Abstract
Noen potente kjemoterapi narkotika inkludert tubulin-bindende midler hadde blitt utviklet fra naturens planter, som for eksempel podophyllotoxin og paclitaxel. Men dårlig cytotoksiske selektivitet, alvorlige bivirkninger, og begrenset effektivitet er fortsatt de store bekymringene i deres terapeutiske anvendelse. Vi utviklet en helsyntetisk podophyllotoxin derivat heter Ching001 og undersøkt sin anti-tumor vekst effekter og mekanismer i lungekreft prekliniske modeller. Ching001 viste en selektiv cytotoksisitet til forskjellige lungecancer cellelinjer, men ikke til normale lungeceller. Ching001 hemmet polymerisering av mikrotubuli som resulterer i mitotisk stopp som fremgår av akkumulering av mitose-relaterte proteiner, Survivin og aurora B, og dermed føre til DNA-skade og apoptose. Ching001 aktivert også pro-apoptotiske ER stress signalveien. Intraperitoneal injeksjon av 2 mg /kg Ching001 vesentlig hemmet tumorvekst av A549 xenograft, mens injeksjon av 0,2 mg /kg Ching001 redusert lungekolonisering evne til A549-celler i eksperimentell metastase assay. Disse anti-tumor vekst og lungekoloniserings hemming effektene var sterkere enn de av paclitaxel behandling ved den samme dosering. De xenograft tumor vev flekker ytterligere bekreftet at Ching001 indusert mitose arrest og tumor apoptose. I tillegg er de hematologiske og biokjemiske tester av blodprøver, samt vev undersøkelser indikerte at behandling Ching001 ikke viste åpenbare organ toksisitet hos testede dyr. Vi følger preklinisk dokumentasjon på at nye syntetiske microtubule hemmer Ching001, som kan utløse DNA skade og apoptose ved å fremkalle mitotisk arrest og ER stress, er en potensiell anti-kreft sammensatt for videre utvikling av legemidler
Citation. Chen JY, Tang YA, Li WS, Chiou YC, Shieh JM, Wang YC (2013) En syntetisk podophyllotoxin Derivative Utøver anti-kreft effekter ved å fremkalle mitotisk stopp og Pro-apoptotiske ER stress i Lung Cancer Prekliniske Models. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10,1371 /journal.pone.0062082
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: Per 31. desember 2012; Godkjent: 17 mars 2013; Publisert: 30 april 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd CMNCKU10107 fra Chi Mei Medical Center, Taiwan (JMS) og NSC 101-2325-B-006-008 fra National Science Council, Taiwan (YCW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Noen potente kjemoterapi narkotika hadde blitt hentet fra naturen planter. For eksempel, podofyllotoksin, renset en aktiv komponent fra
Podophyllum peltatum product: [1] – [3], blir brukt som en standard behandling for veneriske vorter [4]. Podophyllotoxin hemmer microtubule polymerisasjon fører til mitose svikt og cellesyklus arrest [5] – [7]. Halvsyntetiske derivater av podofyllotoksin, for eksempel etoposid og teniposid, er for tiden brukes anti-kreft legemidler for leukemi, lymfom, glioblastom, lungekreft og testikkelkreft kreft [8]. Mange andre anti-kreft medikamenter avledet fra naturlige urter også har evnen til å inhibere mikrotubulidynamikk [2], [9]. For eksempel, taxol (eller paclitaxel) og vinkaalkaloid forbindelser er naturlige produkter renset fra
stillehavsbarlind
eller
Catharanthus Roseus
hhv. Tidligere studier viser at paclitaxel og vinkaalkaloid forbindelser kan avbryte mikrotubulidynamikk [9] – [13]
Selv om mange tubulin bindemidler hadde blitt utviklet, sterk cytotoksisitet mot normale celler, benmargsdepresjon med og økt risiko for. sekundær akutt myelogen leukemi begrense deres kliniske effekten [1], [14] – [16]. Derfor er utvikling av nye midler med bedre selektivitet og cytotoksisk begrensede bivirkninger viktig for anti-kreft-behandling. Vi har utviklet en ny helsyntetisk podofyllotoksin-derivat med høy renhet og godt utbytte heter Ching001, og fant at Ching001 viste sterk cytotoksisitet bestemt i lungekreft cellelinjer, men ikke i normale lungeceller. Ching001 hemmet microtubule polymerisasjon og arresterte cellesyklus ved mitose. Ching001 indusert apoptose ved induksjon av DNA-skade og aktivering av ER stress signalering. Ching001 viste tumorvekstinhibitering og hindre svulst kolonisering uten åpenbare bivirkninger i xenograft modeller, noe som tyder på at det kunne bli ytterligere testet som en roman anti-tumor reagens.
