Abstract
Kreft kakeksi er en paraneoplastic syndrom som fører til dyp vekttap og muskelmasse atrofi og er anslått til å være årsaken til opp til 30% av kreftdødsfall. Selv om den eksakte årsaken er ukjent, har pasienter med kreft kakeksi økt muskelprotein katabolisme. Hos friske muskler, aktiverer skade skjelettmuskel stamceller, kalt satellittceller, for å differensiere og fremme regenerering. Her gir vi bevis for at denne mekanismen er hemmet i kreft kakeksi skyldes vedvarende uttrykk for CCAAT /Enhancer Binding Protein beta (C /EBPβ) i muskel myoblasts. C /EBPβ er et bzip transkripsjonsfaktor som er uttrykt i muskel satellittceller og er normalt nedregulert ved differensiering. Men i myoblaster utsatt for en kakektiske miljø, forblir C /EBPβ uttrykk forhøyet, til tross for aktivering for å differensiere, noe som resulterer i inhibering av myogenin ekspresjon og myogenese.
In vivo
, kreftkakeksi resulterer i økt antall Pax7 + celler som også uttrykker C /EBPβ og hemming av normale reparasjonsmekanismer. Tap av C /EBPβ uttrykk i grunnskolen myoblasts redder differensiering i henhold cachectic forhold uten å gjenopprette myotube størrelse, noe som indikerer at C /EBPβ er en viktig hemmer av myogenesen i kreft kakeksi
Citation. Marchildon F, Lamarche É, Lala- Tabbert N, St-Louis C, Wiper-Bergeron N (2015) uttrykk for CCAAT /Enhancer Binding Protein Beta i Muscle satellitten celler Hemmer myogenesen i Cancer kakeksi. PLoS ONE 10 (12): e0145583. doi: 10,1371 /journal.pone.0145583
Redaktør: Atsushi Asakura, University of Minnesota Medical School, USA
mottatt: 14 september 2015; Godkjent: 04.12.2015; Publisert: 28.12.2015
Copyright: © 2015 Marchildon et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd til NWB fra den kanadiske Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) og Cancer Research Society (https://www.crs-src.ca/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser
Innledning
kakeksi fører til dyp vekttap og muskelmasse atrofi, og forekommer samtidig med ulike sykdommer, inkludert sepsis, AIDS, narkotikamisbruk, og kreft [1, 2]. Selv om det ofte kombinert med anoreksi, kan vekttap og muskel protein katabolisme sett i cachectic pasienter ikke reverseres av ernæringsmessige kosttilskudd og dermed ikke kan tilskrives dårlig næringsinntak alene [3]. Opptil 80% av alle kreftpasienter vil ha kakeksi i avanserte stadier av sykdommen [4-6], og dette korrelerer med skrøpelighet, økt sykelighet og dårlige resultater. Videre er ca 30% av kreftdødsfall tilskrives kakeksi snarere enn tumorbyrden, noe som gjør kreft kakeksi en viktig årsak til dødelighet i Nord-Amerika [1]. Som sådan, er etableringen av behandlings- og forebyggingsstrategier av største betydning som kakeksi er inverst korrelert med suksessen til anti-kreft behandlinger og med pasient overlevelse [3, 7-9]. Årsaken til kreft kakeksi er antatt å stamme fra en kombinasjon av fordøyelsesenzymer (dysfagi og smaksforstyrrelser), humoral (systemisk inflammasjon), endokrin og tumor-avledede faktorer [10-13]. Begge cachectic kreftpasienter og dyremodeller av kakeksi har forhøyede proinflammatorisk cytokin (for eksempel TNFa, IL-1, IL-6) ekspresjon i blodet, noe som tyder på at disse faktorer spiller en rolle i utviklingen av kakeksi [14-18].
I et friskt individ blir muskelmasse homeostase oppnås ved å balansere muskelprotein-katabolisme med proteinsyntese. Skjelettmuskulatur atrofi, som det fremgår av kreft kakeksi, er mediert i det minste delvis ved oppregulering av ATP-avhengige ubikvitin E3 ligaser (Murf, MAFbx /atrogin-1), som stimulerer nedbrytningen av muskel strukturelle proteiner av 26S proteasomet og direkte inhibere den translasjonelle maskineri [19, 20]. Pro-cachectic cytokiner stimulerer ekspresjonen av disse ligaser og derved fremme økt muskelprotein omsetning [18, 21-23].
