Abstract
Endret DNA metylering av tumorsuppressorgenet arrangører spiller en rolle i menneskelige karsinogenisitetsstudier og DNA metyltransferaser (DNMTs) er ansvarlig for den. Denne studien hadde som mål å finne ut avvikende uttrykk for DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b i godartede og ondartede eggstokk tumorvev for deres tilknytning clinicopathological betydning og prognostisk verdi. Totalt 142 eggstokkreft og 44 godartede ovarietumorer ble rekruttert for immunhistokjemisk analyse av deres uttrykk. Dataene viste at ble observert uttrykk for DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b i 76 (53,5%), 92 (64,8%) og 79 (55,6%) av 142 tilfeller av eggstokkreft vev, henholdsvis. Av de alvorlige svulster, DNMT3a protein uttrykk var betydelig høyere enn i godartede tumorprøver (
P
= 0,001); DNMT3b var marginalt signifikant nedregulert i eggstokkreft sammenlignet med de godartede svulster (
P
= 0,054); DNMT1 uttrykket ikke har noen statistisk forskjell mellom eggstokkreft og godartede tumorvev (
P
= 0,837). Av de mucious svulster, uttrykk for DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 var ikke forskjellig mellom ondartede og godartede svulster. Videre ble DNMT1 uttrykk forbundet med DNMT3b uttrykk (
P
= 0,020, r = 0,195). DNMT1 ekspresjon ble assosiert med alder av pasientene, menopause status, og tumorlokalisering, mens DNMT3a ekspresjon var forbundet med histologiske typer og serumnivåer CA125 og DNMT3b ekspresjon var forbundet med lymfeknutemetastase. I tillegg pasienter med DNMT1 eller DNMT3b uttrykk hatt en trend med bedre overlevelse enn de med negative uttrykk. Co-uttrykk for DNMT1 og DNMT3b var signifikant assosiert med bedre total overlevelse (
P
= 0,014). Dataene fra denne studien gitt den første bevis for differensial uttrykk for DNMTs proteiner i ovarian kreft vev og deres foreninger med clinicopathological og overlevelsesdata i sporadiske kreftpasienter på eggstokkene
Citation. Bai X, Song Z, Fu Y, Yu Z, Zhao L, Zhao H, et al. (2012) Clinicopathological Betydning og prognostisk verdi av DNA metyltransferase 1, 3a og 3b uttrykk i Sporadisk ovarialcancer. PLoS ONE 7 (6): e40024. doi: 10,1371 /journal.pone.0040024
Redaktør: M.Carolina Elias, Instituto Butantan, Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada, Brasil
mottatt: 08.02.2012; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Bai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (nr 30873097 og nr 30973559) og Science and Technology Department of Liaoning-provinsen (nr 2010225001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetisk endring av det genomiske DNA refererer til funksjonelt relevante modifikasjoner av genomet som påvirker genekspresjon, men ikke innebære en endring i nukleotidsekvensen, som spiller en viktig rolle i human karsinogenese. Slike modifikasjoner innbefatter DNA-metylering, kromatin remodellering og histon-varianter, og den epigenetisk funksjon av ikke-kodende RNA [1]. Blant disse, er DNA-metylering en kovalent modifikasjon av DNA som spiller en viktig rolle i å sette genekspresjon programmer under utvikling [2]. Likevel ikke unormal DNA-metylering også spille en viktig rolle i human utvikling kreft, og de fleste kreftceller viser en global hypometylering av genomet som induserer unormal ekspresjon av gener, men en lokal hypermethylation som slår av tumorsuppressorgener [1], [3]. I pattedyr, er DNA metylering etablert og vedlikeholdes i hovedsak av tre DNA metyltransferaser (DNMTs), nemlig DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b. Den foretrukne målet for DNMT1 er hemi-metylert DNA [4], [5] og dette proteinet fungerer som en «vedlikehold» metyltransferase og det primære enzymet ansvarlig for kopiering av metylering mønstre etter DNA-replikasjon. Det lokaliserer til replikering foci og samhandler med spredning cell nuclear antigen (PCNA) [6]. I kontrast, DNMT3a og DNMT3b er avgjørende for tidlig embryoutvikling og ansvar for de novo metylering [7]. Overekspresjon av disse tre DNMTs har blitt rapportert i forskjellige maligniteter og assosiert med dårlig overlevelse av forskjellige kreftformer, inkludert lunge, lever og livmorhalskreft og lymfomer [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. I motsetning til kreft-assosiert genmutasjoner, presiseringer og slettinger, er DNA metylering potensielt reversible. Dermed DNMTs har blitt undersøkt som et mål for re-uttrykk for tumorsuppressorgener og reversering av ondartede fenotyper i forskjellige maligniteter [19]. Nå nylig, antisensoligonukleotider målretting DNMT gener, for eksempel MG98, ser ut til å være effektive i prekliniske studier og har nå inngått klinisk fase I og fase II-studier [20], [21].
