Abstract
konstitutiv aktivering av Wnt veien fører til adenom formasjon, en obligatorisk skritt mot tarmkreft. I lys av den etablerte rolle Wnt i å regulere stemness, forsøkte vi isolering av kreft stamceller (cscs) fra
Apc
– og
Apc Twitter /
KRAS
-mutant tarmsvulster. Mens cscs er tilstede i
APC Twitter /
KRAS
svulster, de synes å være svært sjeldne ( 10
-6) i
Apc
-mutant adenomer . I motsetning til dette Lin
-CD24
hiCD29
+ subpopulasjon av adenokarsinomceller synes å være anriket på cscs med økte nivåer av aktiv β-catenin. Expression profilering analyse av CSC-beriket undergruppe bekreftet sin forbedret Wnt aktivitet og avdekket ytterligere differensial uttrykk for andre signalveier, vekstfaktor bindende proteiner, og ekstracellulære matrise komponenter. Som forventet, gener som er karakteristiske for Paneth cellen avstamning (f.eks defensins) er co-uttrykt sammen med stamcelle gener (f.eks
Lgr5
) innenfor CSC-beriket undergruppe. Dette er av interesse da det kan indikere en kreftstamcelle nisje rolle for tumor-avledet Paneth-lignende celler, i likhet med deres rolle i å støtte Lgr5
+ stamceller i den normale tarm krypten. Samlet våre resultater tyder på at onkogene
KRAS
aktivering i
Apc
-driven svulster resultater i utvidelsen av cscs rommet ved å øke ®-catenin intracellulær stabilisering
Citation.: Ghazvini M, Sonneveld P, Kremer A, Franken P, Sacchetti A, Atlasi Y, et al. (2013) Kreft Stemness i
Apc Anmeldelser – vs.
Apc Twitter /
KRAS
-Driven Intestinal tumorigenesis. PLoS ONE 8 (9): e73872. doi: 10,1371 /journal.pone.0073872
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 8 mars 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Ghazvini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Disse studiene ble støttet med tilskudd fra den nederlandske Cancer Society (EMCR 2001-2482), Nederland Organisation for Scientific Research (NWO /Vici 016.036.636), den BSIK (Kennisinfrastructuur) program av den nederlandske regjeringen bevilge 03038 (www.stemcells. nl) og Nederland Institute for Regenerative Medicine (NIRM; www.nirm.nl), og EU FP6 og FP7 konsortier Migrere kreftstamceller program (MCSCs, www.mcscs.eu) og TuMIC (integrert begrepet metastase (http : //itgmv1.fzk.de/www/tumic/tumic_main.htm)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP fortsatt representerer en ideell modell for å studere de molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn svulst utbruddet og progresjon mot kreft [1], den såkalte adenom-karsinom-sekvensen [2]. Totalt sett, tap-av-funksjon mutasjoner i
APC product: (adenomatøs polypose coli) tumor suppressor gen eller onkogene mutasjoner i β-catenin (
CTNNB1
) føre til konstitutiv aktivering av Wnt /β-catenin signal og representerer den mest vanlige hastighetsbegrensende (adenom -dannende) hendelser blant tykktarmskreftpasienter. Adenom vekst og fremgang er ofte ledsaget av endringer i
KRAS
eller
BRAF
, etterfulgt av tap av
TP53 Hotell og
SMAD4
tumor suppressors tenkt å ligger til grunn for ondartet transformasjon til lokalt invasiv adenokarsinom [1]. Men dette betyr vel etablert genetiske evolusjon modellen ikke tar hensyn til andre viktige kjennetegn ved menneske tykktarm kreft, nemlig deres cellulære heterogenitet (forskjellige celle linjene er ofte til stede i de primære masse) og den antatte rolle en undergruppe av tumorceller, den kreft stamceller (cscs), ved å drive tumorvekst og å bestemme lokal infiltrasjon inn i omgivende vev og fjern metastase [3]. Faktisk, selv om de ovennevnte genetiske modellen ville forutsi at hver svulst celle i et tykktarmskreft angivelig initiert av en
APC
eller β-catenin mutasjon bør alltid være øremerket av kjennemerket på konstituerende Wnt aktivering, nemlig atom β- catenin akkumulering, dette er bare observert i et mindretall av celler vanligvis plassert på invasiv forsiden av primær lesjon [4] fra der de løsner og invadere omkringliggende stroma [5], [6]. Denne «β-catenin paradoks» pent illustrerer hvordan intra-tumor heterogenitet og muligens svulst stemness følge på de aller første stadiene av adenom-karsinom-sekvensen og føre til ulike Wnt signalnivåer mellom ulike kreftceller linjene som deler samme (
APC
) mutasjoner [7]. Det indikerer også at tap av
APC
funksjonen (eller onkogene β-catenin aktivering) er antagelig nødvendig for inntreden av den innledende dysplastisk lesjon, men utilstrekkelig til fullt ut å aktivere Wnt signaltransduksjon og markeds malign transformasjon i fravær av ytterligere miljø- og (epi) genetiske faktorer.
