Abstract
Klebe metastasizing prostata carcinoma celler ble kvantifisert for to karsinom modell cellelinjer LNCaP (lymfeknute-spesifikke) og PC3 (benmargsspesifikke). Ved time-lapse mikroskopi og kraft spektroskopi vi fant PC3 celler til fortrinnsvis følge benmargavledede mesenchymale stamceller (SCP1 cellelinje). Ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM) basert kraft spektroskopi, den mekaniske mønster av adhesjonen til SCP1 celler ble karakterisert for både prostatacancercellelinjer og i forhold til et substrat som består av rent kollagen type I. PC3-celler forbrukes mer energi (27,6 aj) i løpet de tvunget de-vedheft AFM eksperimenter og viste betydelig mer lim og sterkere bånd enn LNCaP celler (20,1 AJ). De karakteristiske skriftene til adskillelseskraft sporene viste at, i motsetning til de LNCaP-celler, PC3-celler ser ut til å utnytte sin filopodia i tillegg til å etablere adhesive bindinger. Til sammen viser vår studie klart at PC3 celler har en overlegen lim affinitet til benmarg stamceller, sammenlignet med LNCaP. Semi-kvantitativ PCR på begge prostata carcinom cellelinjer avslørte uttrykk for to Col-I bindende integrin reseptorer, α1β1 og α2β1 i PC3 celler, noe som tyder på deres mulige involvering i den spesifikke interaksjon til underlag. Videre forståelse av de eksakte mekanismene bak dette fenomenet kan føre til optimaliserte terapeutiske programmer rettet mot metastatisk oppførselen til enkelte prostatakreftceller mot benvev
Citation. Sariisik E, Docheva D, Padula D, Popov C, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Sondering samspillet Forces of prostata kreft celler med kollagen I og benmarg stamceller på celle-nivå. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10,1371 /journal.pone.0057706
Redaktør: Daniel J. Muller, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Sveits
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 28 januar 2013; Publisert: 05.03.2013
Copyright: © 2013 Sariisik et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av departementet for nasjonal utdanning av Tyrkia (https://egitek.meb.gov.tr), tysk Excellence Initiative via «nanosystemer Initiative München» (https://www.nano-initiative-munich.de/de/research -areas /) og det tyske forskningsstiftelsen (https://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste kreftformer og en ledende årsak til kreft dødsfall blant menn i Europa. Nesten alle pasienter med avansert prostatakreft viser metastase i bein, som ofte er den eneste påvisbare området av kreft spredning [1]. Videre er prostatakreft i benet ofte diagnostisert før påvisning av primær sykdom og når prostata kreftceller blir innpodet i skjelettet, er det ikke lenger mulig kurativ terapi og palliativ behandling blir den eneste muligheten [2]. Selv om forskere begynner nå å forstå mekanismene for kreft vekst i bein, er den første delen av tumorcelle-til-bein interaksjoner som fremmer utbygging av metastatisk innskudd ennå ikke fullt ut forstått. Det er derfor klart et behov for å belyse de faktorer som ligger til grunn for spredning av prostatakreft særlig til skjelettet.
Det er blitt foreslått at kreften metastaser i ben er resultatet av et komplekst samspill mellom prostatakreftceller med den benmatriksproteiner og med celletypene som er bosatt i benvevet som osteoblaster og osteoklaster [3] – [5]. Vi og andre har vist at den prostatakreft-cellelinjen PC3, isolert fra benmarg, har en betydelig høyere adhesjon til store ben proteinet kollagen type I (Kol-I) enn prostata adenocarcinom-cellelinjen LNCaP som er avledet fra et ikke- bein metastatisk stedet [6], [7]. Disse resultatene tyder på at affinitet Col-I kan være en av de molekylære faktorer som bidrar til utviklingen av noen prostatakreftceller inn i benet.
Med hensyn til de cellulære faktorer, bortsett fra osteoblaster og osteoklaster, en annen interessant deltaker som har nylig blitt rapportert er cellen befolkningen bosatt i benmargen, kalles stamceller (MSC). MSC er de tidlige progenitorceller av osteoblaster, og de kan utvides ytterligere og differensiert i spesialiserte mesenchymale celler, for eksempel adipocytter, kondrocytter eller osteoblaster in vitro [8]. Krysse et al., 2007, har foreslått at MSC kan spille en viktig rolle i å støtte prostata kreft vekst og overlevelse i beinet [9].
Fra den første etableringen til senere utvidelse i benet, prostata kreftceller krever invasive evne. Nabha et al., 2008 fant at MSCer stimulerte invasiv evne PC3-celler gjennom Col-I ved å indusere sekresjon av protease MMP-12 fra PC3-celler [10]. I tillegg er en fersk artikkel vist at mesenchymale fibroblaster kan føre kollektive kreft invasjon av ombygging deres omkringliggende matrise, og dermed skape fysisk plass der kreftcellene kan bare følge [11].