Resultater
Ching001 Viser Selektiv Cytotoksisitet mot kreft, men ikke normale lungeceller
Ching001 er en fullstendig syntetisk sammensetning og dets struktur er vist på fig. 1A. Cytotoksisiteten av Ching001 i forskjellige lungecancercellelinjer og MRC5 normal lunge cellelinje ble analysert. IC50-verdien beregnet ved regresjonsanalyse fra forskjellige cellelinjer var: CL1-0, 1,99 pM; CL1-5, 1,90 mikrometer; A549, 1,21 mikrometer; H1299, 2,58 mikrometer; og MRC5, 8,27 uM for Ching001 behandling etter 48 timer (fig. 1B). Ching001 viste en selektiv cytotoksisitet til lungekreftceller, men ikke til normale humane MRC5 lungeceller.
(A) Strukturen av Ching001 forbindelsen. (B) Cytotoksisitet analyse av normal lunge MRC5 og forskjellige lungecancerceller ble målt ved trypan-blå farging. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Ching001 i 48 timer. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom de normale MRC5 celler og kreftceller. ***
P
0,001. (C) Strømningscytometri-analyse av cellesyklusfordelingen av lungekreft cellelinjer som ble behandlet med varierende doser av Ching001 og for ulike varigheter. (D) Immunofluorescens for α-tubulin (grønn) og DAPI nukleær farging (blå) etter 1 uM Ching001 behandling i 2 til 8 timer i S-fase synkroniseres lungecancercellelinjer. DMSO ble anvendt som oppløsningsmiddel kontroll. Skala barer: 10 mikrometer
Ching001 hemmer microtubule Polymerisering og Forsinkelser M-fase Progresjon
Siden podophyllotoxin er kjent for å målrette microtubule, kan dens strukturelle analog Ching001 også målrette microtubule.. Mikrotubuli-sammenstillingen analyse viste at en iM Ching001 behandling minsket den uløselige polymerisert form av mikrotubuli i løpet av 6 timer (fig. S1A). Den immunfluorescens av α-tubulin viste signifikant forstyrrelse av microtubuli organisasjon sammenlignet med løsemiddel kontroll DMSO i både A549 og CL1-5 lungekreft celler (Fig. S1B). Disse resultater antyder at mikrotubulus er den potensielle mål for Ching001.
Deretter undersøkte vi effekten av Ching001 på cellesyklusprogresjon. Flow-cytometri-analyser indikerte at G2 /M-fase populasjon av de behandlede lungekreftceller, inkludert H1299, A549, CL1-0, og CL1-5, økte doseavhengig måte med 0,5 til 1 uM Ching001 behandling i 6 timer. G2 /M cellesyklus populasjon økes ytterligere dramatisk, ledsaget av utseende av sub-G1 fraksjon ved forlenget Ching001 behandling i 12 timer (fig. 1C). Flowcytometri analyse og spredning analyse av S-fase synkronisert lungekreftceller også bekreftet at Ching001 behandling arrestert cellecyklusprogresjonen på G2 /M-fase derfor hemmet spredning (fig. S2).
