofortified eller ikke-forsterkede salat. Til slutt fant vi ut og analysert potensielt berørte mobilnettet trasé, biologiske prosesser, molekylære funksjoner og protein klasser.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av ekstrakter fra biofortified salat
Salat «Melodion « CV. ble dyrket og gjødslet med KI som beskrevet av Kopec et al. [14]. Den jod-konsentrasjonen var 0,50 mg /100 g tørr masse (D.M.) for biofortified salat og 0,12 mg /100 g D.M. for kontroll salat [14]. Frisk salat (10 g) ble knust ved bruk av en homogenisator (CAT Type X 120, USA) og deretter overført til den Erlenmaier kolbe med vann i temperaturen 90-100 ° C. Salat materialer ble ekstrahert ved risting (ElPan, vannbad rystetypen 357, Polen) ved 100 ° C temp. i 2 timer, og ved løsning ble sentrifugert (Centrifuge typen MPW-340, Polen). Da den del av ekstraktene ble anvendt for måling av jod og andre deler ble lagret ved -80 ° C i cellekulturstudier.
Bestemmelse av ekstraktet jodkonsentrasjon
Fordøyelse av 10 cm
3 prøver av salat ekstrakt i en blanding av 10 cm
3 65% HNO
3 (superrent, Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) og 0,8 cm
3 70% HClO
4 ( superrent, Poch, Gliwice, Polen) ble gjennomført i mikrobølgeovn system CEM MARS-5 Xpress. Innholdet av jod (I
-) ble analysert ved kald damp generasjon teknikk med bruk av høy-spredning ICP-OES (induktivt koblet plasma optisk emisjonsspektrometri) Prodigy spektrometer-Leeman Labs, New Hampshire, Massachusetts, USA [24 og 25]
Betingelser cellekultur
Menneskelig kolon cellelinje Caco-2 (kolorektal adenokarsinom, HTB-37). ble kjøpt fra American Type Culture samlinger (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i en inkubator, under kontrollerte forhold (temp, 37 ° C,. Luft, 95%; CO
2, 5%), i Eagles Minimum Essential Medium (Sigma, St. Louis, MO, USA), med føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) til en sluttkonsentrasjon på 20%, i henhold til ATCC fremgangsmåte.
Cell-behandlinger
celler ble sådd i 96-brønns kultur plater (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polen) for celle levedyktighet og spredning eller 6-brønners kulturplater (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polen) for RNA isolering i 24 timer, i henhold til protokoll av Roche (Basel , Sveits) og A A Bioteknologi (Gdynia, Polen), henholdsvis. Etter den tid, vokste medium erstattet av medium som inneholder a) trekke fra ikke-forsterkede salat (kontroll salat, NFL) med jod innhold 27,6 mikrogram /dm
3, b) trekke ut fra jod-biofortifed salat (BFL) med jod innholdet 186,7 ug /dm
3, c) kaliumjodid tilsettes til NFL (KI-NFL) i konsentrasjon på 186,7 ug /dm
3. En endelig konsentrasjon jod i kultur media var 107,33 nmol /dm
3 for NFL og 441,37 nmol /dm
3 for BFL. En endelig konsentrasjon jod i KI-NFL gruppe var den samme som i BFL gruppe. I alle studiene ble undersøkt minst 4 brønner per behandling. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger.
Celleviabilitet og spredning
Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Cytotoksisitet Detection Kit (LDH) (Roche, Basel, Sveits), i henhold til produsentens protokoll. Cytotoksisitet ble vurdert for utdrag fra BFL med sluttkonsentrasjoner på jod som beløper seg til 147,12; 294,25 og 441,37 nmol, ved tidsintervaller på 24, 48 og 72 timer, og beregnet i henhold til formelen:
Celleformering ble bestemt ved anvendelse av 5′-brom-2′-deoksy-uridin Merking og Detection Kit III ( Roche, Basel, Sveits), i henhold til produsentens instruksjoner. Proliferasjon ble standardisert til 100% av kontroll. Analysen av prøvene ble utført i triplikater og i tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en to-tailed t-test.