Satellitt celler er den primære kilde til regenerativ kapasitet til skjelettmuskel og som finnes mellom sarcolemma og basalmembranen av differensierte muskelfibre [24]. Disse cellene kan aktiveres både sprer og differensiere i respons på ytre stimuli, viktigst muskelskade og trening [25]. Satellitt-celler er definert av deres uttrykk for CD34
+ og Pax7, blant annet [26, 27]. Som satellittceller skille, de gradvis mister uttrykk for Pax7 og uttrykker på en koordinert måte myogenisk bHLH faktorer myod, myogenin og MRF-4 som er ansvarlig for induksjon av myocyte-spesifikke gener [28]. I muskelsvinn forhold, er det en reduksjon av myod uttrykk slik at det i tillegg til hyperkatabolisme, har minsket regenerering blitt implisert i patogenesen av kakeksi, som forbinder inhibering av myod ekspresjon og differensiering kapasitet reduseres til utviklingen av kakeksi
in vivo product: [29-31].
CCAAT /Enhancer Binding Protein beta (C /EBPβ) er en bzip transkripsjonsfaktor involvert i mange regulatoriske og differensieringsprosesser som både en aktivator og en repressor. For eksempel, er det nødvendig for leveren regenerering, virker som en potent engasjement faktor for adipocyttdifferensiering, og regulerer den akutte fasen responsen av immunsystemet [32-36]. I tillegg har vi vist at C /EBPβ er også en viktig regulator av mesenchymale stamceller skjebne i vevskultur modeller hvor det fungerer som en aktivator av adipogenese og en repressor av osteoblastogenesis [37-39]. Hos friske muskler, er C /EBPβ uttrykk begrenset til Pax7
+ satellittceller og dens uttrykk reduseres ved aktivering [40-42]. Ektopisk C /EBPβ uttrykk hemmer myogenesen gjennom hemming av myod protein uttrykk, som fører til redusert myogenin og MyHC uttrykk og redusert fusogene aktivitet [41].
In vivo
, sepsis, kreft og glukokortikoider kan oppregulere ekspresjonen av C /EBPβ i muskler, samt utløse kakeksi [43, 44]. Faktisk kan kakeksi stimulere C /EBPβ ekspresjon i muskelfibre som fører til ekspresjon av atrogin-1 og fiber atrofi [45]. Negl Lewis lungekarsinom (LLC) svulst i C /EBPβ null dyr hindret stimulering av atrogin-en i muskelfibre og muskelatrofi [45], noe som tyder på at tap av C /EBPβ kan hemme muskelatrofi i kreft kakeksi. Imidlertid er det nullizygous C /EBPβ dyr immunkompromitterte, og således er lite sannsynlig å ha normale respons på tumor poding inkludert cytokinproduksjon er nødvendig for utviklingen av kakeksi [46, 47], som tyder på at betinget modeller ville gi større dybde forståelse. Videre kan nullizygous modellen ikke skille rollen til C /EBPβ på den muskelfibre i forhold til potensielle virkninger i satellitt cellepopulasjon kjøring regenerering.
Flere bevislinjer tyder på at inhibering av skjelettmuskulatur regenerering, enten via tap av myogeniske forløpere, hemningen av myod eller gjennom aktivin type-2 reseptor-aktivering, deltar i utviklingen av kreft kakeksi [31, 48-50]. Heri, viser vi, ved hjelp av modeller av kreft kakeksi, forhindrer at stimulering av C /EBPβ uttrykk i satellittceller og myoblasts av cachectic miljø myogenisk regenerativ respons.