epitelial eggstokkreft er den sjette ledende kreft hos kvinner over hele verden og den nest vanligste gynekologisk kreft, og står for ca 4% av alle kvinnelige kreft [22], [23]. På grunn av manglende tidlige varseltegn og effektive screening verktøy, flertallet av pasienter til stede med sene stadier av sykdommen [24]. Epitelial eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft og fem-års overlevelse er under 25% for pasienter diagnostisert med stadium III – IV sykdommer [25], [26]. I likhet med andre kreftformer, avvikende DNA metylering på CpG øyer er også en viktig mekanisme for eggstokkreft utvikling. Prekliniske studier indikerte at de-metylering agenter var i stand til å reversere motstand av eggstokkreft celler til platina [27], [28], noe som fører til bruk av DNMT hemmere i kliniske studier med eggstokkreft [29], [30], [31], [32]. Men det finnes ingen studier av DNMT proteiner i eggstokkreft vev data, selv om to tidligere studier har rapportert uttrykk for DNMT mRNA i eggstokkreft cellelinjer og prøver små vev [33], [34]. I denne studien har vi samlet inn 142 tilfeller av epiteliale ovarialcancer prøver og 44 tilfeller av godartede ovarietumorer for påvisning av DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b protein uttrykk for å avgjøre hvilken rolle DNMT proteiner i eggstokkreft og klinisk betydning.
Resultater
Pasient Kjennetegn
i denne studien rekrutterte vi vevsprøver fra 186 eggstokkene tumorprøver for evaluering av DNMTs protein uttrykk. De clinicopathological data fra pasientene er vist i tabell 1. Kort, gjennomsnittsalderen av pasientene ved kirurgi var 53 år (fra 20 til 74 år). 27 (23,3%) pasienter som hadde lymfeknute-metastasert sykdom ved tidspunktet for kirurgi og 110 (77,5%) pasienter som hadde serøs karsinom som hoved histologisk diagnose, etterfulgt av mucinous karsinom (8,5%), var lett cellecarcinom (~5.6%) og udifferensiert karsinom (~5.6%). Serumnivåene av CA125, CA199, og CEA ble hevet før operasjonen, men ingen av pasientene mottatt noen neo-adjuvant kjemoterapi. Oppfølgingsdata var tilgjengelig for 85 pasienter. Gjennomsnittlig og median total overlevelse (OS) var 56,1 og 41,0 måneder, henholdsvis med 95% konfidensintervall på 45,3 til 66,9 og 33,2 til 48,8 måneder. Gjennomsnittlig og median sykdomsfrie overlevelse (DFS) var 46,6 og 26,0 måneder, henholdsvis med 95% konfidensintervall på 36,4 til 56,9 og 14,6 til 37,4 måneder. I de 44 godartede svulster, 31 var serøs og 13 mucinous.