RNA isolering, validering, merking og hybridisering
Total RNA ble isolert fra cellene ved hjelp av RNA isolering kit fra cellekulturer ( A A bioteknologi, Gdynia, Polen). RNA mengden ble målt med Nanodrop (Nanodrop Technologies, USA). Analysen av endelig RNA kvalitet og integritet ble utført med en BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). For å sikre optimal datakvalitet, ble bare prøver med RNA integritet nummer (RIN) ≥8.0 inkludert i analysen. Analysen av gen-uttrykk profilen ble utført ved hjelp SurePrint G3 Menneskelig Gene Expression 8x60K v2 Mikromatrise (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Hver side inneholdt 8 mikromatriser som representerer ca 50 000 probe sett. The Low Input Hurtig Amp Merking Kit, to-farge (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ble brukt til å forsterke og etiketten target RNA å generere komplementær RNA (cRNA) for oligo mikromatriser brukes i genuttrykk profilering. Eksperimentet ble utført ved hjelp av en felles referanse design, hvor det felles referanse var en pool av like mengder RNA fra kontrollceller.
På hver av to-farge mikromatriser, hybridiserte vi 300 ng av cRNA fra bassenget (merket Cy3) og 300 ng av cRNA (merket Cy5). Totalt kjørte vi 12 mikromatriser-tre for hver forsøksgruppe. Microarray hybridisering ble utført med Gene Expression Hybridisering Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), i henhold til produsentens protokoller. RNA Spike I Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ble brukt som en intern kontroll. Innsamling og analyse av hybridisering intensiteter ble utført ved hjelp av Agilent DNA microarray scanner (G2565CA, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
Signal deteksjon og statistisk analyse
Data ble hentet og bakgrunn trekkes ved hjelp av standard prosedyrer som finnes i Agilent Feature Extraction (FE) Software versjon 10.7.3.1. FE utfører en Lowess normalisering. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Gene Spring 12.6.1 programvare (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Prøvene gjennomgikk kvalitetskontroll og resultatene viste at hver prøve hadde en lignende QC metrisk profil. Neste skritt var å filtrere probe sett med flagg for å fjerne dårlig kvalitet sonder (fraværende flagg). Statistisk signifikans av forskjellene ble evaluert ved hjelp av en enveis ANOVA og Tukey HSD post-hoc test (p 0,05). En multippel testing korreksjon ble utført ved hjelp Benjamini og Hochberg False Discovery Rate (FDR) 5%. Microarray data ble avsatt på Gene Expression Omnibus dataregister under nummeret GSE71605 og fulgte MIAME krav. Å identifisere signalveier og genet funksjoner microarray data ble analysert ved hjelp av Panther Classification System-en online database.
RT og Real-time PCR-analyse
Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en mikrogram total RNA isolert fra cellene med Maxima første Strand cDNA Synthesis kit for RT-qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Kvantitativ verifisering av gener ble utført ved hjelp av CFX96 Touch
™ Real-Time PCR Detection System instrument (Bio Rad, Hercules, CA, USA), utnytte SYBR Grønn Precision Melt Supermix kit (Bio-Rad). Betingelser for individuelle PCR reaksjoner ble optimalisert for gitt par av oligonukleotidprimere (S1 Table, saksdokumenter) på grunnlag av forhold som følger: 95 ° C, 10 min; 45 PCR-sykluser ved 95 ° C, 15 s; 59 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 sekunder, etterfulgt av smelting kurve analyse (65-97 ° C med 0,11 ° C rampehastigheten og 5 kjøp per 1 ° C). Resultatene ble normalisert ved hjelp av
GAPDH
,
ACTB Hotell og
hprt
referanse gener. Forskjeller i genuttrykk mellom BFL og NFL grupper ble vurdert av Student t-tester.
Resultater
Celleviabilitet og spredning
Vi fastslått at jod-biofortified salat ekstrakt undertrykt spredning av Caco-2 mer effektivt enn ekstraktet fra ikke-forsterkede bladsalat (figur 1). LDH cytotoksisitet test bekreftet at observerte effekten ikke var forårsaket av nekrose. Vi fant ingen signifikant cytotoksisitet av LDH BFL ekstrakt på Caco-2-cellelinjen ved enhver undersøkt jodkonsentrasjon (data ikke vist). Celleproliferasjon ble ikke påvirket av KI tillegg til NFL ekstrakt. I tillegg ble påvirkning av BFL og NFL på proliferasjonen av normale FHC cellelinje undersøkt, og ingen reduksjon i celleformering ble observert (data ikke vist).
Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM for de N ≥ 9 , standardisert til NC som 100%. Statistisk signifikans ble basert på t-test * p 0,05 versus (vs). NC og ^ p 0,05 vs. NFL.
Jod-biofortified salat spesifikke gener i Caco-2 cellelinje
Totalt 2603 transkripsjoner ble analysert. Vi viste at omtrent 50% av transkripter (1326 til 2603) ble uttrykt differensielt mellom celler behandlet med BFL og NFL (tabell 1). Listen over BFL spesifikke transkripsjoner er presentert i saksdokumenter (S2 tabell, Hjelpemiddel Information). Blant dem, ved hjelp av et Pathway Studio Program, bestemt vi (tabell 2) og visualisert interaksjoner av gener og proteiner som svar på jod (figur 1 og 2).
Gener spesifikt regulert av jod-biofortified salat ekstrakt i Caco-2 cellelinje
Samhandling av BFL spesifikke gener (S2 Tabell, Støtte Information) som svar på jod (fig 2) ble generert automatisk ved hjelp av en Pathway Studio Program. Som vist i figur 2, påvirker jod:
IGF1
,
TG
,
PPARG
,
GPX1
,
FOS
,
SLC6A4
,
NOS2
, og
THRB
gjennom opp- /nedregulering av deres uttrykk og /eller andre molekylære funksjoner. Jod indirekte handling reflekteres hovedsakelig gjennom tyreoglobulin (TG), som tyrosin rester Jod i syntesen vei av skjoldbruskkjertel hormon (TH). Således blir TG direkte involvert i metabolismen jod og har blitt rapportert å være assosiert med en rekke jod mangelsykdommer [26, 27]. Ifølge Pathway Studio Program, jod, som er kovalent bundet til TH og dens syntetisk analog (levotyroksin), kan påvirke uttrykket eller aktivitet av
NOS2
,
HMOX1
,
NPPB
,
TXN
,
ABCB1
,
G6PD
,
Mylk
samt
THRB
koding thyroid hormon reseptor beta (TRβ1). På genomisk nivå, TRβ1, som er en TH-liganded transkripsjonsfaktor, kan påvirke mRNA nivåer av flere gener inkludert positivt regulert type 1 iodothyronine deiodinase
DIØ1 Hotell og negativt regulert
E2F1
transkripsjonsfaktor som er involvert i cellesyklusprogresjon (figur 2). Denne reseptoren er også antatt å være en mediator av nongenomic virkningen av TH som er ansvarlig for aktivering av plasmamembranen integrin αvβ3 etterfulgt av aktivering av nedstrøms reaksjonsveier som fører til fosforylering av ERK1 /ERK2 og TRβ1 proteiner. Dessuten kan T3-formidlet dannelse av cytoplasmiske TRβ1 komplekser med P85-subenheten av PI3K aktivere nedstrøms mTOR-avhengige reaksjonsveier som kan forklare pleiotrope virkninger av TH [28]. Alle disse direkte og indirekte relasjoner mellom genene påvirket av de jodholdige molekyler kan tilsvare, i det minste delvis, med våre resultater viser forskjeller i virkning av jodid kaliumsalt (KI) og jod som kan bli innlemmet i makromolekyler av biofortified salat.
i tillegg er samspillet mellom BFL spesifikke gener i respons til jod i Caco-2 celler (tabell 2) presentert i figur 3.
real-time PCR
real-time PCR-analyse for kjernereseptorer av skjoldbruskkjertel hormon (TRS): thyroid hormon reseptor, alfa (
URINRØRETS
) koding TRα protein isoformer og skjoldbruskkjertel hormon reseptor, beta (
THRB
) som koder TRβ reseptorer, så vel som for DIØ1, som er positivt regulert av TR og negativt regulert E2F1. For å avgjøre om endringer i genuttrykk i BFL kan være et resultat av jodid ion (I
-) handling, KI i samme konsentrasjon som i BFL ble lagt inn i NFL. Som et resultat ble nivåene av TRβ1 mRNA redusert i begge ekstrakter og det var ingen signifikante endringer i TRα transkripsjoner. En betydelig økning av DIØ1 mRNA ble observert i cellelinjer behandlet med BFL og KI-NFL ekstrakter. Uttrykk for E2F1 mRNA ble redusert i BFL ekstrakt og økt i KI-NFL ekstrakt (tabell 3). Innhentet med Real-Time PCR viste samme trend, verifisere microarray resultater.