Tidligere, ved å anvende
in vivo
mutagenese [8], [9] og gen-målretting i mus [10], [11], det var vist at tap av
APC
funksjons resultater i adenom-formasjonen i øvre mage-tarmkanalen. Men disse muse adenomer ikke klarer å utvikle seg til kreft og ikke spontant samle flere genetiske treff på endogene
Kras Hotell og
TP53
gener [12]. Spesielt, mens onkogene
KRAS
aktivisering på egen hånd er i stand til å sette i gang tarm tumorigenesis om ikke med veldig sen debut og bare ved somatiske treff på
TP53
genet [13], sammensatte
apc
1638N /+ /
KRAS
V12G mus er preget av en 10-dobling i tumor mangfold og ved akselerert tumorprogresjon sammenlignet med
apc
1638N /+ littermates, med det store flertallet av tumoren lesjon er representert ved adenokarsinomer [14]. Videre analyser viste at
Apc Hotell og
KRAS
mutasjoner er synergistisk i å fremme β-catenin kjernefysisk translokasjon, og dermed forsterke kanoniske Wnt signaloverføring [14]. Sistnevnte er sannsynligvis resultere fra muligheten av aktivert KRAS, gjennom nedstrøms og ennå ukjente kinaser, å indusere β-catenin tyrosinfosforylering dermed fører til en betydelig økning av sin cytoplasmatic basseng og påfølgende translokasjon til kjernen hvor det fungerer som en transkripsjonen aktivator av flere wnt nedstrøms målgener. Følgelig tarmsvulster fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G mus viser en betydelig økning i celler med atom opphopning av β-catenin sammenlignet med
apc
1638N /+ dyr [14].
I de senere årene har cscs blitt renset fra humane tykktarm kreft ved å bruke forskjellige celleoverflatemarkører som CD133 [15], [16] , EpCAM, CD44 og CD166 [17], og EphB2 [18]. Men selv om de ovennevnte celleoverflateantigener har vært medvirkende for identifisering av tumorcelle subpopulasjoner med beriket tumor initiere egenskaper når transplantert inn immun-inkompetente mottaker mus, vår forståelse av mekanismene bak tarmkreft stemness og av den rollen spilt av cscs i progresjon mot malignitet er fortsatt i stor grad ufullstendig. Tidligere Vermeulen et al. viste at høy Wnt aktivitet earmarks cscs innen opphengskuler som stammer fra colontumorer [19]. Fra dette perspektivet, en rekke tilleggsproblemer må tas opp: er kjernefysisk β-catenin opphopning en funksjonell markør for tarm cscs
in vivo
? Er tumorceller med stamceller-lignende egenskaper som allerede er til stede i begynnelsen, godartede lesjoner som adenomer? Her tok vi fordel av
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G musemodeller for tarm tumorigenesis til prospektivt identifisere subpopulasjoner av tumor stamceller-lignende celler og karakterisere dem med hensyn til deres multipotency, selvfornyelse, genom-wide uttrykk profil, og Wnt /β-catenin signalaktivitet.
