Abstract
Bone kreft smerte er den mest alvorlige blant kreftsmerter og er ofte motstandsdyktige mot aktuelle analgetika. Dermed er utviklingen av nye analgetika effektive ved behandling av bein kreft smerte ønsket. Blodplateaktiverende faktor (PAF) reseptorantagonister ble nylig vist å ha effektive smertestillende effekt på nevropatiske smerter i flere dyremodeller. Denne studien undersøkte smertelindrende effekten av PAF-reseptorantagonister på bein kreft smerte ved hjelp av femur bein kreft (FBC) modell i mus. Dyrene ble injisert med osteolytiske NCTC2472 celler i tibia og deretter virkningene av PAF-reseptorantagonister for smertestillende oppførsel ble evaluert. Kjemisk strukturelt annen type antagonister, TCV-309, BN 50739 og WEB 2086 bedres den allodyni og forbedrede smerte atferd som vokter atferd og lem-bruk abnormiteter i FBC modell mus. Den smertestillende effekten av disse antagonister ble oppnådd med lave doser og ble langvarig. Blokade av spinal PAF reseptorer ved intratekal injeksjon av TCV-309 og WEB 2086 eller knockdown av uttrykket av spinal PAF reseptor protein ved intratekal overføring av PAF reseptor siRNA produsert også en smertelindrende effekt. Mengden av et induserbart enzym PAF syntese, lysofosfatidylcholin-acyltransferase 2 (LPCAT2) protein betydelig økt i ryggmargen etter transplantasjon av NCTC 2472 tumorceller i mus tibia. Kombinasjonen av morfin med PAF-reseptorantagonister utvikler markerte forbedring av den smertestillende effekt mot benkreft smerte uten å påvirke morfin-indusert forstoppelse. Gjentatt administrasjon av TCV-309 trykt utseendet av smerteatferd og forlenget overlevelse av FBC mus. De foreliggende resultatene tyder på at PAF-reseptorantagonister i kombinasjon med eller uten, kan opioider representere en ny strategi for behandling av vedvarende bein kreft smerte og forbedre livskvaliteten til pasientene
Citation. Morita K, Shiraishi S, Motoyama N, Kitayama T, Kanematsu T, Uezono Y, et al. (2014) Palliasjon av Bone Cancer Pain av antagonister av blodplateaktiverende faktor reseptorer. PLoS ONE 9 (3): e91746. doi: 10,1371 /journal.pone.0091746
Redaktør: Theodore John Price, University of Arizona, USA
mottatt: 16 oktober 2013; Godkjent: 14 februar 2014; Publisert: 17 mars 2014
Copyright: © 2014 Morita et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-in Aid for Scientific Research (B) 22390349, (C) 21592421 og (C) 24592798 fra den japanske Society for Promotion of Sciences og ved National Cancer Center Research and Development Fund (23-A-30 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
smerter i kreft er produsert av press på, eller kjemisk stimulering av spesialiserte smertesignalenerveender som kalles nociseptorer (nociceptive smerter), eller det kan være forårsaket av skade eller sykdom som påvirker nervefibre selv (nevropatiske smerter) som er lydhør overfor stimuli som normalt ikke-smertefull; allodyni. Bone kreft smerte er en av de mest vanlige og vanligvis alvorlige smertetilstander hos kreftpasienter [1].
Opioider er fortsatt bærebjelken i kreftsmertebehandling, men i tillegg til de akutte bivirkningene de langsiktige konsekvensene av toleranse, avhengighet, hyperalgesi og undertrykkelse av hypothalamus /hypofysen akse bør bli anerkjent. Fordi dagens tilgjengelige behandlinger er relativt ineffektive mot benkreft smerte, nesten halvparten av kreftpasienter har utilstrekkelig smertekontroll [2], [3]. Således har utviklingen av nye smertestillende effektiv ved behandling av benkreft smerte er nødvendig.