Differensial Expression of DNMT Proteiner i ondartet og godartet ovarietumorer
Differensial uttrykk for DNMT proteiner i maligne og benigne ovarietumorer i henhold til histologisk type er oppsummert i tabell 2. spesielt ekspresjon av DNMT3a protein var signifikant høyere enn den til godartede tumorvev (Mann-Whitney U-test test,
P
= 0,001, tabell 2), men forskjellen ble ikke observert i mucious svulster (Mann-Whitney U-test test,
P
= 0,813; tabell 2). Mens DNMT3b protein ble detektert i 64 (58,2%) av de 110 serøse krefttilfellene og 22 (71,0%) av de 31 serøs godartede svulster, noe som indikerer at ekspresjon DNMT3b i eggstokk-kreft var lavere, men ikke signifikant enn den til godartede tumorer (mann- Whitney U-test test,
P
= 0,054; tabell 2), men forskjellen ble ikke observert i mucious svulster (Mann-Whitney U-test test,
P
= 0,536; Tabell 2 ). I kontrast, uttrykk for DNMT1 protein var ikke signifikant forskjellig i eggstokkreft og godartet svulst prøver enten i alvorlig eller i mucious tumorer (Mann-Whitney U-test testen, serøs:
P
= 0,837; mucious:
P
= 0,315 Tabell 2). Representative uttrykk mønstre av immunhistokjemisk farging av DNMTs i eggstokk-kreft og godartede tumorvev ble vist i figur 1 og figur 2 henholdsvis. Neste, vi assosiert uttrykk for disse tre DNMT proteiner i eggstokkreft vev ved hjelp av Spearman rang korrelasjon test. Dataene viste at uttrykket av DNMT1 var signifikant assosiert med DNMT3b (r = 0,195,
P
= 0,020, Tabell 3), men ikke med DNMT3a protein (r = 0,130,
P
= 0,122 ; Tabell 3) eller mellom DNMT3a og DNMT3b proteiner (r = 0,152,
P
= 0,071;. tabell 3)
Representative eksempler på negative (A, E, i) , svakt positiv (B, F, J), moderat positiv (C, G, K), og sterkt positive (D, H, L) for farging DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 ekspresjon er vist, henholdsvis; Pilene angir feltet forstørret. Forstørrelse: × 400; forstørrede områder. × 1000
Representative eksempler på negative (A, E, I), svakt positive (B, F, J), moderat positive (C, G, K), og sterke positive (D, H, L) for farging DNMT3a, DNMT3b, og DNMT1 ekspresjon er vist, henholdsvis. Forstørrelse:. × 400
Association mellom Expression of DNMT Proteiner og Clinicopathological Parametere
Etter oppdaget uttrykk for disse tre DNMT proteiner ved hjelp av immunhistokjemi, assosiert vi deres uttrykk med clinicopathological data fra pasientene. Våre data viste at DNMT1 uttrykk var signifikant assosiert med alder og overgangsalder tilstand av pasientene, og med tumorlokalisering. Expression of DNMT1 protein i den eldre ( 53 år) eller postmenopausale pasienter var høyere enn for yngre pasienter (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,028, Tabell 4) eller premenopausale pasienter (Pearson kine- kvadrat test,
P
0.000, tabell 4). Videre uttrykk for DNMT1 protein var høyere hos de pasientene som har svulst skjedde i én side enn for pasienter med svulst skjedde i begge sider (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,010; tabell 4). Men det var ingen signifikante assosiasjoner til stede mellom DNMT1 immunoreaktivitets og tumor størrelse, lymfeknutemetastase, klinisk stadium, histologisk type CA125, eller CA199.
Videre var det en signifikant sammenheng mellom DNMT3a og serum CA125 nivå (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,044; tabell 4). Ekspresjon av DNMT3a protein var 69,1% i serøs karsinom, som var høyere enn den til mucinous karsinom (33,3%) og klar celle carcinoma (50%) (Fishers eksakte test,
P
= 0,027, tabell 4). Men det var ingen sammenheng mellom DNMT3a immunreaktivitet og andre kliniske patologiske parametere, som vist i tabell 4.
I tillegg viser dataene viste at DNMT3b ekspresjon var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase av kreft i eggstokkene (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,027; tabell 4). Selv om det ikke er statistisk signifikant, uttrykk for DNMT3b protein kunne være forbundet med høyt nivå av serum CA199 (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,061; Tabell 4).
Co- uttrykk for DNMT1 og DNMT3a var signifikant forbundet med overgangsalder tilstand (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,008; Tabell 4) og plasseringen av svulsten (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,036; tabell 4), mens co-uttrykk for DNMT1 og DNMT3b var signifikant forbundet med overgangsalder tilstand (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,001; Tabell 4) og plasseringen av svulsten (Pearson kine- kvadrat test,
P
= 0,015; tabell 4). Co-uttrykk for DNMT1 og DNMT3b ble også signifikant assosiert med serum CA199 nivåer (Pearson Chi-Square test,
P
= 0,013, Tabell 4).