For ytterligere å dissekere effekten av Ching001 under G2 /M arrest, ble immunfluorescens for microtubule utført i S-fase synkronisert lungekreft celler behandlet av Ching001 (fig. 1 D). DMSO-behandlede celler begynte å skrive inn pro-metafase etter 2 timer og kommet til anaphase på fire timer etter løslatelse fra S-fasen. Cellene satte å telophase på 6 timer og nådde sent cytokinese å full mitose på 8 timer. Men Ching001-behandlede celler inngått M-fase på 2 timer og forble i metafase, selv ved 8 h (Fig. 1D).
Å gi molekylære bevis for M-fase arrest, utførte vi western blot analyser av nøkkel proteiner som regulerer celle mitose inkludert aurora B, survivin og fosforylerte mitotisk protein monoklonale 2 epitoper (p-MPM2) [17] – [19]. Resultatene viste at aurora B, Survivin og p-MPM2 forble høy etter Ching001 behandling sammenlignet med DMSO kontroll, noe som indikerer M-fase arrest (fig. 2A). I tillegg immunocytochemistry farging viste at ca 15% av DMSO-behandlede celler var i M-fase ved deres ekspresjon av både aurora B og Survivin, mens Ching001 behandling signifikant økt M-fase cellepopulasjonen som co-uttrykte aurora B og Survivin (fig. 2B). Sammen viser disse resultater viste at Ching001 arresterer celle-syklusprogresjon i M-fasen.
(A) Western blot analyser av mitose-relaterte proteiner etter 1 uM Ching001 behandling for angitte tider i lungecancercellelinjer. (B) feilregulering av M-fase cellesyklus indusert av Ching001. Lungekreft cellelinjer ble analysert med survivin (grønn), aurora B (rød), og DAPI (blå) etter en mikrometer Ching001 behandling i 24 timer. DMSO ble anvendt som oppløsningsmiddel kontroll. Skala barer: 30 mikrometer
Ching001-indusert mitotisk stopp fører til DNA-skader og apoptose av lungekreft celler
Det hadde blitt rapportert at feil i mitose generere skader og fragmentering av. DNA [20]. Vår Western blot-analyser viste at økning av DNA-skade markør γ-H2AX i kreftceller etter Ching001 behandling (Fig. 3A), som ble bekreftet ved immunofluorescens for γ-H2AX (fig. S3). For ytterligere å undersøke hvorvidt DNA-skade indusert av Ching001 behandling til slutt resulterer i apoptose, ble PS trans påvist ved immunfluorescens etter Ching001 behandling (Fig. 3B). I tillegg ble apoptose-indusert DNA-stige-målingen ble utført (fig. 3C). En sterk PS trans på 24 timer og induksjon av apoptotiske DNA stiger etter 48 timer i Ching001 behandlet H1299, A549, CL1-0 og CL1-5 celler tyder på at DNA-skader indusert av mitose feil under Ching001 behandling til slutt resulterer i apoptose.
(A) Western blot analyser for DNA-skader markør γ-H2AX etter 1fiM Ching001 behandling på angitte tider. (B) Immunofluorescens for tidlig-apoptotiske markør PS trans etter Ching001 behandling i 24 timer. Skala barer: 30 mikrometer. (C) Den apoptotiske-spesifikke DNA-fragmentering ble påvist ved DNA-stige-analyser etter Ching001 behandling i 48 timer.
Ching001 induserer pro-apoptotiske ER stress signalveien
Spesielt aktiviteten av eR stress indusert caspase-4 ble økt i en tidsavhengig måte i H1299 og A549 lunge kreft cellelinjer etter Ching001 behandling (fig. 4A). For å undersøke mekanismene for Ching001 behandling på pro-apoptotiske ER stress induksjon, western blot for apoptose regulerer proteiner inkludert ER stress signalveier ble gjennomført. Aktivering av ER stress var tydelig av økt uttrykk av p-PREK, p-eIF2α, p-JNK, GADD153 og caspase-4 etter Ching001 behandling (Fig. 4B). I tillegg vil redusert Ching001 behandling ekspresjon av anti-apoptotiske faktor Bcl-2 og økt ekspresjon av pro-apoptotiske faktor Bax, som fører til apoptose via spalting av apoptose skarp caspase-3 (fig. 4A). Disse resultatene indikerte at Ching001 indusert apoptose, i det minste delvis, via ER stress signalveien.