Vi har tidligere foreslått at blodplate-aktiverende faktor (PAF) kan være en mediator av nevropatisk smerte. PAF injeksjon i mus ryggmarg forårsaket varme-hyperalgesi og taktil allodyni, som var i det minste delvis formidlet ved spinal dysfunksjon av glycin-reseptor α3 (GlyRα3) og ble blokkert ved PAF-reseptorantagonister [4], [5]. Senere studier viste PAF reseptor blokade redusert smerte atferd fremkalt i nerveskade modeller. En PAF-reseptorantagonist, CV-3988, injisert nær dorsal rotganglion (DRG) i rotter eller mus som mangler PAF-reseptorer viste en reduksjon i berørings-allodyni følgende spinalnerveskader [6]. Intratekal injeksjon av PAF-reseptorantagonist, WEB 2086, et benzodiazepin-derivat i 9 dager etter operasjonen hos rotter undertrykket utvikling av mekanisk allodyni i rotter spart nerveskade modell [7]. PAF-reseptorantagonister, TCV-309 (PAF relatert), BN 50739 (naturprodukt beslektede forbindelse), og WEB 2086, produsert dype og langvarige anti-allodyni effekter i flere forskjellige nevropatiske smertemodeller i mus, inkludert en delvis isjiasnerven ligation skade modell, en delvis infraorbital nerve ligation modell, en kronisk innsnevring av infraorbital nerveskade modell (CCI modell) og en streptozotocin (STZ) indusert diabetes modell [8]. Resultatene tyder på at PAF bidrar til nevrale vev skade og smerte oppførsel etter nerveskade.
De dyremodeller ovenfor undersøkt smerter på grunn av beinkreft, der tumorceller injiseres lokalt i beinet. Den foreliggende studien brukte femur benkreft (FBC) modell hos mus [9]. Dyrene ble injisert med osteolytiske NCTC2472 celler, og deretter effekten av PAF-reseptorantagonister på smerte atferd ble evaluert.
Materialer og metoder
forsøksdyr
Forsøkene ble utført ved hjelp av mannlige C3H /høne mus (Clea Japan, Inc., Tokyo), veier 20-25 g. Alle eksperimentelle prosedyrer og dyrehåndtering ble utført i henhold til både hovedprinsippene for omsorg og bruk av forsøksdyr er godkjent av den japanske Farmakologisk Society og retningslinjene i Hiroshima University, Hiroshima, Japan og retningslinjene for National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan. Protokollen ble godkjent av komiteen på etikk av dyreforsøk i Hiroshima University (Permit Number: A-09-17 og A-11-16), og av National Cancer Center (Permit Number: T11-004-M02) . Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Dyrene ble brukt for bare én måling i hvert forsøk
The Mouse Femur Bone Cancer (FBC) Modell
For FBC modell, NCTC 2472 tumorceller (American Type Cuiture Collection, ATCC.; Manassas, VA, USA) ble injisert inn i marghulen til den distale femur av C3H /HEN-mus [9]. De NCTC 2472-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle produkter fra Gibco Laboratories); og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 deretter passert ukentlig i henhold til ATCC retningslinjer. For administrering, ble cellene løsnet ved skraping og deretter sentrifugert ved 900 rpm i 3 min. Pelleten ble suspendert i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og deretter anvendt for intratibial injeksjon.
For implantering, ble tumorceller injisert å følge den protokoll som er beskrevet tidligere av Honoré et al. [9] med små modifikasjoner. I korte trekk, ble C3H /HEN-mus bedøvet med en natriumpentobarbital (60 mg /kg) i.p. injisert. For intratibial inokulering av cellene, det høyre kneet for hver mus var bøyd og plassert mot experimenter og en minimal hud innsnitt ble gjort for å eksponere den tibial platå. En 25 gauge tann reamer ble brukt til å perforere tibial platå og, når fjernet, ble en 30 gauge nål koblet til en Hamilton-sprøyte fylt med cellesuspensjonen forsiktig innført i marghulen av tibia. Deretter, 10
5 NCTC 2472-celler suspendert i 5 pl HBSS ble langsomt injisert (levende celler). Kontrollgrupper ble injisert med 5 ul HBSS eller HBSS inneholder 10
5 NCTC 2472 celler drept ved raskt frysing og tining dem to ganger uten kryobeskyttelse og deretter vaske med frisk HBSS (døyve celler). Til slutt ble Caviton EX, en tannlege-grade hydraulisk midlertidig tetningsmasse (GC Dental Products, Co. Ltd., Tokyo, Japan) brukes til tibial platå radert området og det kirurgiske inngrepet ble gjennomført med søm av kneet huden. Kroppsvekt ble registrert for hver mus etter 3 dager gjennom hele studien. Dyrene ble avlivet etter vekttap større enn 20% av kroppsvekten, eller ved å demonstrere relaterte symptomer som alvorlige Ataxic bevegelser eller andre nevrologiske abnormiteter på grunn av etiske hensyn.