Resultater
Tumor-initiere celler finnes i
Apc
1638N /+ /KRAS
V12G
men er svært sjeldne i
Apc
1638N /+
Tarm Svulster
Apc
1638N /+ mus modell utvikler et gjennomsnitt på 4-5 godartede øvre GI tumorer (adenomer) i C57Bl /6J genetisk bakgrunn [10], [11]. Disse lesjonene bare sjelden (og med sen debut) utvikle seg til adenokarsinomer som også vist ved mangelen på spontane somatiske mutasjoner oppstår på
Kras Hotell og
TP53
gener [12]. For å vurdere tilstedeværelse av tumor-initiering celler i
Apc
1638N /+ adenomer, dvs. celler i stand til å rekapitulere primær lesjon når transplantert inn en mottaker dyr, ble tarmsvulster hentet fra
Apc
1638N /+ dyr og skilt både mekanisk og enzymatisk til en enkelt cellesuspensjoner og utarmet fra endotelceller og hematopoetiske celler (Lin
+) ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Deretter forskjellige multiplisiteter av den resulterende Lin
– populasjon av bulk tumorceller ble transplantert subkutant inn i NOD-SCID-dyr. Som vist i tabell 1, ble ingen tumorvekst observert selv ved injeksjon av så mange som 0,5-1,0 * 10
6 Lin
-. Celler og 6 måneder etter transplantasjon
Neste, vi gjentok transplantasjon analysen med bulk Lin
– kreftceller fra
APC
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster. Som tidligere rapportert, flertallet av tarmsvulster som finnes i disse sammensatte dyr i samme innavlet C57B6 /J genetisk bakgrunn er lokalt invasive adenokarsinomer [14]. I skarp kontrast med Lin
– celler fra
Apc
1638N /+ adenomer, tumorvekst ble observert i 23 av 33 injeksjoner med 10
5
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G Lin
– celler og, men på lavere forekomst (3 av 48 transplantasjoner), selv med så lite som 1500 celler (tabell 1). Ved å begrense fortynning analyse (L-Calc ™) frekvensen av tumor initiere celler i Lin
– befolkningen fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster ble estimert som en i 72 838 (95% CI av 109467-48465). Som for
Apc
1638N /+ adenomer, tumor initiere celler er sannsynlig å være til stede, om i det hele tatt, i betydelig lavere frekvenser ( 10
-6). Derfor, tilstedeværelse av tumor-celler initiere, som definert av transplantasjons analyser, synes å være begrenset til de svulster fra
APC
1638N /+ /
KRAS
V12G mus sammenlignet med de fra
Apc
1638N /+ mus modell.
den Lin-CD24
hiCD29
+ undergruppe fra
Apc
1638N /+ /KRAS
V12G
Tarm Svulster Surround tumor-initiere og selvfornyende cscs
for å prospektivt berike og til slutt isolere tumor initiere celler fra mesteparten Lin
– befolkningen
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G svulster, vi først testet et panel av tidligere etablert (kreft) stamcellemarkører inkludert CD24, CD29 (β1 inte), CD44, CD97, og L1CAM av FACSorting og påfølgende transplantasjon i NOD-SCID mus. I motsetning til CD44, L1CAM, og CD97 (tabell S1), transplantasjon av Lin
-CD24
+ CD29
+ celler viste en svak, men signifikant berikelse i tumor initiere celler (estimert frekvens av 1 i 56463 med CI av 399211-7986) (tabell 2). Gitt at Lin
-CD24
+ CD29
+ befolkning utgjør en relativt stor andel av bulk celler (~80%, data ikke vist), vi deretter videre definert tre ekstra FACS porter basert på den relative uttrykk for CD24 celleoverflaten antigen (CD24
hei, CD24
med, og CD24
lav) (Figur 1a). Ut av 30 primær
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G svulster analysert ved FACS, gjennomsnittlig størrelse (uttrykt i prosent av bulk Lin
– brøkdel ) for hver CD24 /CD29 sortert undergruppe ble bestemt: CD24
-CD29
– 3,4% (SD 2.6); CD24
-CD29
+, 7,8% (SD 4.7); CD24
+ CD29
– 4,4% (SD 3.4); CD24
loCD29
+ (P1), 7,9% (SD 2,5); CD24
medCD29
+ (P2), 52,9% (SD 7.4); CD24
hiCD29
+ (P3), 10,0% (SD 4.7). Vær oppmerksom på at disse prosentsatsene ikke legge til 100% bare på grunn av bevisst ekskludering av celler lokalisert i separasjoner mellom sorterings porter (se Figur 1a).