Disse dataene allerede foreslå konkrete krysstale mellom prostatakreftceller og MSC, men fortsatt er det ikke klart om og hvor sterk disse to celletyper kan samhandle og hva kan være mekanismene bak dette samspillet. Spesifikke molekyler på celleoverflaten kan mediere cellulære interaksjoner. Slike molekylære interaksjoner har blitt målt mekanisk ved å spore kraften som kreves for å skille reseptor-ligand par eller i samspill celler med optiske pinsetter, den biomembranen kraft sonde eller atomic force mikroskopi [12] – [14]. Slike eksperimenter er ikke bare i stand til å måle molekyladskillelsesarrangementer, men også for å undersøke den mekaniske koblingen og forankring av de målte molekyler i celler [15] – [17]. Dermed Hovedformålet med denne studien var å få ny innsikt i prostata kreft celle interaksjoner med MSC med vekt på de mekaniske kreftene som oppstår på molekylært nivå. Spesielt kvantifisering av de klebende krefter mellom prostatakreftceller og matrisen protein Col-I viste seg å være avgjørende, fordi tidligere studier som undersøker affiniteten av prostatacancerceller til forskjellige matriksproteiner ikke fastslå deres interaksjon kraft.
prostatakreftceller, anvendte vi PC3-celler, som har sin opprinnelse fra benmargsmetastase og som kontroller, LNCaP-celler, som var isolert fra lymfeknutemetastase. Som stamceller vi brukte en udødelig MSC cellelinje kalt SCP1 [18], som besitter de typiske MSC funksjoner, for eksempel selvfornyelse og multipotency og gir rom for langsiktig standardisert analyse. Vi først visualisert vedheft og forplantning frekvensen av prostata kreft celler på MSC monolag av tid forfalle fluorescens mikroskopi på flercellede nivå. Deretter, karakterisert vi de faktiske fysiske kreftene som er involvert i én celle-til-substrat-kontakter ved mikroskopi med en AFM: begge prostatakreftcellelinjer ble immobilisert på en AFM cantilever og bringes i kontakt med en Col-I-belagte substrat. Endelig har vi målt celle-til-celle klebende krefter mellom PC3 eller LNCaP prostatakreftceller, festet til en AFM cantilever og mesenchymale stamceller (SCP1) enkeltlag.
Materialer og metoder
Cell Culture for Time-lapse mikros
PC3 (avledet fra beinmetastase) og LNCaP celler (avledet fra lymfeknutemetastase) ble oppnådd fra ATCC (Wesel, Tyskland). PC3-celler ble holdt i RPMI-1640 cellekulturmedia (PAA, Cölbe, Tyskland) og 10% FBS (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland). Den SCP1 cellelinje er en immortalisert human mesenchymale stamceller linje fullstendig beskrevet i Böker et al. 2008 [18]. LnCap og SCP1 celler ble dyrket i MEM alfa Glutamax kulturmedium (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) supplert med 10% FBS. Under rutinecellekultur, ble alle celletyper vokst opp til 80% konfluens i T-25 eller T-75 kulturflasker og holdt ved 37 ° C i 5% fuktet CO
2. Dyrkningsmediet ble endret tre ganger pr uke og for celleaging, ble cellene løsnet ved behandling med 1 x trypsin /EDTA-løsning (PAA). Utarbeidelse av cellene før AFM målingene er beskrevet nedenfor i avsnittet «Cell capture».
Time-lapse mikroskopi og Kvantifisering av celle adhesjon
SCP1 celler (10
6 celler ) ble dyrket i 6-brønners skåler til fullstendig konfluens (som vist i fig. 1C). PC3 og LNCaP-celler ble merket med 10 pM grønne fluorescerende fargestoff cfda (karboksyfluorescein-diacetat, acetoksymetylester, Invitrogen) og deretter plettert på de dannede SCP1 monolagene (5 x 10
5 kreft celler /brønn). Rett etter ble mikroskopi bilder samlet med 25 minutters intervaller i minst 12 timer. I løpet av denne tiden ble cellene holdt i et bio-kammer, som gir stabil 37 ° C og 5% CO2 fuktet atmosfære (Pecon, Erbach, Germnay), som er montert på en invertert optisk mikroskop (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Tyskland). Bildene ble tatt med en AxioCam MRM CCD-kamera (Carl Zeiss) og ved å bruke manuelt celleteller verktøy for bilde J version1.40 programvare (National Institute of Health, USA) antall heftende celler ble beregnet og vist som prosent til opprinnelige cellen innspill på 4 og 12 timer.