Forbund DNMT Protein Uttrykk med Survival pasient~~POS=TRUNC
Etter at vi i forbindelse uttrykk for DNMT protein med overlevelse av pasienter som bruker Kaplan-Meier analyse (figur 3). Spesielt, selv om det ikke er vesentlig forskjellige, pasienter med DNMT uttrykk hadde en tendens til forbedret overlevelse enn de med negative uttrykk, på motsatt side av resultater fra tidligere studier i andre typer kreft [8], [13], [17], [18 ], [35], [36]. I våre prøver, DNMT1 uttrykk marginalt assosiert med økt OS (
P
= 0,084, Fig. 3A) og DFS (
P
= 0,186, Fig. 3D); og det gjorde DNMT3b. Videre co-uttrykk for DNMT1 og DNMT3b var signifikant assosiert med økt total overlevelse sammenlignet med andre prøver (bare DNMT1 eller DNMT3b uttrykk eller begge negative) (
P
= 0,014, fig. 4C). Univariat analyse av den potensielle prognostisk virkningen av kliniske og histopatologiske parametere identifisert klinisk stadium, plassering av tumor, og serum CA125 nivå som i betydelig grad eller marginalt signifikant assosiert med kortere OS og DFS (tabell 5).
Overlevelseskurver viser at selv om det ikke var noen statistisk signifikans, pasienter med DNMT1 uttrykk hadde en tendens til forbedret total overlevelse (A) og sykdomsfri overlevelse (D) enn de med negative uttrykk, og det samme gjorde DNMT3b (C og F). Men det er ingen signifikant forskjell mellom DNMT3a uttrykk og total overlevelse eller sykdomsfri overlevelse (B og E).
P
-verdi hentet fra log-rank test.
Overlevelseskurvene viser at samtidig uttrykk for DNMT1 og DNMT3b var signifikant assosiert med økt total overlevelse sammenlignet med negative prøver (
P
= 0,014, fig. 3E).
P
-verdi hentet fra log-rank test.
Deretter multivariate Cox regresjonsanalyse ved hjelp av klinisk stadium, tumor størrelse, plassering av neoplasi, DNMT1 og DNMT3b co ekspresjon avdekket at kun klinisk stadium (OS,
P
= 0,022, RR = 6,977, 95% KI: 1.322~36.822, DFS,
P
= 0,026, RR = 4,686, 95% CI: 1.207~18.196) forble som en selvstendig prognostisk faktor (tabell 6)
undergruppeanalyse av foreningen mellom DNMT uttrykk og klinisk utfall og pasient
Videre analyser ble utført med. hensyn til DNMTs uttrykk i undergrupper av pasienter med ulike clinicopathological parametere, slik som alder, menopause tilstand, tumor størrelse, klinisk stadium, lymfeknutemetastase, og plassering av svulsten. Våre data viser at uttrykket av DNMT1 protein var assosiert med økt DFS hos pasienter med større størrelse av svulster (DFS,
P
= 0,027; figur S1). Uttrykk for DNMT1 syntes å være en beskyttende faktor i pasienter med tumor skjedde i begge sider, men det er ikke statistisk signifikant (OS,
P
= 0,139; figur S1) (DFS,
P
= 0,269; fig S1); motsatte av funn fra pasienter med tumor skjedde i én side (OS,
P
= 0,429; figur S1) (DFS,
P
= 0,210; figur S1). I kontrast, DNMT3a protein nivåer klarte ikke å vise noen assosiasjoner med pasient overlevelse (
P
0,05, Figur S2). DNMT3b uttrykk var assosiert med forlenget OS hos eldre pasienter (
P
= 0,011; figur S3), postmenopausale pasienter (
P
= 0,019; figur S3), og pasienter med svulst skjedde i begge sider (
P
= 0,022; figur S3). Expression of DNMT3b protein også marginalt forbundet med langvarig DFS hos postmenopausale pasienter (
P
= 0,098; figur S3) og pasienter med tumor skjedde i begge sider (
P
= 0,097; figur S3).