(A) caspase-4-aktivitet økte tidsavhengig etter 1 uM Ching001 behandling i både A549 og H1299 lungekreft celle linjer på angitte tidspunkter. **:
P
0,01, ***:
P
0,001. (B) Western blot analyser av ER stress relatert signaliserer proteiner (blotter over dot linjen) og apoptose relaterte signaliserer proteiner (blotter under dot linjen) etter Ching001 behandling ved de angitte tider.
Ching001 utstillinger
i
vivo
xenotransplantat vekst hemming av Mitosis og apoptose uten induksjon av apoptose i omkringliggende vev av xenotransplantat
tumor xenograft analysen ble utført for å teste tumorvekstinhibitering evne Ching001
i
vivo
. Intraperitoneal injeksjon av 0,4 mg /kg Ching001 til fem ganger i løpet av den innledende behandlingen viste tumorvekstinhibitering virkning, som var tilsvarende 4 mg /kg behandling med paclitaxel, en kjent mikrotubuli-inhibitor (fig. 5A, venstre panel). Den tumorveksthastigheten ble ytterligere inhibert ved behandling med 2 mg /kg Ching001. Ingen signifikant vekttap i behandlede dyr i forhold til å styre gruppen ble funnet (Fig. 5A, panel til høyre).
(A) ICR-naken mus med de etablerte A549 tumorer (-50 mm
3) ble behandlet med Ching001 (0,4 mg /kg eller 2 mg /kg) via intraperitoneal injeksjon på day1, day3, day5, day7, og day9 (som indikert av pil hoder). En kjent mikrotubulus-inhibitor, paclitaxel (4 mg /kg), ble anvendt for sammenligning. Tumorvolum (til venstre) og kroppsvekt (til høyre) ble målt på annenhver dag til day35. Poeng, mener; barer, ± SEM. *:
P
0,05, **:
P
0,01, ***:
P
0,001. (B) Den aktiverte caspase-3 IHC-farging av tumorvevet av ICR-nakne mus som tas fra oppløsningsmiddel kontrollgruppe og Ching001 behandling (2 mg /kg) gruppe. Original forstørrelse × 200. (C) Et vev av immunfluorescens Survivin (grønn), aurora B (rød), og DAPI (blå) av tumor xenograft fra løsningsmiddel-kontrollmusene og Ching001 behandlede mus (2 mg /kg). Pilene angitte mitotiske celler i løsemiddel kontroll svulst. Den forstørrede figuren representerer avvik kromosomer etter Ching001 behandling. Skala barer:. 30 mikrometer
For å undersøke om Ching001 indusert tumor apoptose
i
vivo
ble immunhistokjemi (IHC) farging av aktivert caspase-3 utført. Vi har funnet en økt ekspresjon av aktivert kaspase-3 i tumorxenografter fra Ching001 behandlede gruppen sammenlignet med oppløsningsmiddel-behandlede gruppe (Fig. 5B). I tillegg Ching001 behandlede tumorceller synes å ha krympet i kjernen og boblet i utseende, som representerer apoptotisk celledød i xenograft nodul (fig. S4A), mens ingen histologiske eller apoptotisk fenotype ble observert i omkringliggende friskt vev av xenograft (fig. S4B ). For å undersøke om Ching001 indusert mitose arrest
i
vivo
, vev immunfluorescens av survivin og aurora B ble utført. Resultatene viste en økning på cellepopulasjon som co-uttrykt survivin og aurora B i Ching001 behandlet svulstvev sammenlignet med løsemiddel behandlet vev (Fig. 5C). Viktigere var avvikende kromosom konfigurasjon observert i Ching001 behandlet xenograft (forstørret innfelt i Fig. 5C). Disse
i
vivo
resultater bekrefte med
i
vitro
data som Ching001 induserer mitose arrest, kromosomskade, og apoptose.