Resultater
Kondisjonert medium fra menneske kreftformer induserer C /EBPβ ekspresjon i myoblaster
Gitt at C /EBPβ er en viktig regulator av immunsystemet og er nedstrøms for tallrike cytokin signalveier, predikerte vi at kondisjonert medium fra humane kreftformer ville stimulere C /EBPβ uttrykk i myoblasts. C2C12 myoblasts ble dyrket med kondisjonert medium (CM) fra forskjellige humane kreftcellelinjer for 2 dager og C /EBPβ uttrykk ble undersøkt ved western blotting. Inkubering av C2C12-celler med CM fra alle tumorene som ble testet stimulert C /EBPβ uttrykk i varierende grad, ved hjelp av PC-3, MCF7 og A549 linjer som produserer den mest robuste økningen i uttrykket (figur 1A). I motsetning til dette, eggstokkreft cellelinje SKOV3 og den humane tykktarmskreft linje HCT116 stimulert C /EBPβ uttrykk minst. Inkubasjon med PC-3 CM også stimulert
Cebpb
mRNA uttrykk med nesten to ganger (figur 1B). Interessant, PC-3-celler uttrykker TNFa, IL-1β og PIF mRNA, og C /EBPβ ekspresjon er vist å være positivt regulert av IL-6, et cytokin hvis ekspresjon blir oppregulert ved IL-1 og TNFa-signalisering [15, 51 -53]. Faktisk, mens PC-3 celler uttrykker
Il1b
, karakterutskriften var umulig å oppdage i SKOV3 celler, noe som tyder på en mekanisme for å forklare differensial stimulering av C /EBPβ uttrykk i myoblasts av disse to kreftcellelinjer (figur 1C).
(A) C2C12 myoblasts ble inkubert med kondisjonert medium fra angitte kreft hos mennesker eller ubetinget medium (UM) blandet 1: 1 med frisk myoblast medium i 48 timer. C /EBPβ ekspresjon ble undersøkt ved western blot. β-aktin er en lasting kontroll. (B)
Cebpb
mRNA uttrykk i myoblasts behandlet med PC-3 medium eller ubetinget medium i 48 timer. * P 0,05, n = 5. (C)
Il1b
ekspresjon i SKOV3 og PC-3-kreftceller. * P 0,05, n = 5.
Tumor kondisjonerte mediet hemmer myogenesen
For å undersøke hvilken rolle C /EBPβ i muskel stamceller i løpet av kreft kakeksi, brukte vi en validert vev kulturmodell [53] hvori Subkonfluente C2C12 myoblaster ble inkubert med kondisjonert medium (CM) fra den humane prostatacancer PC-3 og DU145, eller med ubetinget media (UM) i 2 dager før induksjon til å differensiere (figur 2A). I samsvar med tidligere rapporter, inkubasjon med CM fra både kreft avskaffet myogenesen, som dokumentert av en reduksjon i antall og størrelse av myosin tung kjede (MyHC) positive myotubes (fig 2B) [53]. Fusjons indeks (# kjerner i MyHC + celler /# myocytter) ble redusert ~ 60% av PC-3 medium og ~ 30% av DU145 medium sammenlignet med kontroller (figur 2C), Differensieringen indeks (#nuclei i MyHC + celler /total kjerner) ble redusert ca. 40% i celler forbehandlet med PC-3 medium, og ~ 30% for de som ble behandlet med DU145 medium, sammenlignet med kontroller (figur 2C), noe som tyder på at både antall og modenhet av myotubes ble påvirket ved en kort eksponering for tumor-kondisjonert medium. I prolifererende myoblaster, eksponering mot CM fra begge tumorer stimulert C /EBPβ uttrykk etter to dager, uten at det påvirker Pax7 ekspresjon (Fig 2D). Ekspresjon av myod ble redusert i celler behandlet med DU145 CM, men ikke i celler behandlet med PC-3 medium (figur 2D). Etter differensiering (dag 7), forbehandling med PC-3 kondisjonert medium hemmet myogenin og MyHC uttrykk, i samsvar med nedsatt differensiering, uten at det påvirker myod uttrykk (Fig 2E). Videre mRNA uttrykk for
Myod1
,
Myog Hotell og neonatale
Myh
isoformer (
Myh1
,
Myh2
,
Myh8 Hotell og
Myh13
) ble hemmet av eksponering for PC-3 medium i forhold til celler eksponert for ubetinget medium (fig 2F). DU145 medium tilsvarende redusert
Myog Hotell og neonatal
Myh
isoform uttrykk, uten at
Myod1
uttrykk.