Diskusjoner
i denne studien har vi for første gang immunohistochemically bestemt uttrykk for DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b proteiner i godartede og ondartede eggstokkene tumorvev. Dataene viste at DNMT3a ekspresjon var høyere i eggstokkreft enn det i godartede svulster, som var i samsvar med de foregående studier i andre typer av kreft [15], [37], [38]. Imidlertid, selv om flere tidligere studier har vist at ekspresjonsnivåene av DNMT3b mRNA [8], [9], [39], [40] og protein [13], [40], [41] ble øket i en rekke av ondartede svulster , vår nåværende data viste en lavere uttrykk for DNMT3b i eggstokkreft vev sammenlignet med godartet svulst. I denne studien fant vi også at det ikke var noen forskjell i uttrykk for DNMT1 protein mellom eggstokkene godartede og ondartede vev. Det er behagelig for en tidligere undersøkelse rapporterer at det ikke var noen forskjell i DNMT1 mRNA-ekspresjon hos normal ovarievev, primær eggstokk-kreft, og gjentakelse av ovarialcancer vev [33]. En annen rapport viste at ekspresjon av DNMT1 mRNA-nivåer i eggstokkkreft HeyA8 og HeyC2 cellelinjer som var høyere enn den normale eggstokk-epiteliale celler [34]. Vår studien påvist for første gang ekspresjonen av DNMT proteiner i eggstokkreft ved sammenlignet med benigne vev; således videre studier er nødvendig for å analysere den endrede ekspresjon av proteiner i DNMT eggstokkreft med sammenligning med normale eggstokk-vev. I noen treff, på grunn av de komplekse mekanismer som er ansvarlig for regulering av DNMT uttrykk og funksjoner av DNMTs i carcinogenese, bør det endrede ekspresjon og virkninger av DNMTs undersøkes nærmere i eggstokk-kreft, selv om deres avvikende uttrykk ble funnet å være på grunn av metylering av deres gene promotorer i forskjellige kreftformer, som gliomer og embryonale vev [42], [43]. Men mutasjon og tap av uttrykk av p53 protein førte til overekspresjon av DNMT1 i leukemi, tykktarmskreft og lungekreft [44]. I tillegg er microRNAs også involvert i reguleringen av ekspresjonen DNMT [45], [46]. Borderline epitelial tumor var en betydelig og viktig gruppe av epitelial tumor i eggstokk. Vi har også samlet border epiteltumorer men antall borderline tumorer tilgjengelig i vår studie var bare 6, så vi har ikke analysert border epiteltumorer i denne studien, og vi vil fortsette å samle inn mer borderline tumorer for fremtidige studier.
videre vår nåværende studie videre forbundet relevansen av tre DNMT proteinuttrykk med clinicopathological funksjoner fra ovarian kreftpasienter. Dataene viste at DNMT1 ekspresjon var positivt korrelert med alder av pasientene, dvs. DNMT1 protein ble uttrykt mer hos eldre pasienter, data av hvilke var i overensstemmelse med den av lymfom [13]. Videre ble DNMT1 protein uttrykt mer hos postmenopausale pasienter enn at i pre-menopausale pasienter. I tillegg er våre data viste at uttrykket av DNMT1 protein var relevant med lokalisering av svulsten. Men til dags dato, vi vet ikke hvorfor disse har skjedd eller innblanding av disse foreningene. I tillegg har vi også funnet at ekspresjonen av DNMT1 var høyere i den ensidige ovarian cancer enn i den bilaterale eggstokkreft, som kan angi differansen av ensidig og tosidig eggstokkreft når det gjelder den biologiske egenskaper, genetikk og mekanisme. En tidligere studie har rapportert at DNMT1 uttrykket var forbundet med lymfeknutemetastase i bukspyttkjertelen kreft [17], men vi har ikke funnet en slik sammenheng i eggstokkreft.
I tillegg vår nåværende studie viste at DNMT3a uttrykk var forbundet med histologisk type, f.eks, eggstokk-karsinom serøs uttrykte høye nivåer av DNMT3a protein. DNMT3a uttrykk var positivt assosiert med serum CA125 nivå, mens DNMT3b uttrykk var assosiert med lymfeknutemetastase og serum CA199 nivå, noe som er ny og ble ikke rapportere før.