Drug Administration
Gabapentin (1 – (aminometyl) -cyclohexaneacetic syre) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Morfin ble oppnådd fra Takeda Pharmaceutical Co., (Osaka, Japan). WEB 2086 (3- [4- (2-klorfenyl) -9- metyl-6
H
tieno [3,2-
f
] [1], [2], [ ,,,0],4] triazolo [4,3
en
] [1], [4] diazepin-2-yl] -1- (4-morfolinyl) -1-propanon) ble oppnådd fra Tocris Bioscience ( Ellisville, MO). TCV-309 (3-brom-5 – [
N
fenyl-
N
– [2 – [[2- (1,2,3,4-tetrahydro-2-isokinolyl – karbonyloksy) etyl] karbamoyl] etyl] karbamoyl] -1-propylpyridinium nitrat), og BN 50739 (tetrahydro-4,7,8,10methyl- (klor-2phenyl) 6 [3,4-dimetoksy-fenyltio] methylthiocarbonyl-9 pyrido [4 «, 3»-4,5] tieno [3,2-
f
] triazol-1,2,4 [4,3
en
] diazepin-1, 4) ble donert fra Takeda Pharmaceutical Co., og Institute Henri Beaufour hhv.
TCV-309 og WEB 2086 ble hver oppløst i sterile kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) eller saltløsning. BN 50739 ble oppløst i et løsningsmiddel som inneholder 25% 2-hydroksypropyl-β-syklodekstrin (Sigma /RBI, Natick, MA) og destillert vann, pH justert til ~6 ved bruk av 1 N NaOH og fortynnes hensiktsmessig med ACSF eller saltvann. Andre reagenser ble oppløst i ACSF eller saltvann. Stoffet løsninger ble tilberedes på hver eksperimentell dag. ACSF sammensetning (i mm) var NaCl 142, KCl 5, CaCl
2 2 H
2o 2, MgCl
2 · 6H
2o 2, NaH
2PO
4 1.25, D -glukose 10, 10 HEPES, pH 7,4. TCV-309, BN70329, eller WEB 2086 ble gitt intravenøst 30 min-tre timer før smertevurdering.
knockdown av PAF Receptor i ryggmargen
knockdown av PAF reseptor ble utført i henhold til en forrige rapport [5]. sirnas ble innlemmet i hemaggluinerende virus av Japan (HVJ) -Envelope Vector henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, etter blanding 40 ul (1 assay enhet, AU) av HVJ-konvolutt vektor med 4 pl av den omsluttende faktor, ble blandingen sentrifugert (10 000 x
g
, 10 min, 4 ° C), og pelleten suspendert i 10 ul bufferoppløsning. Deretter ble 10 ul av en blanding av 3 sirnas oppløsning (# 1, # 2 og # 3, 1 ug /ul hver) ble tilsatt, og blandingen ble holdt på is i 5 min. Steril ACSF (10 ul) inneholdende syntetisk siRNA duplekser (0,45 pmol /dyr) ble injisert inn i det subarachnoide rom mellom L5 og L6 virveldyr i bevisste mus. Sekvensene til siRNA oligonukleotid (sense) var som følger: PAF-reseptor (# 1, 5′-CACCUCAGUGAGAAGUUUUACAGCA-AG-3 «, # 2, 5′-ACCCUUCCAAGAAACUAAAUGAGAU-AG-3′, # 3, 5»-CAACUUCCAUCAGGCUAUUAAUGAU- AG-3 «; targeting sekvenser rundt posisjon 1005-1029, 232-256, 893-917, henholdsvis i
pafr
, GenBank tiltredelse no D5087).. Dessuten ble ikke samsvarer siRNA med tre eller fire nukleotid uoverensstemmelser forberedt på å undersøke uspesifikke effekter av siRNA tomannsboliger (siRNA # 4, 5′-ACUCUGCCAAGAGACUACAUGAGAU-AG-3). Disse utvalgte sekvenser ble også sendt til en BLAST søk (Bioinformatikk Senter Institute for Chemical Research, Universitetet i Kyoto, Japan) mot mus genomsekvens for å sikre at bare ett gen i mus genomet ble målrettet. sirnas ble kjøpt fra iGENE Therapeutics Inc. (Tsukuba, Japan).