(A) Skjematisk av behandlingsprosedyren for vev kultur modell av kakeksi. Kondisjonert media fra PC-3-celler ble blandet 1: 1 med friskt medium, og ble tilsatt til prolifererende C2C12 myoblaster i 48 timer hvoretter cellene ble indusert til å differensiere i frisk DMEM inneholdende 2% hesteserum i 5 dager. (B) Immunocytochemistry farging for myosin-tungkjede-ekspresjon i C2C12 kulturer behandlet med kondisjonert medium fra PC-3 eller DU145 prostatakreft eller ubetinget media (UM) som i (A). DAPI flekker kjerner blå. (C) C2C12-kulturer ble indusert til å differensiere som i (A) og smelteindeksen (# myonuclei /myotube) og differensiering Indeks (# myonuclei /# totalt antall kjerner) ble beregnet, og er vist i forhold til UM. Faktiske verdier er vist i barene. * P 0,05, n = 7. (D) Western blot-analyse av C /EBPβ, Pax7, og myod ekspresjon i prolifererende C2C12-celler på dag 2 etter inkubasjon med kondisjonert medium. Actin er en lasting kontroll. (E) Western blot-analyse av myogenisk markør ekspresjon i differensierte C2C12-celler på dag 7. Aktin er en kontroll lasting. (F) QRT-PCR analyse av
Myod1
,
Myog Hotell og neonatal myosin tung kjede (
Myh1
,
Myh2
,
Myh8
,
Myh13
) ekspresjon, vist i forhold til celler behandlet med ubetinget medium (UM) på dag 7. * p 0,05, n = 4.
Inhibering av myogenese etter tumor-kondisjonert medium varierer med evne til å indusere C /EBPβ i C2C12 og primær myoblasts
Siden kondisjonert medium forventes å inneholde en blanding av vekstfaktorer og cytokiner som kan påvirke inntreden i myogenesen, gjentok vi i kultur kakeksimodell bruker kondisjonert medium fra SKOV3 celler som bare svakt stimulerer C /EBPβ uttrykk. Mens forbehandling med SKOV3 medium tillatt for robust differensiering, forbehandling med PC-3 medium hemmet dannelsen av myotubes, redusere differensiering indeksen med ca 50% og fusjon indeksen med ~ 40% (fig 3A og 3B). Videre, i overensstemmelse med forskjellene i C /EBPβ induksjon av SKOV3 og PC-3 CM, ble myogenin uttrykk og MyHC ekspresjon ble redusert i celler eksponert for PC-3 medium, sammenlignet med SKOV3 kontroller (figur 3C).
(A) Immunocytochemistry farging av myosin tung kjede uttrykk i C2C12 myoblasts forbehandlet med kondisjonert medium fra SKOV3 eller PC-3 celler blandet 1: 1 med friske media, for 48 timer, og overtalt til å differensiere i ytterligere 5 dager. DAPI flekker kjerner blå. (B) C2C12-kulturer ble indusert til å differensiere som i (A) og differensiering og fusjonsindekser ble beregnet som i forhold til SKOV3-behandlede celler. Faktiske verdier er vist i de respektive stolpene. * P 0,05, n = 5. (C) C /EBPβ, og myogenisk markørprotein-ekspresjon i C2C12 myoblaster behandlet som i (A). Cyklofilin B (CyPB) vises som en lasting kontroll. (D) Immunocytochemistry farging av myosin tung kjede (MYH) uttrykk i primær myoblasts forbehandlet med kondisjonert medium fra SKOV3 eller PC-3 celler blandet 1: 1 med friske media, for 48 timer, og overtalt til å differensiere i ytterligere 48 timer i DMEM inneholdende 10% hesteserum. DAPI flekker kjerner blå. (E) primært myoblast kulturer ble indusert til å differensiere som i (D) og de differensiering og fusjonsindekser ble beregnet som i forhold til SKOV3-behandlede celler. Faktiske verdier er vist i de respektive stolpene. ** P 0,01, n = 4. (F) Prosent av Pax7 + celler i forhold til total kjerner som er igjen i C2C12-celler dyrket i kondisjonert medium og differensierte som i (D) som bestemt ved immunocytokjemi. * P 0,05, n = 4 (G) C /EBPβ, og myogenisk markørprotein-ekspresjon i primære myoblaster behandlet som i (D). Cyklofilin B (CyPB) vises som en lasting kontroll.