Når det gjelder overlevelse prediksjon ved hjelp av ulike DNMT uttrykk, tidligere studier viste at overekspresjon av DNMT1 eller DNMT3b var assosiert med en dårlig prognose i kreft i lungene [15], lever [18], [35], og bukspyttkjertel [17], lymfom [13] og andre maligniteter. I eggstokkreft, vår nåværende studie viste en annen trend DNMT assosiasjoner med prognose, dvs. total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) for eggstokkreft pasientene var bedre med uttrykk av DNMT1 og DNMT3b proteiner sammenlignet med pasienter uten uttrykk for DNMT1 og DNMT3b proteiner. Videre co-uttrykk for DNMT1 og DNMT3b proteiner ble også signifikant assosiert med forbedret OS. Videre er våre ytterligere resultater viste at DNMT3a i forskjellige undergrupper av pasienter med ovarialcancer hadde ingen virkning på overlevelsen status, selv om DNMT1 uttrykk viste bedre OS og DFS i pasienter med store tumorer enn det hos pasienter med mindre svulster. Tilsvarende gjelder for DNMT3b uttrykk hos eldre pasienter, postmenopausale pasienter og pasienter med bilaterale svulster positive. Disse helt andre data fra denne studien foreslår ulike biologiske egenskaper eggstokkreft fra andre kreftformer. Imidlertid er fremtidige studier for å bekrefte vår nåværende funn.
I en rekke kreftformer, ble DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b rapportert å være sterkt uttrykt og assosiert med dårlig prognose. Hypermethylation av noen svulst undertrykke gen-arrangører (TSG) som påvirker prognosen kan delvis forklare dårlig prognose knyttet til pasienter med DNMT overekspresjon [47], [48], [49], [50], selv om metylering av de fleste genet arrangører doesn « t har høy korrelasjon med uttrykk for DNMTs [35], [51]. Imidlertid er det ikke kjent hvorfor høy ekspresjon av enkelte av disse DNMTs var assosiert med bedre prognose av ovarian kreftpasienter. Tidligere studier har vist at metylering av DNA CpG øy i tumorvev var ikke den eneste delen av hypermethylation av gener, som hypometylering også forekom i noen regioner av genomisk DNA, og det unormale hypometylering i humant genom påvirket prognosen for pasienter med prostatakreft, lever kreft, og gliom [52], [53], [54]. Som andre kreftformer, eggstokkreft celler viser også en global hypometylering i genomet og en lokal hypermethylation av tumorsuppressorgenet arrangører [55]. To tidligere studier som benyttet metylering brikke som high-throughput metode for å screene gen hypermethylations som kan påvirke prognosen for pasienter med kreft i eggstokkene [56], [57] og funnet at en høyere grad av CpG øy metylering er assosiert med redusert pasient progression- overlevelse (PFS). Mens andre studier har rapportert at arrangøren hypermethylation var involvert i DNA-skader reparasjonsgener i eggstokkreft og forbundet med økt prognosen for pasienter gjennom økt følsomhet for kjemoterapi [58], [59]. I tillegg har senere studier viste at DNMT inhibitor bare var i stand til delvis å reversere platina resistens hos pasienter med ovarialcancer [32]. En annen studie evaluerte aktivitet og toleranse av en demetylering middel fazarabine (Ara-AC) hos pasienter med eggstokkreft, og ingen måte komplett eller partiell respons ble observert i de 19 pasientene [29]. Tatt helt, indikerer vår nåværende studie at mekanismen og kliniske betydningen av endrede uttrykk for DNMTs i eggstokkreft kan vurderes nærmere.
Materialer og metoder
vevsprøver
Tissue prøver fra 186 pasienter med ovarietumorer ble rekruttert fra Institutt for kirurgisk onkologi og generell kirurgi, Kina Medical University-Affiliated første og andre sykehus mellom 2002 og 2010. ut av 186 tilfeller, 142 saker ble histologisk bekreftet som ovarian epithelial karsinom og 44 tilfeller var godartet ovarietumorer. Ingen av våre pasienter hadde noen familiehistorie med kreft. Pasientene ble operert iscenesatt i henhold til gjeldende FIGO (International Federation of Gynekologer og Fødselsleger klassifiseringssystemet). Histologisk diagnose ble nådd basert på kriteriene til Verdens helseorganisasjon. Vår studie var festet til en annen klinisk studie som vi innhentet informert samtykke fra alle deltakere. Fordi denne studien var om DNMT hemmer og vi ønsker å vite clinicopathological betydning og prognostisk verdi av DNMT uttrykk i sporadisk eggstokkreft. Så vi ønsker å legge til denne studien om DNMT uttrykk. Vi ringte til hver pasient, forklarte vår studie, og innhentet informert samtykke. Når vi kalt, en notarius publicus var til stede og vil avgi forklaring, og vi fikk mobiltelefonen kort melding som vi krevde deltakerne som samtykker studien å sende til oss. Fordi tiden var begrenset, og noen deltakere var ute av sykehuset, så det er vanskelig å innhente skriftlig samtykke. Instituttet Forskning Medical Ethics Committee of China Medical University behandlet og godkjent samtykke prosedyren. Til slutt fikk vi muntlig samtykke fra 186 pasienter.