(A) Phase kontrast og fluorescerende mikroskopi av CFDA-merket PC3 og LNCaP celler belagt på SCP1 monolag i seks-brønns retter. Bildene blir tatt etter 4 timer. (B) Kvantifisering av heft PC3 og LNCaP celler etter 4 og 12 timer dyrking på SCP1 monolag. Prosentandelen av adherente celler ble kvantifisert først, ved manuell telling av de cfda-merkede celler med celleteller verktøy i bilde J programvare og andre, ved å sammenligne den opprinnelige antall belagte celler (5 x 10
5-celler /brønn ). I bildene også en svak bakgrunn av CFDA fargepartikler er synlig (mer tydelig i LNCaP bildet). Analysene viste at allerede ved 4 h PC3-celler fullstendig klebet på SPC1 celler, mens LNCaP-celler hadde en signifikant lavere adhesjon hastighet på 4 timer og 12 timer. Grafen Søylene viser gjennomsnitt ± SD av fire uavhengige forsøk (p 0,0001, uparet t-test). (C) PC og LNCaP celler (2 × 10
5 celler /brønn) ble dyrket på SCP1 monolag i seks-brønns retter i opptil åtte dager. Fase kontrast viste dannelse og utbredelse av PC3 kolonier (skissert) på toppen av SCP1 celler mellom dag 1 og 8. I kontrast, LNCaP celler dannet små celleklynger (piler) som ikke utvide, men heller tilbakedannede etter dag 8. (D) Kvantifisering av PC og LNCaP celle tall etter 1, 5 og 8 dager med dyrking på SCP1 monolag. Spredning av PC3 og LNCaP celler ble beregnet ved å trekke SCP1 kontrollmonolagene fra den totale celletall av co-kulturen. Tilsvarende til de mikroskopi av data, bekreftet de kvantitative analysen at PC3-celler, men ikke LNCaP var i stand til å dele seg og ytterligere ekspandere på SCP1 celler. Grafen viser gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige eksperimenter for hvert tidspunkt (p 0,0001, uparet t-test).
Cell Proliferation analyse
SCP1 monolagene ble dannet som beskrevet ovenfor og 2 x 10
5 PC3 og LNCaP-celler ble tilsatt og igjen å ekspandere inn SPC1 celler i en periode på 8 dager. I tillegg ble flere kulturbrønner beholdt bare med SCP1 celler (
SCP1
mono
) for å bli brukt som kontroller for kvantifisering analyse. Co-kulturer (
PC3
+ SCP1, LNCaP
+ SCP1
) ble overvåket mikroskopisk og fotografert med AxioCam MRM kamera (Zeiss). På dag 1, 5 og 8 ko-kulturer ble trypsinert og ved hjelp av Neubauer tellekammer celle, ble det totale celleantall estimert. Spredning av PC3 og LNCaP celler på SCP1 enkeltlag (
PC3
på mono
,
LNCaP
på mono
) ble beregnet som følger:
Immunocytochemistry
Før protein belegg, glass ble renset med 70% etanol og deretter autoklaveres. For å verifisere kollagen type I (Col-I) -coating av glassplater og kollagen jeg uttrykket på SCP1, ble lysbilder og SCP1 monolag stilles som følger. SCP1 celler ble dyrket på objektglass i to dager for å danne sammenflytende cellemonolag, mens Col-I – belagte glassplater ble fremstilt ved å tilsette 1 mg /ml Col-I-løsning ved 4 ° C over natten. Deretter ble SCP1 monolag og Col-I-belagte objektglass fiksert med ren aceton i 20 minutter ved -20 ° C, renset med PBS. Bilde-iT FX signalforsterker (Invitrogen et produkt for bakgrunnsreduksjon og signal intensivering av Alexa mel sekundære antistoffer) ble påført i 30 minutter og blokkert med 10% BSA i 1 time. Den primære mus monoklonalt anti-kollagen-I-antistoff (Sigma) ble påført over natten ved 4 ° C. Dette trinn ble etterfulgt av inkubasjon med det sekundære anti-mus-antistoff konjugert med Alexa 488 Flour i 1 time og atom flekken DAPI i 5 minutter. Parallelt ble det negative kontroller utført ved å utelate det primære antistoff. Photomicrographs ble tatt med en Axiocam MRM kamera på en Axioskope 2 mikroskop (Carl Zeiss) med 40x objektiv.
AFM Setup
Force spektroskopi eksperimenter ble utført ved bruk av en NanoWizard II sammen med en CellHesion modul ( JPK instuments, Berlin, Tyskland), montert på en Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland) med en spesiallaget temperaturenhet for 37 ° C. For redusert påvirkning av støy fra omgivelsene, ble Axiovert plassert på en aktiv isolasjon tabell (Micro 60, Halcyonics, Gottingen, Tyskland) mot vibrasjoner og hele oppsettet ble plassert i en en m
3 lydtett boks også å stabilisere temperaturen i hele forsøket.