I forståelse med C2C12 modell, pre-behandling av primære myoblasts med kondisjonert medium fra PC-tre tumor føre til dannelse av færre og mindre myotubes etter 2 dager i medium differensiering sammenlignet med celler behandlet med kondisjonert medium fra SKOV3 tumor (figur 3D). Differensieringen indeksen ble redusert ~ 30% med PC-3 forbehandling når sammenlignet med celler behandlet med SKOV3, mens smelteindeksen var redusert ca. 50% i PC-3-behandlede myoblaster (figur 3E). Videre er antallet Pax7 + celler som var tilbake i kulturene etter differensiering, som bestemt ved anvendelse av immunocytokjemi, var signifikant økt i kulturer forbehandlet med PC-3 medium med ca. 25% sammenlignet med kontroller (SKOV3 figur 3F). Som forutsagt, ble C /EBPβ nivåene økt i PC-3 behandlede celler sammenlignet med kontroller, og ekspresjonen av myogenin og myosin tung kjede ble redusert. Interessant, i motsetning til våre observasjoner i C2C12-modellen, primære myoblaster behandlet med PC-3 CM viste også en reduksjon i myod proteinekspresjon, en finne i overensstemmelse med våre tidligere observasjoner i dette systemet (figur 3G) [41, 42].
C /EBPβ uttrykk økes i primær myoblasts isolert fra cachectic mus
For å finne ut om kreft miljø kan stimulere C /EBPβ uttrykk i myoblasts
in vivo
, isolert vi muskel satellittceller fra friske og cachectic LLC tumorbærende dyr og differensiert dem
ex vivo plakater (figur 4A). Mens SC’er renset fra sunne muskler differensierte effektivt, myoblasts isolert fra cachectic dyr produsert færre og mindre myotubes (fig 4B). Differensieringen Indeksen ble redusert med 38% i kulturer fra kakektiske dyr og fusjons indeksen ble redusert 46% sammenlignet med friske kontroller (figur 4C). Ettersom disse celler ble ekspandert i normalt medium i 5 dager før induksjon til å skille, ble C /EBPβ nivåer bare svakt økt etter differensiering, noe som resulterer i normalisert myod ekspresjon (Fig 4D) og en liten reduksjon i myogenin uttrykk. Primære myoblaster fjernet fra den kakektiske mus viste også en reduksjon i MyHC ekspresjon sammenlignet med sham kontroller, i samsvar med differensiering defekten observert (figur 4D). Derfor, i likhet med våre CM eksperimenter, satellitt celler som stammer fra LLC tumor-podet dyr har økt C /EBPβ uttrykk og en defekt i differensiering som vedvarer
ex vivo
.
(A) 5×10
5 Lewis lungekarsinom (LLC) celler eller PBS (Sham) ble injisert i flanken av C57BL /6 mus og tillatt å innpode i 3 uker for å indusere kakeksi. (B) Immunocytochemistry for myosin tung kjede uttrykk i grunnskolen myoblasts isolert fra humbug-injisert og Advisor-injisert mus og differensierte i 2 dager. (C) Differensiering (DI) og fusjons (FI) indekser fra kulturer isolert og differensiert som i (B). * P 0,05, n = 5. (D) Western-analyse av C /EBPβ og myogenisk markør ekspresjon i celler isolert fra friske eller kakeksi mus som i (A), og etter dyrkning utvidelse i 5 dager, differensiert i 2 dager. Cyklofilin B (CyPB) er en lasting kontroll.