a. Stor panel: prikkplott representant for fargemønster oppnås ved farging med anti-CD24 APC-konjugerte og anti-CD29 PE-konjugerte antistoffer. Lineage positive celler (Lin
+) ble ekskludert (silt ut) ved farging med biotinylerte antistoffer mot avstamning markører og streptavidin-PerCPCy5.5. P1 (Lin
-CD24
lowCD29
+), P2 (Lin
-CD24
medCD29
+) og P3 (Lin
-CD24
hiCD29
+) populasjoner er angitt i plottet. Små paneler: prikkplotter representant for celler farget med isotype kontrollen antistoffer (til venstre), kompensasjon kontroll farget bare med anti CD24-APC antistoffer (i midten), kompensasjon kontroll farget bare med anti CD29-PE antistoffer (til høyre). b. FACS analyse av CD24 /CD29 mønster av svulster som oppnås ved serie transplantasjon av P3 celler suspensjoner fra
APC
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster. Venstre: primær transplantasjon. Høyre: sekundær transplantasjon. c. Immunhistokjemi analyse av svulster som oppnås ved 3 runder med serie transplantasjon av P3 celler suspensjoner fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster.
frekvensen av tumor initiere celler i P1, P2 og P3 subpopulasjoner ble bestemt ved å transplantere 1500 celler av hver inn i NOD-SCID-mus. Spesielt, mens på dette mangfaldet CD24
medCD29
+ og CD24
loCD29
+ celler konsekvent unnlatt å danne svulster (kun en vekst av 56 transplantasjoner), Lin
-CD24
hiCD29
+ subpopulasjonen ble funnet å omfatte en betydelig anrikning av tumorigene celler (13/28; tabell 2). Derfor, selv om i dette tilfellet kunne vi ikke utføre begrensende fortynning analyse av L-Calc ™ (siden en fast mangfold av celler ble ansatt) Lin
-CD24
hiCD29
+ svulst undergruppe ser ut til å være preget av en betydelig relativ berikelse av ca. 20-25 ganger sammenlignet med total Lin
– bulk celler (en CSC ut av ~3000 tumorceller kontra en på 72 838)
Definisjonen av kreft stamceller kan ikke utelukkende basert på deres evne. å danne svulster når transplantert ved lav mangfold i immun-inkompetente mus. Like viktige kjennetegn ved cscs er deres unike evne til å fornye seg selv og skille til drivstoff og rekapitulere den heterogene sammensetningen av primærtumor de er utledet fra. For å avgjøre om de tumor initiere celler som omfattes av Lin
-CD24
hiCD29
+ befolkningen er også i stand til selvfornyelse og differensiering, utførte vi serie transplantasjoner eksperimenter. Først 1500 Lin
-CD24
hiCD29
+ celler ble isolert fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G primære tarmsvulster og transplantert i NOD-SCID mottaker mus. Som forventet fra våre tidligere resultater, denne første analysen ga opphav til subkutane svulster innen 8 til 10 uker. De resulterende tumorer ble deretter skåret ut fra mottaker NOD-SCID-dyr, og som anvendes for både FACS og histologisk analyse. Som for FACS, ble tumorer dissosiert til en enkelt cellesuspensjon og analysert, sorteres og transplantert i henhold til deres CD24 og CD29 ekspresjonsnivåene. Sekundære svulster stammer fra Lin
-CD24
hiCD29