Ching001 hemmer kreft Colonization Evne
i
vivo
uten å påvirke normale Vital Funksjon
For å verifisere
i
vivo
kolonisering hemming potensialet i Ching001, ble eksperimentelle metastase dyrestudier utført. A549 lungekreftceller ble injisert intravenøst inn i halevenen til-mus. Musene mottok 0,2 mg /kg Ching001, en tiendedel av den anvendte dose for antitumorvekst dyrestudier, intraperitonealt hver annen dag fra dag 1 til dag 35. DMSO tjente som oppløsningsmiddel kontroll og 0,2 mg /kg paclitaxel ble inkludert som en positiv kontroll. I tillegg ble A549-celler forbehandlet med 1 uM Ching001 før haleveneinjeksjon også utført. Haematoxylin og eosin (H E) flekker viste signifikant færre tumornoduler i lungene av mus behandlet intraperitonealt med Ching001 eller paclitaxel sammenlignet med DMSO løsemiddel kontroll. Tumornoduler ble sjelden funnet i lunge vev fra mus intravenøst injisert med Ching001 pre-behandlede kreftceller (Fig. 6A, venstre panel). Gjennomsnittlig antall svulst nodule i lungene var 88, 29, 18 og 2 i DMSO, 0,2 mg /kg paclitaxel behandling, 0,2 mg /kg Ching001 behandling, og Ching001 pre-behandlingsgruppene, henholdsvis (Fig. 6A, øvre høyre panel ). Det var ingen signifikant tap i kroppsvekt i alle behandlede dyr (fig. 6A, panel nederst til høyre). All biokjemi analyse av blodprøver fra testede dyr viste ingen åpenbare negative effekter på lever og nyre funksjoner sammenlignet med løsemiddel kontroll (Fig. 6B). I tillegg, H E-farging av lungevev (til venstre), kvantifisering av tumor knuter i lungene (øverst til høyre), og kroppsvekt (nederst til høyre) av A549 injisert mus vises. De røde pilene angitte områder av tumorknuter i lungevevet. Original forstørrelse × 100. *:
P
0,05. (B) De hematologiske og biokjemiske tester av blod fra mus som ble testet. I hematologi testene, ble WBC, RBC, og blodplater testet. I biokjemi tester, GOT, GPT, albumin og total-bilirubin brukes som indikatorer på leverfunksjonen; BUN og kreatinin som indikatorer på nyrefunksjon. Dataene viste at Ching001 behandling forårsaket ingen tydelig endring på lever- og nyrefunksjoner i forhold til DMSO-behandlede dyr.
Diskusjoner
For å utvikle anti-kreft narkotika med bedre effekt og begrensede side -effects, designet vi en helsyntetisk sammensatte Ching001 og undersøkt sin anti-tumor aktivitet
i
vitro Hotell og
i
vivo
i lungekreft modell . Ching001 viste spesifikke cytotoksisitet mot ulike menneskelige lungekreft cellelinjer ved doser i sub-mikromolområde med ingen åpen cytotoksisitet mot normal menneskelig lungecellelinje. Dyrestudier har vist at Ching001 hemmet tumorvekst og kolonisering
i
vivo
uten betydelige bivirkninger hos testet mus. Den molekylære rolle Ching001 på tumorvekst-inhibering er mediert, i det minste delvis, av mikrotubuli-de-polymerisasjon som fører til mitose rest og DNA-skade. Disse hendelsene sammen med ER stress induksjon, til slutt førte til apoptose av lungekreft celler
i
vitro Hotell og
i
vivo plakater (Fig. 7 ).
Rapid cellecyklusprogresjonen er en av funksjonene i det prolifererte kreftcelle. Inhibering av mikrotubuli-polymerisering av Ching001 arresterer M-fase cellesyklusprogresjon og fører til DNA-skade. I tillegg Ching001 behandling utløst aktivering av ER stress signalveien gjennom aktivering av PERK og caspase-4 signalering kaskade. Langvarig M-fase arrest og aktivert ER stress signaliserer deretter indusere apoptose i kreftcellen behandles med Ching001.