Kreft kakeksi hemmer muskel regenerasjon in vivo
For å vurdere skjelettmuskulatur regenerativ kapasitet i cachectic dyr, vi skadet venstre TA muskelen med Cardiotoxin (CTX) en gang kakeksi ble etablert og vurderes reparasjon én uke senere (figur 5A). Syv dager etter skade, TA muskel fra friske dyr reparert effektivt med mange myofibers med sentral beliggenhet atomkjerner synlige, mens den skadde TA av cachectic dyrene hadde omfattende fibrose og inflammatorisk celleinfiltrasjon med lite bevis for regenerering (Fig 5B). Faktisk, mens reparasjon gjen fiber tverrsnittsarealet til uskadde nivåene hos friske kontrollmusene, i kakektiske mus, regenererende muskel fiber tverrsnittsareal ble ytterligere redusert med 28% etter skade, som måler bare 59% av CTX-skadet ikke-cachectic muskel (fig 5C). I samsvar med disse observasjonene, hadde TA vekten av skadde friske dyr ved obduksjon tilbake til den av kontrollene, mens vekten av de skadde TA i kakektiske dyr var bare 73% av de uskadde cachectic kontroll (figur 5D).
(A) Skjematisk representasjon av skademodellen. Kakeksi ble indusert ved engrafting LLC kreftceller subkutant og gi dem muligheten til å vokse i 3 uker. Når kakeksi ble etablert, ble dyrene skadet ved å injisere Cardiotoxin (CTX) inn i muskelen. Sham skade ble oppnådd ved anvendelse av PBS. Skade fikk lov til å reparere for en uke før analyse. (B) H E-farget TA tverrsnitt fra humbug og Advisor-injisert mus som i (B) 7 dager etter CTX skade. Den kontralaterale TA ble injisert med PBS alene. Scale bar = 20 pm. (C) Gjennomsnittlig fiber XSA PBS og CTX-skadet humbug og LLC mus som i (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 4. (D) TA masse i PBS og CTX-skadet sham og LLC mus som i (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 5. (E) Prosent av Pax7 + celler (i forhold til total DAPI + kjerner) i PBS og CTX-skadet TA av humbug og LLC dyr. ** P 0,01, *** p 0,001, n = 5. (F) Prosent av C /EBPβ + /Pax7 + celler (i forhold til uskadde falske dyr) i PBS og CTX-skadet TA av humbug og LLC dyr. * P 0,05, *** p 0,001, n = 3.
neste scoret antall Pax7 + celler i TA tverrsnitt (figur 5E). Mens om lag 1,6% av kjerner farget positivt for Pax7 i uskadd TA musklene narre dyr, dette tallet nådde 3,5% i uskadd LLC bærende dyr. Etter CTX skade, Pax7 + celler økte i begge forloren og LLC dyr, med en 2-ganger økning for falsk kontrolldyrene sammenlignet med den uskadde ben og en 4,5 gangers økning i forhold til uskadet ben i tumorbærende dyr til nesten 20% av kjerner. Videre, mens skaden ikke påvirke den prosentandel av Pax7 + /C /EBPβ + satellitten celler i friske dyr, i den tumor-bærende kullet er andelen av doble positive celler ble øket i både uskadd og skadet muskel (figur 5F), i samsvar med
ex vivo
analyse av satellittceller (fig 4D). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at kreft kakeksi øker størrelsen Pax7 + rommet og disse cellene har økt uttrykk av C /EBPβ men redusert regenerative evner.
Tap av C /EBPβ uttrykk beskytter myoblasts fra kakeksi i kultur
for å bekrefte en rolle for C /EBPβ i utviklingen av kreft kakeksi, vi isolert
Cebpb
fl /fl
Pax7
+ /+ (WT) og
Cebpb
fl /fl
Pax7
Creer /+ (CKO) satellittceller og pre-behandlet dem med CM fra PC-3 svulst eller SKOV3 tumor ( kontroll) før induksjon til å differensiere i lave serumforhold. Etter 2 dager i differensieringsmediet ble kulturene immunfarget for MyHC ekspresjon (Fig 6A). Mens forbehandling med PC-3 CM inhibert differensiering i WT myoblaster, tap av C /EBPβ uttrykk reddet differensiering under disse betingelser (figur 6A og 6B), noe som tyder på at tapet av C /EBPβ uttrykk beskytter myoblaster fra den kakektiske miljø. Til tross for restaurering av differensiering indeksen i CKO kulturer, gjorde tapet av C /EBPβ uttrykk ikke gjenopprette myotube størrelse (fusjon index) som ble redusert etter inkubasjon med PC-3 medium (Fig 6C). Selv om behandling av WT celler med PC-3 medium økte prosentandelen av Pax7 + celler i kulturene, i samsvar med en reduksjon i den differensiering-indeksen, kulturer som mangler C /EBPβ hadde signifikant færre reserveceller etter differensiering i både kontroll- og kakeksi betingelser (fig 6D ). Selv om ingen forskjeller i myogenisk markør ekspresjon ble observert ved sammenligning av WT og CKO celler i kontrollmediet SKOV3, western analyse viste at myod og myogenin ekspresjon ble redusert inWT celler etter forbehandling med PC-3 medium (figur 6E). Men i CKO celler, ble myod uttrykk økt etter inkubasjon med PC-3 medium i forhold til WT og myogenin uttrykk ble restaurert til kontrollnivåer (Fig 6E). Således kan tap av C /EBPβ i muskelceller satellittceller redde myogenese i nærvær av kondisjonert medium, uten å gjenopprette myotube størrelse.