Immunohistochemistry
Formalin-fiksert og parafininnstøpte vevsprøver ble kuttet i 4-mikrometer tykke seksjoner og montert på poly-L-lysin-belagte glass. For immunhistokjemisk farging, ble seksjonene deparaffinized i xylen, rehydrert i en serie av alkohol, og vaskes i vann fra springen. Seksjonene ble deretter kokt i 10 mM natriumcitrat, pH 6,0, i 10 minutter i en autoklav for antigen gjenfinning. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av seksjonene i 3% H
2o
2 ved 37 ° C i 20 min. Deretter ble seksjonene sperret for å unngå ikke-spesifikk binding ved tilsetning av en 10% normalt geiteserum ved 37 ° C i 30 minutter og deretter inkubert ved 4 ° C over natten med det polyklonale antistoff mot DNMTs (DNMT1, sc-20701, 1: 200 fortynning, DNMT3a, sc-20703, 1:200 fortynning, DNMT3b sc-130740, 1:100 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, USA). Spesifisiteten av antistoffene var blitt bekreftet ved hjelp av Western blot-analyse (data ikke vist). På den neste dag, ble seksjonene vasket fem ganger med 0,01 mol /l fosfat-bufret saltløsning (PBS; pH 7,4) i 15 minutter og deretter inkubert med et biotinylert sekundært antistoff i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Deretter ble seksjonene inkubert med streptavidin pepperrotperoksidase løsning i ytterligere 30 minutter (LSAB kit; Dako, Glostrup, Danmark), vasket i PBS og farget i DAB (3, 3-diaminobenzidin). Til slutt ble seksjonene motfarget med Mayer s hematoksylin, dehydrert, og montert. Negative kontroller ble kjørt parallelt, og ble generert av PBS erstatte anti-DNMTs antistoff.
Evaluering av Immunohistochemistry
De immun Seksjonene ble anmeldt og scoret uavhengig av to etterforskere som ble blindet av pasientenes clinicopathological egenskaper. Atom uttrykt DNMTs er funksjonell type DNMT proteiner; Derfor ble bare atom positivitet for DNMTs proteiner evaluert med semi-kvantitative scoring kriterier i henhold til fargeintensitet (0, negativ, 1, svak, 2, moderat, og 3, alvorlig) og andel positive celler (0, negativ; 1. positiv i ≤10%, 2, positiv i 10% og ≤50%, 3, positiv i 50% og ≤80%, 4, positiv i 80% av tumorceller). De to scorene ble multiplisert for hvert enkelt tilfelle og uttrykket ble gradert som: negativ, poengsum = 0; svake uttrykk, poengsum = 1-4; moderat uttrykk, poengsum = 5-8; og sterkt uttrykk, poengsum = 9-12.
Statistical Analysis
Sammenligning av DNMT uttrykk score mellom prøvene ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Spearman rank korrelasjon test ble utført for å analysere sammenhengen mellom DNMT uttrykk. Sammenhenger mellom clinicopathological faktorer og DNMTs uttrykk ble analysert ved hjelp av Chi-square (X
2) test eller Fishers Exact Probability Test. Overlevelse av pasientene i henhold til DNMT uttrykk ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier kurve analyse med log-rank test. Cox regresjonsanalyse ble benyttet for den multivariate analysen. Statistisk signifikans ble definert som
P
0,05. Alle statistiske tester ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakken (SPSS 11.5 Inc, Chicago, IL, USA).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av sammenhengen mellom DNMT1 uttrykk og OS og DFS i ulike undergrupper.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av sammenhengen mellom DNMT3a uttrykk og OS og DFS i ulike undergrupper.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av sammenhengen mellom DNMT3b uttrykk og OS og DFS i ulike undergrupper.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s003 plakater (TIF)
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Hua Chang og stål Liu fra Institutt for kirurgiske onkologi og generell kirurgi, Kina Universitetssykehus-tilknyttede første og andre sykehus for å få hjelp til å vevsprøver samling.