Gene ontologi molekylær fullstendig analyse
Deretter undersøkte vi Gene ontologi (GO) for alle BFL vs . NFL forskjellig regulert transkripsjoner (S2 tabell, Hjelpemiddel Information), bruker Panther Classification System. Resultatene fra analysen av signalveier er vist i Tabell 4. GÅ biologiske prosesser, molekylære funksjoner og protein klasser er presentert i saksdokumenter (S3-S5 Tables).
Diskusjoner
til vår beste kunnskap, er vår studie den første til å vurdere effekten av jod-biofortified salat, på transkriptomet profil Caco-2 cellelinje. Det er også første til å vise inhibering av tykktarmskreftceller proliferasjon i respons til jod-biofortified salat ekstrakt behandling (figur 1). Vi har mistanke om at reduksjonen i celleviabilitet kan være forårsaket av tilstedeværelsen av jod, som ble innlemmet i anlegget struktur. Tilsetningen av KI til NFL ekstrakt påvirke ikke reduksjonen av BrdU syntese. Dette kan tyde på at i BFL, er jod kovalent bundet til lipider eller proteiner av chloroplast membraner [29,30,31,32], selv om videre studier er nødvendig. Denne organisk form av jod kan forstyrre veier som fører til redusert celler levedyktighet. Det er indikert at jod behandlinger inhibere celleformering ved å generere jod-lipider, inkludert 6-jod-5-hydroksy-8,11,14-eicosatrien- syre (en jodert arakidonsyre) og iodohexadecanal [33, 34]. Disse forbindelser er blitt detektert etter jod (I
2) supplementering, og det er antatt at de kan være potente aktivatorer av peroksisom proliferator-aktivert reseptor gamma typen (PPARy) [35]. I vår undersøkelse observerte vi redusert av PPARy mRNA etter behandling med BFL, så vel som den samme tendensen av PPARy målgener (Fettsyre-bindende protein til 4,
FABP4;
Til- protein 1,
UCP- 1
, Glyserol kinase,
GK
) (S2 tabell, Støtte informasjon). Derfor kan observeres reduksjon av celleproliferasjon være forårsaket av induksjon av apoptose (PPARy-uavhengig) og /eller differensiering [36, 37, 38]. I tillegg, i henhold til andre forfattere, bioaktive forbindelser av salat har evnen til å inhibere den DNA-skade i N2A mus neuroblastom-celler [39]. I vår forskning, har vi ikke undersøke påvirkning av BFL på lige skader. Men tar hensyn til den observerte reduksjonen i Caco-2 celleproliferasjon etter BFL behandling vi kan anta sin positive effekt på mekanismene for gentoksisitet.
I denne studien, som de første, viste vi Caco-2 transkripsjoner spesifikt regulert av ekstrakter av jod-biofortified salat (S2 Tabell, saksdokumenter). Basert på disse transkriptene, peker vi noen karakteristiske reaksjonsveier, inkludert den apoptose signalering (tabell 3). Analysere uttrykk for apoptose markører, forskjellig regulert i respons til BFL kontra NFL ekstrakter, identifiserte vi mitokondrie apoptose som den mest sannsynlige signalveien. Det ble indikert ved økt uttrykk av pro-apoptotisk Casp2 og Ripk1 domene som inneholder Adaptor med døden Domain (CRADD) og redusert anti-apoptotisk X-Linked hemmer av apoptose (XIAP) og BCL2-Associated Athanogene 3 (BAG3). Caspase-2 i inngrep med en mitokondriene avhengig apoptotiske reaksjonsvei, ved å indusere mitokondrielle proteiner, dvs. Bcl-2 og Bcl-xL (som blokkerer caspase-2), og CRADD, som induserer celledød [40]. XIAP er en direkte inhibitor av kaspase-aktivitet [41], mens økt ekspresjon av BAG3 i krefttyper er knyttet til opprettholdelse av celleoverlevelse, behandling motstand, og økt metastase [42]. Våre resultater er konsistente med rapporter om andre forfattere, (dvs. på prostata og brystkreftceller), som viser induksjonen av mitokondriell apoptotisk reaksjonsvei ved en direkte antioksydasjonsmiddel /oksidant mitokondriell virkning av jodid (I
-) og jod (I
2) [35, 43] eller indirekte dannelse av jod-lipider [33, 34]. I MCF-7 brystkreftcellelinjen I
2 ble tatt opp av et lettet diffusjon system og er kovalent bundet til lipider som, i sin tur, inhibert proliferasjon. Den samme undersøkelsen indikerte at bare I
2 og 6-jod-5-hydroksy-8,11,14-eicosatrien- syre, men ingen KI, hadde den antiproliferative egenskaper [44]. Disse observasjonene stemmer overens med våre resultater viser hemming av Caco-2 spredning som ble notert etter behandling med BFL, men ingen KI-NFL (fig 1).