Vår western blot analyser oppdaget en vedvarende uttrykk for p-MPM2 representerer inngangen til M-fase cellesyklus [18], [19], noe som indikerer at Ching001 behandlede celler gått ut fra G2 og innledes til M fase. I tillegg aurora B og survivin styre ordningen og separering av kromosom under mitose. Nedbrytning av aurora B og Survivin ved M-fase letter enden av mitose [17]. Vi observerte en økt co-uttrykk for aurora B og survivin i begge celle og dyreprøver, noe som tyder på at Ching001 hemmer exit fra M-fase. Vår α-tubulin immunfluorescens av S-fase synkroniserte celler viste en cellesyklus arrest i metafase. Alle sammen, våre resultater støtter hypotesen om at Ching001 arresterer cellesyklus ved M-fase, som kan være på grunn av hemming av mikrotubuli-polymerisering, og avbrytelse av spindelen mikrotubuli organisasjon. Forlenge M-fase arrest i cellene resulterer i svikt i kromosom segregering og påfølgende død av mitose [21]. Vår nåværende cellulære og dyre resultater dokumentere at Ching001 behandling induserer M-fase arrest fulgt av DNA-skade og apoptotisk celledød.
Svikt i atom migrasjon og divisjon kan forstyrre homeostase av ER [22]. ER transmembran-sensorer som er kjent som PERK og IRE1α vil da bli aktivert ved fosforylering som deretter aktiverer caspase-4 [23]. Ching001 behandling økt uttrykk av ER stress markører og apoptose markører på 6-12 timer. Disse resultatene antydet at Ching001-indusert kreft celle apoptose kan være forårsaket samtidig via induksjon av mitose feil og ER stress aktivering på tidlige tidspunkter. I tillegg ble det observert noen åpenbar aktivering av indre apoptose signale protein caspase-9 og ytre apoptose signaliserer protein caspase-8 etter Ching001 behandling (data ikke vist), noe som tyder på at Ching001 indusert kreft celle apoptose er via ER stress. Demping av ER-mediert apoptose indusert av Ching001 i ER sensorer slått ned celler er verdig til videre undersøkelser
podophyllotoxin er det naturlig produkt analog Ching001 [5] -. [7]. Podofyllotoksin avledede forbindelser som brukes i klinisk behandling kreft viser ofte motstand på grunn av avvikende ekspresjon og mutasjon av spesifikke p-tubulin-isotyper i løpet av behandlingen [24]. I tillegg har paclitaxel motstand også blitt rapportert å korrelere med økt ekspresjon av p-glykoproteiner [25], [26]. Det er verdt å nevne at Ching001 behandling viste en lignende cytotoksisk effekt på forskjellige lungecancerceller som uttrykker forskjellige nivåer av P-glykoproteiner (fig. 1B og S6 fig.). I tillegg Ching001 behandling viste en sterk cytotoksisk aktivitet mot en etoposid-resistente humane epidermale kreftcellelinje (Fig. S7). Enten Ching001 er et potent forbindelse for behandling av taxanes- eller etoposid-resistente celler garanterer videre studier.
Som konklusjon oppviser Ching001 antitumorvekst og inhibering kolonisering virkning uten bivirkninger hos våre prekliniske tester. Disse resultatene markere det terapeutiske potensialet i Ching001 i kreftbehandling. Syntetisk Ching001 forbindelse med høy renhet og avkastning med kreft celle-spesifikke cytotoksisitet er en potensiell kandidat til å bli testet som en ledende farmasøytiske virkestoff for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrene ble hentet fra National Laboratory Animal senter (Kina, Taiwan) med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), National Cheng Kung University (IACUC godkjenning nr 98099), og ble opprettholdt i patogen frie forhold. Studien godkjenning av gjennomgangen styret institusjon og etikkutvalg ble bekreftet av National Cheng Kung University.