(A) Indirekte immunfluorescens av myosin tung kjede (MyHC) ekspresjon i primære isolert fra myoblaster
Cebpb
fl /fl
Pax7
+ /+ (WT) og
Cebpb
fl /fl
Pax7
Creer /+ (CKO) mus og dyrket med SKOV3 eller PC-tre betinget media i 2 dager, og overtalt til å differensiere i ytterligere 2 dager. (B) Differensiering Indeks (# myonuclei /# kjerner) av primære myoblaster kulturer i (A). * P 0,05, *** p 0,001, n = 6. (C) Fusion Indeks (# myonuclei /myotube) for celler differensiert som i (A). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (D) Prosent av Pax7 + celler i forhold til totalt antall kjerner i kulturer fra (A) etter differensiering, betegnet som reserve celler. * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (E) Western blot-analyse av C /EBPβ og myogenisk markør ekspresjon i primære myoblaster behandlet som i (A). Cyklofilin B (CyPB) er en lasting kontroll.
Diskusjoner
C /EBPβ er en transkripsjonsfaktor innblandet i en rekke biologiske prosesser, inkludert cellulær differensiering, cellesyklusregulering, immunsystemet funksjon og celle overlevelse [33, 54-59]. Som sådan er C /EBPβ ekspresjon påvirkes av mange forskjellige veier, inkludert cytokin signalering, vekstfaktorer, proteasomet og cAMP signalering [42, 60, 61]. Heri viser vi at C /EBPβ ekspresjon kan stimuleres ved eksponering til kondisjonert medium fra humane krefttyper, med varierende effektivitet. Selv om denne kondisjonert medium inneholder sannsynlig cytokin meklere, den eksakte faktorer i de betingede media kjøre C /EBPβ uttrykk fortsatt ukjent og kan være forskjellig for hver kreft. Ikke desto mindre, stimulering av C /EBPβ ekspresjon i myoblaster korrelert med inhibering av myogenese som kan bli reversert med tap av C /EBPβ.
Forbehandling av prolifererende myoblaster med kondisjonert medium var tilstrekkelig til å hemme myogenese, selv om differensiering ble oppnådd i medium uten pro-cachectic signaler. Disse forsøk således skille de anti-myogeniske virkninger av kondisjonert medium fra de myotube atrofi effekter som også kan forekomme. Interessant nok var myogenisk defekt rekapitulert i grunnskolen myoblasts isolert fra cachectic mus, selv etter ekspansjon i vekstmedium som ikke inneholder musserum eller kondisjonert medium. Det kan tenkes at eksponering for et miljø med kakeksi driver vedvarende epigenetisk modifikasjon av loci som er involvert i myogenese at svekke riktig ekspresjon av proteiner som kreves for differensiering. Eksponering for TNFa, et cytokin som ofte er knyttet til kakeksi, har vist seg å indusere metylering av CpG øyer innenfor myod locus, og det histon metylarginin transferaser PRMT5 og WDR77 /MEP50 kan indusere transkripsjonen undertrykkelse av C /EBPβ målgener ved å fremkalle det symmetriske dimetylering av histon H4 arginin 3 [62, 63]. Gitt at primær myoblaster som mangler C /EBPβ uttrykk kan skille normalt etter eksponering for kakeksi-induserende miljø, blir C /EBPβ sannsynligvis kreves for mønstring av disse foreslåtte epigenetiske modifikasjoner. Mens differensiering etter behandling med PC-3 kondisjonert medium gjenopprettes med tap av C /EBPβ, den myotube størrelse, målt som fusjons indeks, ikke ble reddet. Disse resultatene tyder på at forbehandling med en cachectic medium før differensiering reduserer fusogene kapasiteten til celler etter differensiering, selv ved vanlig medium. Som sådan, i tillegg til direkte å drive atrofi av modne fibre og reduserer deres differensiering, kakeksi kan også svekke sammensmelting av hell differensierte celler. Mens tumorreseksjon kan kurere kakeksi, er det fortsatt ukjent om regenerativ respons komme seg helt, eller om en feil vedvarer når cachectic miljø løser, og bør videre utforsket.