+ celler fullt rekapitulert den CD24 /CD29 FACS uttrykk profil av de primære lesjoner (Figur 1b og Figur S2). Likeledes, ved transplantasjon av 1500-celler fra hver av de Lin
-CD24CD29 populasjoner oppnådd fra de sekundære tumorer, bare den Lin
-CD24
hiCD29
+ celler var i stand til å danne tertiære tumorer. Følgelig, FACS-profil av tertiære tumorer oppsummerer at av de primære lesjoner (figur 1b). Spesielt, immunhistokjemi (IHC) og enzymatisk farging viste en progressiv økning i det relative nærvær av intestinal differensiering slektsnavn, nemlig Goblet (perjodsyre Schiff; PAS), Paneth (lysozym), og entero-endokrine (synaptophysin) celler i det transplanterte tarmsvulster sammenlignet med den primære
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G lesjoner (Figur 1c). Men FACS analyse av serielt transplanterte svulster viste at den relative størrelsen på de enkelte CD24 /CD29 subpopulasjoner ikke vesentlig endret (figur S3).
Dermed Lin
-CD24
hiCD29
+ undergruppe av tumorceller fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G adenokarsinomer omfatte
bona fide
cscs med tumor-initiering, selv -renewing og differensierings kapasiteter.
Lin-CD24
hiCD29
+ Celler fra
APC
1638N /+ /KRAS
V12G
Tarm Svulster Vis Økte Intracellulær β -catenin opphopning
Vi har tidligere foreslått at mindretallet av tykktarmskreftceller med kjernefysisk β-catenin akkumulering og ikke-tilfeldig fordelt langs invasiv front, representerer cscs [7]. Spesielt, både
Apc
1638N /+ adenomer og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G karsinom har samme «β- catenin paradoks «observert i humane tykktarm kreft i at ved IHC analyse, bare et mindretall av kreftceller vises kjernefysisk β-catenin opphopning tross for at de fleste, om ikke alle, dele to treff på
Apc
locus [12], [14] (figur 2a). For å vurdere om cscs beriket i Lin
-CD24
hiCD29
+ svulst undergruppe er preget av en økt grad av intracellulær β-catenin, analyserte vi protein uttrykk i de forskjellige FACSorted tumorcelle subpopulasjoner av to uavhengige analyser, nemlig immunfarging og western blot-analyse. Immunofarging viste at de fleste av Lin
-CD24
hiCD29
+ tarmtumorceller er kjennetegnet ved intracellulær akkumulering av β-catenin sammenlignet med andre populasjoner sorterte og hoveddelen (Lin
-) tumorceller (figur 2b). Dette resultatet ble også bekreftet i en mer kvantitativ måte ved western-analyse utført med antistoffer som er spesifikke for den signale-kompetente fraksjon (dvs. defosforylert ved restene Ser37 og Thr41) av β-catenin protein (figur 2c og fig S4).
Immuno-histokjemi (a., b.) og western blot (c.) analyse av β-catenin i grunnskolen
APC
1638N /+ tarm adenomer (a.) og i FACSorted svulstpopulasjonene fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster (b. og c.). Barene i c. representerer kvantifisering av båndene som oppnås med et anti-aktiv β-catenin Ab (anti-ABC, klon 8E7, # 05-665, Millipore) ved å skanne og å analysere western blot med Odysseen skanneren og etter normalisering med β-aktin.