I denne studien har vi observert økte nivåer av NOTCH3 og redusert uttrykk for c-MYC mRNA i BFL ekstrakter (S2 tabell, Støtte informasjon). Pro-differensierende rolle HAKK-familien, herunder NOTCH3 er nylig blitt beskrevet i forhold til murine fibroblaster og humane nerveceller, henholdsvis [45, 46]. Riktignok regulering av c-myc ekspresjonen ser ut til å spille en viktig rolle i cellesyklusprogresjon og cellulær differensiering. Det har vist seg, at T3-indusert neuronal differensiering og vekststans av neuroblastom N2a-B-celler blir etterfulgt av en reduksjon av c-myc-genekspresjon [47]. I et slikt tilfelle, kan dette forklare den hemming av Caco-2-celler proliferasjon etter BFL ekstrakter ble observert i denne studien; Men det kreves ytterligere forskning.
I dette arbeidet vil vi presentere listen over BFL kontra NFL spesifikke gener som svar på jod (tabell 2 og figur 2) og mulige sammenhenger mellom genene /proteinene (fig 3) . Deres funksjoner, basert på Panther Classification System database, er knyttet til jod stoffskiftet og blodsirkulasjonen i organismer. En interessant økning av tyroglobulin (TG) mRNA observert i vårt studium, kan antagelig forbundet med aktiveringen av synteseveien som kan føre til dannelse av joderte-proteiner, i likhet med TG, produsert i humane og animalske celler av skjoldbruskkjertelen. Likevel, vi ikke observere en forbedret uttrykk for TPO peroxidase, som er ansvarlig for jod innlemmelse i tyrosin rester av proteinet. På den annen side har det blitt vist at jod kan være bundet til aminosyrer planteproteiner [29, 30, 31, 32], men det er mangel på informasjon om deres metabolisme, spaltning og biologisk funksjon som kunne etterligne det joderte tyrosinene løslatt fra TG proteiner som thyreoideahormoner (tHS). Tyroksin (T4) er en av de pro-hormoner som omdannes til aktivt hormon-trijodtyronin (T3) i perifere celler. I nærvær av T3, skjoldbruskkjertel hormon reseptorer (TRS) inkludert TRβ1 (
THRB
) og TRα (
URINRØRETS
) kan endre uttrykket av mange gener ved å binde seg til DNA-elementer betegnes Thyroid hormon Response Elements (TRE), og dermed fungere som transkripsjonsfaktorer [28]. Selv om vi observert redusert nivå av den TRβ1 mRNA som respons på jod-biofortified salat (tabell 3), viste våre studier forbedret ekspresjon av positivt regulert DIØ1 og redusert nivå av E2F1 transkript, som er negativt regulert av TRβ1 proteiner (Tabell 3). Videre har vi observert forandringer i ekspresjonen av andre TR-regulerte gener, f.eks forhøyet mRNA nivåer av β-amyloid forløper protein APPBP) og redusert uttrykk av MYC, CCND1, PPARG (S2 tabell, Støtte informasjon). DIØ1 protein fungerer som et enzym deiodinating tyroksin (T4) til aktiv thyroid hormon-T3 og dens over-ekspresjon kan være korrelert med høye nivåer av jod omsetning i cellene. E2F1 er kjent for å være en positiv regulator av celleproliferasjon [48, 49] og dens ekspresjon er vist å være understøttet av både MYC og CCND1 [50] Faktisk viste vår forskning at reduksjonen av E2F1 ekspresjon, så vel som MYC og CCND1, positivt korrelert med redusert spredning av Caco-2-celler (fig 1). Den tilsynelatende motsetning mellom nedre mRNA-nivåer av TRβ1 og nivåene av dets målgener kan forklares ved en økt aktivitet av den TRβ1 proteinet som et T3-avhengig transkripsjonsfaktor (tabell 3). Denne forklaringen kan bli støttet av tidligere