Behavioral Analysis i FBC Model
atferdsanalyse ble utført etter protokollen beskrevet tidligere [5], [10]. Den smerterelatert atferd i FBC modellen ble evaluert før og etter Drug Administration på 11 dager etter tumor implantasjon. De eksperimentelle og humbug operert dyr ble evaluert for pågående smerte basert på vokter atferd, for ambulerende smerte basert på lem-bruk abnormitet, og for allodyni-lignende oppførsel basert på von Frey filament test og pensel test. Vokter atferd, lem-bruk abnormitet og allodyni-lignende smerter ble vurdert i de samme dyrene. Musene ble anbragt i en klar plastobservasjonsboksen og tillatt å tilvenne i 15 min. Deretter ble spontan vokter adferd vurderes i løpet av en 2-minutters observasjonsperiode. Løfte tiden av bakpote på ipsilaterale side under bevegelse og ble målt som vokter atferd. Limb-bruk abnormitet ble scoret på en skala fra 0 til 4: 0, normal bruk av lemmer; 1, svak halting; 2, klar slapp; 3, delvis ikke-bruk av lem; og 4, komplett ikke-bruk av lem. Allodyni-lignende oppførsel ble undersøkt ved lett å stryke den skadede benet med en malerkost (allodynia stillingen) eller evaluert ved måling av potetilbaketrekning grensen i respons til probing med en rekke kalibrerte fine filamenter (allodynia terskel) som rapportert tidligere [5]. Den allodyni poengsum ble rangert som beskrevet av Minami et al. [11]: 0, ingen respons; 1, mild squeaking med forsøk på å bevege seg bort fra den streke sonde; 2, sprek knirk, biting stryke sonde og sterke forsøk på å rømme fra stryke sonde. Verdiene er gjennomsnittet av den totale poengsummen evaluert 3 ganger ved hvert tidspunkt (mulig maksimal score på hvert tidspunkt: 2 /mus). Vakttidene ble betydelig forlenget ved 5 og 6 dager etter tumor-implantering i forhold til de verdier ved pre-implantasjon. Tilsvarende dyr også begynt å vise unormal lem-bruk på 5 dager etter tumor implantering, og slik unormal oppførsel var mer fremtredende i de senere dager. Den allodyni terskel ble evaluert ved måling av potetilbaketrekning grensen i respons til probing med von Frey monofilamenter, og betydelige terskelfall ble observert etter 3
rd dag etter tumor-implantering i forhold til de verdier ved pre-implantering, og nedgangen nådd en topp etter 5 og 7 dager. Den allodyni poengsum ble evaluert ved å måle rangert respons til lett stryke med en pensel, og betydelige rille stiger ble observert etter 4-dagers post svulst implantasjon sammenlignet med verdier ved pre-implantasjon, og økningen nådde en topp etter 6 og 8 dager. Gjennom hele forsøket ble adferdstesting utført under blindbetingelser med en eneste experimenter. Injeksjoner ble utført blind av en annen person. Intratekal injeksjon ble utført som beskrevet tidligere [4].
Fastsettelse av Lyso-PAF-acetyltransferase (Lysø-PAF AT) /Lysophospha- tidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), en PAF Synthesis Enzyme
korsrygg i ryggmargen (L2-L6) ble oppnådd fra skinn-opererte (døyve celler implantert) eller tumor-bærende mus. Ryggmargen vev (4,8 til 5,0 mg) ble homogenisert i 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) inneholdende 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, 10 mM p-glycerofosfat og 1 ug /ml av forskjellige proteaseinhibitorer ( benzamdine, leupeptin og antipain). Homogenatet ble omsatt med 0,6% NP-40 i 5 minutter ved 4 ° C, etterfulgt av sentrifugering ved 15.000 rpm i 5 min ved 4 ° C og supernatanten ble oppnådd. Supernatanten ble blandet i et volum forhold på 4:01 i 10 mM Tris-HCl (pH 6,8) inneholdende 10% (v /v) glycerol, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,01% bromfenolblått og 0,5% β-merkaptoetanol med etterfølgende koking ved 70 ° C i 30 min.