Samlet er disse dataene bekrefter at Lin
-CD24
hiCD29
+ undergruppe fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G svulster, her vist seg å bli beriket i cscs, omfatter et betydelig høyere nivå av intracellulær og signal-kompetent β-catenin i forhold til bulk Lin
– og andre tumorcelle subpopulasjoner. Den økte Wnt signalaktivitet i cscs ble senere bekreftet av uttrykket profilering og Taqman qPCR analyse av Wnt nedstrøms målgener (f.eks
Lgr5
,
Axin2
,
T
, og
Lef1
, jf. her nedenfor)
The Expression underskrift cscs fra
Apc
1638N /+ /KRA
SV12G
Tarm Svulster er forskjellig fra differensierte og bulk tumor celler og omfatter både Stem og Paneth Cell Markers
For å identifisere molekylære forskjeller mellom stilk-lignende og mer differensierte (bulk) tumorceller fra
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster, vi isolert total RNA fra 10
4 Lin
-CD24
hiCD29
+ (P3), Lin
-CD24
medCD29
+ /Lin
-CD24
loCD29
+ (P1 + P2, fusjonerte gate) og Lin
– ( bulk) tumorceller fra fem individuelle mus i hver genotype (
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G). Totalt RNA prøver ble deretter ansatt for å hybridisere oligonukleotid mikromatriser (Affymetrix Mouse Genome 430A 2,0 Array) i henhold til vanlige protokoller.
Først de ulike tumorcellepopulasjoner isolert fra mus med ulike genotyper (
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G) ble sammenlignet med ANOVA (3 måter) med en FDR (falsk funnrate) sett 0.05 for å velge for gener med ≥2-fold differensial uttrykk. Spesielt, P3 (cscs fra begge genotyper) vs. Lin
– (bulk, begge genotyper) og P3 vs. P1 + P2 sammenligninger resultert i betydelige forskjeller, og i definisjonen av to lister av differensielt uttrykte sondesett (n = 1062 [851 ikke-redundante, kommenterte gener] og 746 [602 ikke-redundante, kommenterte gener], henholdsvis; Tabeller S3 og S4). På denne måten har vi identifisert en liste over 587 forskjellig uttrykt probe sett fra skjæringspunktet mellom karmene vs. P3 og P1 + P2 vs. P3. De identifiserte probe sett tilsvare 482 gener (ikke-redundante) (tabell S5).
Uttrykket profiler innhentet fra CSC-beriket subpopulasjoner (Lin
-CD24
hiCD29
+) av begge genotyper (
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G) skiller seg fra mer differensiert (Lin
-CD24
medCD29
+ /CD24
loCD29
+) og av Lin
– bulk subpopulasjoner som godt synlig i den hierarkiske clustering (HCA) og hovedkomponent ( PCA) analyse (figur 3).
(a.) Hierarkisk clustering og (b.) Hovedkomponentene analyse (PCA) (begge implementert i Partek) av Lin
-CD24
hiCD29
+ (P3), Lin
-CD24
medCD29
+ /Lin
-CD24
loCD29
+ (P1 + P2, fusjonerte gate) og Lin
– ( bulk) tumorceller fra fem individuelle mus i hver genotype (
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G). For bedre visualisering individuelle farger ble brukt for hver gruppe og i b. Ellipsoidene ble trukket rundt de tre svulstpopulasjonene
Spesielt,
Apc.
– og
Apc Twitter /
KRAS
-mutant genotyper er ikke løses ved HCA og PCA, muligens på grunn av den relativt begrenset antall
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumorprøver (n = 5 for hver gruppe) som anvendes for sammenlignende uttrykk profilering analyse, tilstrekkelig til å fremheve de angivelig mer subtile forskjeller mellom godartede og ondartede cscs.