Cell Line, cellekultur, og synkronisering
Normal human epitelial celle lunge MRC5 og human lunge adenokarsinom celle linjer CL1-0, og CL1-5 ble oppnådd fra Dr. PC Yang (Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, Taiwan) [27]. De menneskelige ikke-småcellet lungekreft cellelinjer H1299 og A549 ble oppnådd fra American Type Cell Culture. De menneskelige epidermal kreftcellelinjer KB og KB-7D celler ble gitt av Dr. Jang-Yang Chang fra National Health Research Institute, Tainan, Taiwan. KB-cellelinjen ble opprinnelig kjøpt fra American Type Cell Culture og KB-7D er et etoposid-resistente cellelinje avledet fra KB-cellelinjen [28]. Alle celler ble dyrket i DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) med 10% FBS (Gibco) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco) og ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktig atmosfære. For å synkronisere cellene ved S-fase ble cellene behandlet med 2 mg /ml aphidicholin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 24 timer og sluppet inn i cellesyklusen før Ching001 behandling.
Forbindelser brukt
podophyllotoxin derivat, Ching001, ble utarbeidet av medforfatter W.-S. Li. Forespørsel om forbindelsen skal sendes [email protected].
Cvtotoksisitetsmålinq
Cells (3 × 10
4) ble sådd på 6-brønners kulturskåler og forskjellige konsentrasjoner av Ching001 (0,5, 1, 3, 5 uM) ble tilsatt til hver brønn i 48 timer. Celle nummer og levedyktighet ble bestemt ved trypan blå flekker og celletelling.
microtubule Assembly analysen
microtubule montering analysen ble utført i henhold til tidligere studie [29]. -Celler (1 x 10
6) ble sådd ut på 100 mm kulturskåler og behandlet med 1 pM Ching001 eller DMSO kontroll i 6 til 48 timer. Supernatantfraksjonen av totale cellelysater ble oppsamlet som løselige αβ-tubulin dimerer og kvantifisert ved hjelp av Bradford-analysen. Pelleten ble oppsamlet som uløselig protein inneholdende polymeriserte mikrotubuli som ble kokt med proteinprøvebuffer for å oppløse proteiner. Omtrent 50 ug av oppløselige protein lysater ble anvendt som kontroll lasting, og like stort volum av uoppløselige protein lysater ble anvendt for α-tubulin immuno-blotting. Alle antistoffer og deres reaksjons betingelser er listet i tabell S1.
flowcytometrisystemer
CL1-0, CL1-5, A549, og H1299 celler (1 x 10
6) var samlet opp etter 6 til 12 timers behandling med 0,5 uM eller 1 uM Ching001, vasket to ganger med Hanks balanserte saltløsning (Sigma-Aldrich) og -20
oC etanol fiksering over natten. Celler ble inkubert med DNA intercalator propidium jodid (Sigma-Aldrich) ved
° C 37 i 1 time med 1 pg /ml RNase A og 0,1% Triton-X100. Om 3 × 10
4 celler ble oppdaget ved hjelp FACSCalibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) for å analysere cellesyklus distribusjon.
Immunocytochemistry Farging
Cells (1 × 10
4) ble sådd ut i kammers objektglass og behandlet med Ching001 eller DMSO kontroll i 48 timer. De behandlede celler ble hybridisert med α-tubulin-antistoff og DAPI etter fiksering. Antistoffene Survivin og aurora B ble anvendt for mitotiske celle farging. Anti-PS-antistoff ble anvendt for deteksjon av tidlig stadium av apoptose. Cellene ble deretter fotografert under en OLYMPUS FV1000 confocal mikroskop. Detaljerte prosedyrer og antistoffer, er beskrevet i tabell S1.
Western blot-analyse
Prøver inneholdende like mengder protein (50 pg) ble separert på en 10% SDS-PAGE og elektroblottet på Immobilon-P membraner (Millipore). Western blot ble utført for å måle protein ekspresjon nivå. Detaljerte prosedyrer og antistoffer, er beskrevet i tabell S1.
DNA Stige-analysen
celler (1 x 10
6) ble behandlet med DMSO kontroll eller 3 til 5 uM Ching001 i 24 til 48 h, DNA ble ekstrahert ved bruk av DNA-ekstraksjon buffer (0,2 mM fosfat-citrat-buffer, pH 7,8; 37
oC, en h reaksjon), etterfulgt av RNase A og proteinase K-behandling. Agarosegelelektroforese ble brukt til DNA-stige-analyser.