immunblotting-analyser
De oppnådde prøver ble underkastet elektroforese i 2 timer ved værelsestemperatur på polyakrylamidgeler (stacking gel 3% og skille gel 10% ) og deretter blottet på polyvinylidenfluorid membraner som tidligere er behandlet med 100% metanol. De overførte proteiner på membranene ble blokkert ved inkubering med blokkeringsløsning, en 5% skummet melk inneholdende vaskebuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl og 0,1% Tween 20), ved 25 ° C i 1 hr. Membranene ble utsatt for det primære antistoff som følger: mot LPCAT2 (1:1,000; Sigm); mot β-actin (1:1,000; IMGENEX Innovasjoner i Funksjonell genom, SanDiego, CA) fortynnet med vaskebuffer som inneholder 1% skummet melk over natten ved 4 ° C, etterfulgt av vasking tre ganger med vaskebuffer, og deretter inkubasjon med en sekundært antistoff som følger: for LPCAT2 antistoff og β-aktin-antistoff, et anti-kanin-IgG-antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (1:2,000; DakoCytomation, Glostrup, Danmark) ved romtemperatur i 1 time. Membranene ble igjen skylles tre ganger med vaskebuffer og utviklet med en forbedret chemiluminescence (ECL) western deteksjonssystem (ECL reagenser, kjøpt fra Thermo Fisher Scientific, og Nacalai Tesque Inc., Kyoto Japan; Imagequant ™ LAS 4000 mini detection system, GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan). Tettheten av hvert bånd ble analysert ved anvendelse av NIH Image software, og de densitometriske enheter ble korrigert ved å bruke verdien av β-aktin. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
morfin-indusert Forstoppelse
Mus ble gitt mat og vann ad libitum før testperioden, og begge (med eller uten TCV-309) grupper forbrukes sammenlignbare mengder mat før testen målt over en 24-timers periode i testmiljøet. Ingen mat eller vann var tilgjengelig i løpet av testen. Mus ble bur i akryl bokser med gittergulv suspendert i løpet av filterpapir. Fekale boli ble oppsamlet fra hver gruppe av mus hver time i 1 time etter injeksjon av saltløsning eller forskjellige doser av morfin og vekten av fecal boli ble registrert som en indeks over forstopp effekter av morfin.
generasjon Kaplan-Meier overlevelseskurver
helse~~POS=TRUNC av musene ble undersøkt daglig. Mus som presenteres med tegn på dårlig helse ble drept ved halshugging i henhold til anbefalingene fra vår Etisk Komité. I vår erfaring, disse skiltene foran tidspunktet for dødsfallet av et par dager. Dødstidspunktet ble notert for hver mus som ble funnet døde eller ble drept. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert ved hjelp Graphpad Prism programvare (versjon 4, Graphpad, Inc, San Diego, California)
Statistiske analyser
Alle data er rapportert som verdier av gjennomsnitt ± SEM. (standardfeil av middelverdien). GraphPad Prism software versjon 4 ble anvendt for å utføre den statistiske analyse. Når det gjelder statistisk analyse av smerterelatert atferd, sammenligninger av allodynis ballen, tilbaketrekking terskel, vokter atferd og lem-bruk abnormitet av forskjellene mellom medikamentbehandlede grupper og kjøretøy-behandlede gruppen ble evaluert ved hjelp av to-veis ANOVA fulgt av Tukey-Kramer test, eller en uparet Student
t
-test. Sammenligninger av median overlevelse ble utført ved hjelp av log-rank og Gehan-Breslow-Wilcoxon-tester. En sannsynlighetsverdi (P) 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekter av systemisk administrasjon av Specific PAF-reseptorantagonister på berørings-allodyni og Smerte atferd i FBC Modell Mus
.