Deretter fra ovennevnte lister over forskjellig uttrykt sonder mellom P3 og andre svulstcellepopulasjoner vi validert uttrykk for totalt 35 gener ved kvantitativ real-time PCR (tabell S2). Utvelgelsen av validerte gener omfatter, bortsett fra den øverste opp- og ned-regulerte gener, også flere medlemmer av den kanoniske Wnt signaltransduksjonsbane, og gener som er kjent for å spille aktuelle roller i kreft. Totalt sett, de aller fleste av de utvalgte gener (33/35) ble validert for deres differensial uttrykk ved qPCR (figur S1).
Gene ontologi analyse [20] av krysset signatur avslørte en ganske bredt spekter av mobilnettet funksjoner, strukturer og prosesser blant oppregulert gener inkludert ekstracellulære matrise, celle adhesjon, organutvikling og morphogenesis (tabell S6). Spesielt analyse av genene forskjellig uttrykt i CD24
hiCD29
+ celler fra
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G svulster i sammenligning med bulk og mer differensierte kreftceller, avdekket flere biologiske prosesser sannsynlig til å spille funksjonelle roller i kreft stemness. Først, som også vist av den intracellulære akkumuleringen av aktive β-catenin, flere mål og medlemmer av Wnt signalkaskade er forskjellig uttrykt i P3 signaturen inkludert
Lgr5
,
MMP2 Hotell og
Mmp7
,
Dkk2
,
Pla2g2a
,
Prox1
,
Sox17
,
T plakater (brachyury),
Wif1
, og
Fzd5
. Tilstedeværelsen av
Lgr5
blant oppregulert gener som er av interesse da det viser at dette kjente markør av normale stamceller i syklus hos mus tarmen [21] kan også representere et nyttig CSC markør i mus tarmsvulster som nylig demonstrert av avstamning tracing [22]. Også transkripsjonsfaktor
Prox1
, en direkte og doseavhengig mål av Wnt /β-catenin signalveien, ble oppregulert i P3 befolkningen.
Prox1
ble tidligere vist seg å fremme dysplasi i kolon adenomer og kolorektal kreft progresjon [23]. Men vi kunne ikke finne noen signifikante forskjeller mellom
Prox1
uttrykk nivåer mellom
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumorceller både i de opprinnelige microarray data og ved qPCR validering (figur S1). Denne observasjonen reflekterer en mer generell mangel på signifikante forskjeller mellom P3 bestander av
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G svulster, som også vises av hierarkisk clustering og PCA analyse (figur 3a og b, henholdsvis). I vår tidligere studie [14], uttrykk profilering av bulk svulster fra
Apc
1638N /+ og
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G mus også ikke løste de to genotypene. Faktisk kunne bare det relative antallet kreftceller med kjernefysisk β-catenin vesentlig skille mellom
Apc
1638N /+ fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster [14].
Bortsett fra Wnt, flere signalveier er representert ved forskjellig regulerte gener som vist ved differensial uttrykk for
BMP7 Hotell og
Bmper plakater (BMP signalering),
Fgfbp1
,
Fgfrl1
, og
Etv5 plakater (fibroblast vekstfaktor-reseptorer, bindende proteiner og transkripsjonsfaktorer), og
IGF1
,
Igfbp1
,
Igfbp5
, og
Igfbp7
(insulin-lignende vekstfaktorer og bindende proteiner).
Totalt disse resultatene viser at cscs fra
Apc
– og
Apc Twitter /
KRAS
-mutant svulster har forskjellige uttrykk profiler fra andre tumorcellepopulasjoner og er preget av økt Wnt signalaktivitet i samråd med sine forbedrede nivåer av intracellulær β-catenin, sammen med andre signal pathays (BMP, IGF), og ved uttrykk for Paneth celle-spesifikke gener.