rapportert manglende samsvar mellom TRβ1 protein /aktivitet og dets mRNA nivåer [51]. Således kan våre resultater tyder på at jod-biofortified salat, som var i stand til å ned-regulere TRβ1 transkripsjon, kan også levere et molekyl forsterke TRβ1 aktivitet; Men denne hypotesen må videre studier. Selv om supplerende tiltak av TRα reseptorer kan være en annen forklaring på observerte resultater, våre microarrays ikke viser noen signifikant endring i TRα mRNA nivåer. På den annen side, tillater en økning i DIØ1 uttrykk etter KI-NFL (tabell 3) ikke utelukker en direkte påvirkning av jodidion (I
-) i mekanismene som regulerer den observerte DIØ1 transaktivering
i konklusjonen, viser vår forskning at jod-biofortified salat regulerer transkripsjon av gener assosiert med cellesyklus og apoptotiske prosessen som førte til redusert Caco-2 celler spredning. Selv om uttrykket av noen gener ble funnet å bli endret av begge: BFL og NFL jod former, vi også identifisert flere gener forskjellig regulert, noe som tyder divergerende virkningsmekanismer av jod innlemmet i salat makromolekyler under biofortificaton prosess og jod tilsatt som KI salt til ikke- befestet salat. Dette kan også være et argument for tilstedeværelse i BFL de kovalent bundet jod skjemaer som har blitt rapportert av andre forskere til å utøve bestemt hormon-lignende handling. Her viser vi at jod-biofortified salat kan være en attraktiv måte å hindre jod mangel lidelser. Selv om de ovennevnte resultatene kreve en bekreftelse på proteinnivå, som presenteres microarrays er en verdifull og mangesidig kilde til informasjon, spesielt for fremtidige studier av potensialet i dette jod form i kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Nukleotidsekvenser av primere
URINRØRETS
, skjoldbruskkjertel hormon reseptor alfa.;
THRB
, skjoldbruskkjertel hormon reseptor, beta;
DIØ1
, deiodinase, iodotyronine, type I;
E2F1
, E2F transkripsjonsfaktor 1;
ACTB
, aktin, beta;
GAPDH
, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase;
HPRT1
, hypoxantin phosphoribosyltransferase 1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0147336.s001 plakater (docx)
S2 Table. Jod-biofortyficated salat spesifikke transkripsjoner
Statistisk signifikant behandling: p. 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s002 plakater (docx)
S3 Table. GÅ biologiske prosesser basert på BFL kontra NFL spesifikke gener annerledes regulert i Caco-2 cellelinje
Statistisk signifikant behandling: p. 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s003 plakater (docx)
S4 Table. GÅ molekylære funksjoner basert på BFL kontra NFL spesifikke gener annerledes regulert i Caco-2 cellelinje
Statistisk signifikant behandling: p. 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s004 plakater (docx)
S5 Table. Protein klasser basert på BFL kontra NFL spesifikke gener annerledes regulert i Caco-2 cellelinje
Statistisk signifikant behandling: p. 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s005 plakater (docx)
Takk
Dette arbeidet ble finansiert av 2012-2015 Polish National Science Center-stipend Nei. Desember-2011/03 /D /NZ9 /05560 «Jeg og Se biofortification av utvalgte grønnsaker, inkludert påvirkning av disse micro på utbytte kvalitet samt evaluering av absorpsjon jod og utvalgte biokjemiske parametere hos rotter som ble matet med grønnsaker biofortified med jod».