Effekter av TCV-309 på allodyni og smerteatferd (vokter atferd og lem-bruk abnormitet) ble undersøkt i FBC modell mus. TCV-309 med en rekkevidde på 10-300 mikrogram /kg intravenøst doseavhengig redusert allodyni stillingen (figur 1A) og øket tilbaketrekning terskel (figur 1B) ved 11 til 15 dager etter tumor-implantering i mus. Virkningene av TCV-309 var ganske langvarig. For eksempel, TCV-309 vesentlig bedres mekanisk allodyni av en enkelt injeksjon på 100 mikrogram /kg, intravenøst med en maksimal effekt på 1 til 2 dager etter injeksjonen opp til 6 dager. Vokter atferd ble kontinuerlig forverret i løpet av observasjonsperioden, mens lem-bruk abnormitet nådde en maksimal respons og fortsatte i perioden (figur 1C, 1D). Vokter atferd og lem-bruk abnormitet ble også forbedret ved TCV-309. TCV-309 opp til 1 mg /kg påvirket ikke generell oppførsel eller motorisk funksjon estimert ved RotaRod test (data ikke vist). Andre PAF-reseptorantagonister, BN 50739 og WEB 2086, også bedres de allodyni og smerte atferd i FBC modell mus (Figure1E-1H).
TCV-309 0,01 til 0,3 mg /kg, WEB 2086 0,1 mg /kg, BN 50739 0,1 mg /kg eller et kjøretøy ble injisert intravenøst i 11 dager etter tumortransplantasjon. Kontrollmus mottok injeksjoner av et kjøretøy: saltløsning eller 25% 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstrin. Den smerterelatert atferd som utvikles etter svulst implantering i mus ble ikke påvirket av kjøretøy behandlinger. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. n = 11 mus pr gruppe. † P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontroll (kjøretøy behandlet) verdier, som bestemmes av variansanalyse fulgt av Tukey-Kramer test
Effekter av blokkaden av Spinal PAF reseptorer på. allodyni og smerte atferd i FBC Modell Mus
for å bekrefte stedet av kreft smertelindring ved PAF-antagonister, effekten av intratekal injeksjon av TCV-309 og WEB 2086, og også forstyrrelser i uttrykket av spinal PAF reseptorer hjelp siRNA av PAF reseptor mRNA ble undersøkt. Spinal administrering av 10 pg av disse stoffene 13 dager etter tumor implantasjon produsert rask og merket undertrykkelse av taktil allodyni med maksimal effekt på 1 dag etter implantering og undertrykte betydelig den allodyni innen 4 dager (Figur 2A). Pain utslipp effekter evaluert av tilbaketrekking terskel, vokter atferd og lem-bruk abnormitet av intratekal injeksjon av TCV-309 og WEB 2086 ble også oppnådd (figur 2B-2D)
(A-D).; Tumorceller ble implantert i intramedulla av venstre femur ben 13 dager før den intratekal (i.t.) injeksjon av PAF-reseptorantagonister. TCV-309 (10 pg /mus), ble WEB 2086 (10 pg /mus) eller kjøretøyet injiseres intratekalt ved «0». Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM., N = 8-12 mus per gruppe. * P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontroll (bærer behandlet) verdier, som bestemt ved analyse av varians etterfulgt av Tukey-Kramer test. Kontroll mus fikk injeksjoner med et kjøretøy: ACSF. Den smerterelatert atferd som utvikles etter svulst implantering i mus ble ikke påvirket av kjøretøy behandlinger. (E-H); siRNA eller feilaktige siRNA av PAF-reseptor mRNA ble transfektert inn i ryggmargen 13 dager etter tumor implantasjon. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. n = 8-10 mus per gruppe. † P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontroll (manglende samsvar siRNA transfeksjon) verdier, som bestemmes ved analyse av valiance etterfulgt av en uparet Student
t
-test. Kontroll mus fikk injeksjoner med feilaktige siRNA eller et kjøretøy: bare HVJ-konvolutt. Den smerterelatert atferd som utvikles etter svulst implantering i mus ble ikke påvirket av feilaktige siRNA eller kjøretøy behandlinger.