diskusjon
Mutasjoner i
APC
tumorsuppressorgenet representerer hoved initierende og hastighetsbegrensende hendelse i adenom-karsinom-sekvensen fører til tykktarmskreft hos mennesker [1]. Tap av
APC-funksjon
fører til konstitutiv aktivering av den kanoniske Wnt /β-catenin signalveien kjent for å spille viktige roller i regulering av selvfornyelse og differensiering i et bredt spekter av vev-spesifikk stamcelle nisjer inkludert tarm krypten og, følgelig, i utbruddet av mange krefttyper [24]. Konstitutiv Wnt signaleringsaktivering i tarmepitelet utløser adenom formasjon, og representerer en nødvendig, men ikke tilstrekkelig, trinn for malign transformasjon. Somatiske mutasjoner i
KRAS
,
BRAF
,
TP53
, og
SMAD4
vanligvis ligger til grunn for videre progresjon av godartet svulst i lokalt invasiv adenokarsinom og metastasering på fjernt organ nettsider [1]. Mutasjoner i endogene musen
Apc
genet også føre til intestinal polypp formasjon, men hovedsakelig ligger i den øvre mage-tarmkanalen. Spesielt, mus
Apc
-driven intestinal adenomer ikke spontant akkumuleres
Kras
eller
TP53
somatiske mutasjoner og følgelig svært sjelden utvikle seg til adenokarsinomer [12].
i vårt laboratorium har vi generert
Apc
1638N /+ mus modell koding for et hypomorphic
Apc
mutasjon som resulterer i få (5-6) øvre GI adenomer , lengre overlevelse, og en økt sjanse for spontan malign transformasjon men bare i dyr som er eldre enn ett år [10], [11], [12]. I kontrast, sammensatt heterozygot
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G mus er preget av økt tumor mangfold (~ 10 ganger) og akselerert ondartet progresjon med flertallet av lesjoner være lokalt invasive adenokarsinomer [14]. Spesielt, onkogen aktivering av
KRAS Twitter /
Kras
på egen hånd er tilstrekkelig til å sette i gang tarm tumorigenesis [25], om ikke med sen debut og ved somatisk inaktivering av
TP53
-genet [13]. Derfor de dramatiske fenotypiske forskjeller forårsaket av onkogen aktivering av
KRAS
genet i forbindelse
APC
1638N /+ /
KRAS
V12G mus resultater fra dens synergistisk virkning i å fremme kanonisk Wnt signalering, som vist ved økningen i TOP-Flash rapportøraktivitet, og av antall tumorceller øremerket ved kjerne β-catenin opphopning [14].
den observerte relative økningen i antall
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G kreftceller øremerkede av kjernefysisk β-catenin er av betydning i lys av den såkalte «β-catenin paradoks «[7]: til tross for det faktum at tap av
APC
funksjon er felles for alle kreftceller og er spådd å resultere i den intracellulære og kjernekraft akkumulering av β-catenin, dette er bare observert i et mindretall av kreftceller som gjennomgår en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) og ikke-tilfeldig fordelt på forsiden av invasiv tumormassen [4], [5] (se også fig. 2a). Denne observasjonen har ført til hypotesen i henhold til hvilken atom β-catenin øremerker stammen intestinalstrikturer tumorceller med høyere Wnt signaleringsaktivitet som kan løsne fra de primære masse og effektivt spre og hjemme i distal, vitale organer [6], [19], [26].
Her prøvde vi den potensielle rensing av kreft stamceller (cscs) fra
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tarmsvulster. Spesielt, tilstedeværelse av tumor-initiering celler, kunne ikke påvises i
Apc
1638N /+ svulster. Ifølge operasjons CSC definisjon, til nemlig sin kapasitet danne svulster ved begrensende fortynning transplantasjon i mottaker mus,
bona fide
cscs enten er fraværende eller svært sjeldne ( 10
-6) i tarm lesjoner karakteristisk for
Apc
1638N /+ mus. I kontrast til malign transformasjon og akselerert adenom-karsinom-sekvensen forårsaket av gut spesifikke uttrykk for onkogene
KRAS
resultat i etableringen av en undergruppe av tumor initiere celler (estimert som en i ca. 7 × 10
4 bulk tumorceller). b.