Differensieringen defekt etter behandling med PC-3 medium kan være tilskrives en manglende evne til å indusere myogenin fullt ut, noe som kan reverseres ved tap av C /EBPβ. I primær myoblasts ble myod protein uttrykk også reduseres ved eksponering for cachectic miljøet, men ble ikke observert i C2C12 celler. Faktisk, er C /EBPβ uttrykk lavere i C2C12 i forhold til primær myoblaster, og dermed forskjeller i C /EBPβ nivåer etter eksponering til kondisjonert medium kan i seg selv forklare forskjellig sensitivitet av myod uttrykk i de to systemer [41]. C /EBPβ kan hemme myod evne til å transactivate den myogenin promoter og uttrykk for myogenin var konsekvent nedregulert i alle modeller testet, noe som tyder på at interferens med myod funksjon som en mulig mekanisme for tap av myogenin uttrykk i myoblasts forbehandlet med kondisjonert medium [ ,,,0],41].
myod protein uttrykk er negativt regulert av C /EBPβ, uten samtidig endringer i
Myod1
mRNA nivåer [41]. Videre myod protein kunne ikke bli reddet med inhibering av proteosomet [42]. Interessant, tap av C /EBPβ uttrykk ikke øke myod til uttrykk under kontrollbetingelser (SKOV3) sammenlignet med WT-celler selv i disse forsøkene, differensiering effektiviteten av kulturene er omtrent 80%, noe som gjør det mer vanskelig å se en økning i myogenisk markør uttrykk . Imidlertid, ved fravær av C /EBPβ etter behandling med PC-3 medium, kan vi observere en økning i myod ekspresjon enn den som ble observert i WT kulturer, noe som tyder på at tapet av C /EBPβ inhiberende mekanisme er ved trekk i dette systemet.
Mens tap av C /EBPβ uttrykk kan forbedre differensiering etter kondisjonerte media forbehandling, er det fortsatt uklart om hemming av myogenesen i kreft kakeksi bidrar til patogenesen av syndromet. Siden kakeksi induserer også muskelskader [50], stimulering av regenerativ respons ville bli spådd å være beskyttende, og faktisk har mange rapporter vist at styrking regenerering forbedrer muskelatrofi sett i kakeksi [49, 50, 64]. Dessverre, våre resultater viser at dette svaret er hemmet av C /EBPβ uttrykk, potensielt forverre muskel sløse. Likevel, mekanismer for å stimulere myogenesen forbedrer muskel histologi og levetid i dyremodeller tyder på at markedsføringen av regenerering er en viktig terapeutisk avenue for behandling av kakeksi.
Materialer og metoder
Cellelinjer
C2C12 myoblaster og Lewis lunge carcinoma (ATCC) ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (Gibco). PC-3 og DU145 prostata adenokarsinom-celler (ATCC) ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin (Sigma). SKOV3 eggstokk adenokarsinom og HCT116 kolorektal karsinom ble dyrket i McCoy media, MCF7 brystkjertel adenokarsinom ble dyrket i DMEM og A549 lunge carcinoma epitel ble dyrket i F-12K media, alt supplert med 10% føtalt bovint serum.
Skeletal muskelceller primære myoblaster celler ble isolert som beskrevet [65]. Lavere bakben musklene i hunn C57BL /6 mus ble dissekert og spaltet med kollagenase og dispase (Roche) ved 37 ° C i 1-2 timer inntil muskler ble dissosiert.