knockdown av uttrykket av spinal PAF reseptor protein ble oppnådd ved intratekal overføring av PAF reseptor siRNA i mus. Som tidligere rapportert, en betydelig reduksjon i PAF-reseptor-ekspresjon i normale mus og mus 15 dager etter kirurgi på hoftenervene, og nådde 37,5 ± 5,4% og 29,9 ± 4,9% av kontroll ved 3 dager etter siRNA transfeksjon, henholdsvis, mens uttrykket ble ikke endret ved den HVJ-E vektor alene eller feilaktige siRNA [5]. Ved siRNA transfeksjon 13 dager etter tumor implantasjon, den allodyni score, tilbaketrekking terskel, vokter atferd en lem-bruk abnormitet ble forbedret med toppeffekt på 2 til 3 dager etter siRNA transfeksjon, mens smerte-lindring handling gradvis forsvant over 9 dager (figur 3E-3H). Injeksjon av feilaktige siRNA hadde ingen effekt på utvikling av allodyni og smerte atferd. Mengden av LPCAT2 protein økt betydelig i ryggmargen på 8, 15 og 30 dager etter transplantasjon av NCTC 2472 svulstceller i mus tibia (figur 3). Resultatene støtter ideen om at PAF økning i ryggmargen av tumorbærende mus kan forholde seg til smerte produksjon og at området av smerte-lindring handling av PAF reseptorantagonister involvere ryggmargen i FBC mus.
endring av rygg LPCAT2 ekspresjon 3, 8, 15 og 30 dager etter at nivåene av immunoreaktivitet ble normalisert til den for β-actin og representert som% induksjon sammenlignet med verdiene av sham-operert (døyve celler implantert) mus (gjennomsnitt ± SEM ., n = 5-7). * P 0,05, *** P 0,001 versus de tilsvarende verdiene i humbug-opererte mus (uparede Student
t
-test)
Forsterkning av analgetisk effekt ved kombinasjon. PAF-reseptorantagonister med morfin
Bone kreft smerte er en av de mest alvorlige typer av kreftsmerter og er ofte resistent mot behandling, selv med opioidanalgetika. Kombinasjoner av opioider og ikke-opioide analgetika er vanlig praksis å få en bedre analgetisk effekt i klinisk praksis. Samtidig administrering av morfin med TCV-309 ble undersøkt (Figur 4A). Morfin 0,1 og 0,3 mg /kg injeksjon av 1 dag etter TCV-309 3 og 10 ug /kg administrering førte til en markert reduksjon i allodyni poengsum på 30 minutter etter morfininjeksjon og virkningen returnert til hvert nivå av TCV-309 alene på 3 til 4 timer etter administrasjon. Kombinasjonen av morfin 1 mg /kg med gabapentin 10 mg /kg i.v. hadde ingen signifikant anti-allodyni effekt (figur 4B). En stor dose av gabapentin, 30 mg /kg, var nødvendig for å frembringe en forbigående anti-allodyni effekt. Morfin alene hadde liten analgetisk effekt på 0,3 til 3 mg /kg, s.c. og en liten virkning ved 10 mg /kg i FBC modell. En høyere dose på 30 mg /kg av morfin var mindre effektiv (figur 4C).
TCV-309, 3 og 10 ug /kg ble injisert i.v. 10 dager etter tumor-implantasjon og morfin 0,1 mg /kg og 0,3 mg /kg ble injisert s.c. En dag etter injeksjon av TCV-309 (A). Gabapentine 10 og 30 mg /kg i.v. ble injisert 11 dager etter tumortransplantasjon og morfin, 1 mg /kg ble injisert ved 30 min etter injeksjon gabapentin (B). Morfin 0,3 til 30 mg /kg ble injisert ved 11days stolpe tumortransplantasjon (C). Smerte-lignende atferd ble evaluert ved 20 min etter morfin injeksjon. Ulike doser av TCV-309 ble injisert intravenøst 11 dager etter tumor implantasjon og morfin 0,3 mg /kg ble injisert subkutant 1 dager etter injeksjonen av TCV-309 (D). Én dag etter injeksjonen av TCV-309, ble forskjellige doser av morfin injisert (E). Kontroll mus fikk injeksjoner med et kjøretøy: saltvann. Den smerterelatert atferd som utvikles etter svulst implantering i mus ble ikke påvirket av kjøretøy behandlinger. Hver gruppe inneholdt 11 mus.