Caspase-4 Activity Assay
Caspase-4-aktivitetsanalyse ble utført ved kaspase-4-aktivitet analysesett (GeneTex, Irvine, CA). I korte trekk, omtrent 200 pg av det totale cellelysater med DMSO kontroll eller Ching001 behandling i 6 til 48 timer ble anvendt for analysen. Aktiviteten av caspase-4 ble bestemt ved spalting av LEVD-AFC substrat og påvist ved ELISA-leser (Ex /Em: 400/505).
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
mRNA uttrykk av p-glykoprotein familie gener
ABCB1 Hotell og
ABCG2
ble oppdaget av QRT-PCR i både normale og kreft lungecellelinjer. Total RNA ble ekstrahert fra forskjellige humane lungecellelinjer under anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Om fire mikrogram av RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av Super revers transkriptase (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR ble utført for å påvise mRNA uttrykk nivået av målgener ved hjelp av StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California) med
GAPDH
som intern kontroll. De primere for
ABCB1
er: følelse 5′-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 «, anti 5′-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3»; for
ABCG2
: følelse 5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 «, anti 5′-GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3»; for
GAPDH
: følelse 5’GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 «, anti 5’TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3». CDNA-prøvene ble amplifisert ved hjelp av SYBR grønn (Applied Biosystems) og den termiske sykluser tilstand bestående av 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 45 sykluser ved 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sek. Syklus terskel (Ct), ble fraksjonert syklus nummer ved hvilken mengden av amplifisert mål nådd en fast terskel bestemt. De normaliserte prosenter av målgener ble beregnet ved hjelp ΔCt [ΔCt = Ct
-target gen – Ct
-GAPDH]. Data ble presentert som fold forskjeller i forhold til IMR90 normal lungecelle gener uttrykk basert på beregninger av 2
-ΔΔCt. (ΔΔCt = ΔCt
-lung cellelinje – ΔCt
-IMR90)
MTT Cytotoksisitet Analyse
Forskjellige konsentrasjoner av Ching001 ble tilsatt til hver plate og inkubert i 48 timer. Celle viabilities under forskjellige konsentrasjoner av forbindelsen behandling ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma, St. Louis, MO) assay. I den ubehandlede kontroll, ble 0,1% DMSO-holdig medium anvendes.
in vivo
Tumor Xenograft Formation Assay
ICR-Foxn1 nakne mus (5 uker gamle) ble ervervet fra National Laboratory Animal Center med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), National Cheng Kung University (IACUC godkjenning nr 98099), og oppvokst i en bestemt patogen fritt miljø. A549 celler (5 × 10
6) ble injisert subkutant som xenograft i mus og lov til å vokse opp til 50 mm
3 svulst nodule innen 2 uker. Musene ble deretter injisert intraperitonealt med 0,4 mg /kg, eller 2 mg /kg Ching001, eller 4 mg /kg paclitaxel som positiv kontroll, eller løsningsmiddelkontroll (etanol: cremophore: DDH
2o = 02:01:07) ved dag 1, 3, 5, 7, 9. volumet av xenograft og vekten av musene ble målt og kvantifisert i løpet av 35 dager med behandling. Den xenograft volum ble beregnet som (lengde x bredde firkant) /2 mm
3. Store organer, inkludert hjerte, lunge, lever, nyre, og xenograft nodule ble dissekert og farget med H . E for ytterligere bekreftelse
In vivo
Experimental Metastase analysen
BALB /c mus ble kjøpt og oppvokst etter å skaffe passende Institutional Review board tillatelse som beskrevet ovenfor. A549 (1 x 10
6) celler ble injisert intravenøst inn i halevenen til BALB /c-mus, som så ble intraperitonealt gitt DMSO kontroll, 0,2 mg /kg Ching001 eller 0,2 mg /kg paclitaxel hver annen dag for fem uker .