† P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontroll (bærer behandlet) verdier, som bestemt ved analyse av varians etterfulgt av Tukey-Kramer test.
§P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontroll (kjøretøy behandles uten morfin) verdier, som bestemmes av variansanalyse fulgt av en uparet Student
t
-test
. dose-respons-forhold av TCV-309 og morfin i kombinasjon er vist i figur 4D og 4E. Morfin 0,3 mg /kg og TCV-309 0,1-1,0 ug /kg ved hver dose alene hadde ingen anti-allodyni effekt, men i kombinasjon, skåre allodyni ble redusert med mer enn 90%, avhengig av dosen av TCV-309 (figur 4D ). Morfin i kombinasjon med TCV-309 10 ug /kg så lavt som 0,03 mg /kg ga en signifikant anti-allodyni effekt og avskaffet allodyni respons ved 0,3 mg /kg (figur 4E). Åtte dager etter injeksjonen av TCV-309, WEB 2086 og BN 50739, smertestillende virkning av disse forbindelser ble ikke signifikant (figur 5). Men den ekstra administrasjon av morfin 0,3 mg /kg fortsatt markert bedres allodyni og smerteatferd (figur 5). Resultatene viste at PAF-reseptorantagonister oppnår langvarig forsterkning av den smertestillende effekt når morfin ble gitt.
TCV-309, WEB 2086 og BN 50739 ble administrert på 11 dager etter tumor implantasjon. Morfin 0,3 mg /kg s.c. ble injisert ved 8 dager etter injeksjon av PAF-reseptorantagonister. Allodyni (A, B), vokter oppførsel (C) og lem bruk abnormitet (D) ble undersøkt ved 20 min etter injeksjon av morfin. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. n = 11 mus pr gruppe. * P 0,01 sammenlignet med tilsvarende kontrollverdiene, som bestemmes av variansanalyse fulgt av en uparet Student
t
-test
Effekt av PAF-reseptorantagonister på Morphine utløst. forstoppelse
forstoppelse er en av de mest vanlige bivirkninger av morfin og det vises i nesten alle pasienter som ble behandlet med morfin. Dersom hindringen effekten av morfin på intestinal aktivitet ikke forsterkes, kan denne bivirkning av morfin reduseres ved å redusere doseringen av morfin uten å forstyrre den smertestillende effekt. Morfin redusert mengden av avføring fra 1 mg /kg s.c. og avskaffet det mer enn 10 mg /kg. Den doseavhengige effekt forstoppelse av morfin ble ikke påvirket av TCV-309 10 ug /kg (Figur 6).
Normal mus mottok med forskjellige doser av morfin og de akkumulerte avføring på gulvet i løpet av 60-309 var injisert en dag før morfin administrasjon. Data er uttrykt som gjennomsnitt. n = 10 mus per gruppe.
gjentatt administrasjon av TCV-309 vernes mot Utseende of Pain-lignende oppførsel
Som anti-allodyni effekten av TCV-309 var lang- varig, effekten av gjentatt administrasjon undersøkt. I kontroll mus, taktil allodyni dukket opp på 3 dager etter tumor implantasjon og nådde til topp respons på 8 dager. Vokter oppførsel dukket opp på 10 dager etter tumor-implantasjon og gradvis øket i løpet av 30 dager, mens lem bruk abnormitet ut på 8 dager og nådde et maksimum ved ca. 16 dager etter implantasjon (figur 7A-7D). Injeksjon av TCV-309 ved 0,3 mg /kg, i.v. ble startet på dag mus ble implantert med tumor og ble fortsatt hver 4. dag i 28 dager. Smerte atferd evaluert av allodyni score, tilbaketrekking terskel, vokter atferd og lem-bruk abnormitet ikke vises under dosering (figur 2). Dermed blir behandling med TCV-309 før smerten oppsto beskyttet mot krise av smerte og toleranse for TCV-309 analgesi ikke utvikler.
Administrasjon av TCV-309 0,3 mg /kg intravenøst ble startet 6 timer før den tumorimplantasjon, gitt en gang om dagen og fortsatte hver 4 dager opp til 28 dager.