De force sensorer som brukes for kraft spektroskopi var tipless silikonnitrid bom med en nominell våren konstant på 0,01 N /m (Tipless, MLCT-O10, Veeco, USA). Disse kraftsensorer med lav fjærkonstant viste seg å være mest egnet for celle adhesjon målinger. Spesielt tilveiebringer den tipless plane overflate et klebeområde for en enkelt celle. Ved å belegge denne overflate med celleklebemidler, såsom lektiner (e. G. Konkavalin A) eller positivt ladede polymerer (for eksempel polylysin) forskjellige celletyper kan være fast og fast festet til sensor [16], [19], [20]. Prostata kreft celler viste seg å stabilt følge lysin elektro og dessuten holde sin kuleform gjennom hele måleprosessen snarere enn å spre som på Col-jeg lakkerte overflater. Før celleadhesjon spektroskopi eksperimenter, er kraftsensorer derfor ble belagt med poly-D-lysin (PDL, Millipore, USA) i en løsning av 100 ug /ml PDL over natten. PDL ble anvendt i stedet for PLL fordi det er mindre nedbrytbart, og cellene har ikke en tendens til å spre seg. Fjær konstanter av kraftsensorer ble bestemt individuelt av termisk støy metoden [21].
Kraft-avstandskurver ble registrert, mens den piezo reist i en lukket sløyfe opp til 20 um på en tilnærming hastighet på 7 um /s inntil en trigger kraft 100pN ble nådd, og en tilbaketrekking hastighet på 3 mikrometer /s.
Underlags Forberedelser
Vi har brukt kollagen type-i (Col-i) belagte glass dekke slips og SCP1 monolagene som substrater for AFM kraft spektroskopi eksperimenter innenfor samme kultur fatet lokk. For å danne SCP1 monolag ble SCP1 celler dyrket på ubehandlede kultur oppvask lokk (petriskål 35 × 10 mm, Nunc A /S, Roskilde, Danmark) for to dager ved 37 ° C, 5% CO
2. Før bruk, ble de vasket med og dekket med 1,5 ml friskt serum-fritt MEM-Alpha medium (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) supplert med 15 mM Hepes (Sigma-Aldrich, Tyskland) som resulterer i en CO
2 uavhengig måling medium. For celle Col-I-målinger av glass dekkglass (Ø 15 mm vasket i 70% etanol og destillert vann) ble belagt med Col-I (100 ug /ml) ved 4 ° C over natten. Forut for celle adhesjon målingene ble Col-I-belagte dekkglass plassert på toppen av den SCP1 monolag i dyrkningsskålen lokkene (som vist på fig. 2B). En ekstra glass dekkglass belagt med BSA (0,5% vekt /volum) ved 4 ° C over natten ble plassert på toppen av en annen del av SCP1 monolaget, og den ble brukt for celle fangst (se neste avsnitt). Dyrkningsskålen lokk, som inneholdt alle tre typer substrater (BSA, Col-I og SCP-en monolayer) ble deretter montert på en temperaturkontrollert trinn i AFM og det var igjen til likevekt i 10 minutter i omgivende luft ved 37 ° C.
(A) Phase kontrast av en prostata kreft celle festet til cantilever (piler) over en SCP1 enkeltlag (til venstre) og en Col-i-belagt lysbilde (til høyre). Skalaen Linjene indikerer 10 mikrometer. På nedre venstre hjørne immunofluorescence bilder er satt inn. Col-I, merket med AlexaFluor488 fluorescens fargestoff vises i grønt og cellekjerner, farget med DAPI i blått. (B) Enkeltceller fra to forskjellige prostatacancercellelinjer (PC3 og LNCaP) ble immobilisert til en tipless AFM cantilever (kraft-sensor) for å studere deres interaksjon seg sammen med den apikale overflate av et SCP-en monolaget (som representerer stamceller ) eller med Col-I (som representerer benmatriks). (C) Skjematisk grunnriss av kulturskålen lokk med en BSA-belagte glass dekkglass (som substrat for å fiske en forsiktig injisert prostatakreft celle) og et Col-I-belagte glass dekkglass både på toppen av et monolag av stamceller . For kalibrering og fiske en celle, besøker kraft-sensor BSA lysbilde, for forsøket på kollagen Col-I skyv og for forsøket på mesenkymalceller den SCP1 monolaget.
Cell Culture and Cell Capture for Force spektroskopi
celler (LNCAP eller PC3) dyrket til 80% konfluens ble inkubert i trypsin /EDTA-løsning (0,02%) i 5 min til 10 min inntil frigjort fra substratet etter vasking med PBS som mangler kalsium og magnesium . Denne prosedyren skal fjerne eventuelle matrix proteiner muligens dekker celleoverflater uten å påvirke de integrin reseptorer [22], [23]. Deretter ble cellene overført til ytterligere MEM-Alpha medium inn i et sentrifugerør. Cellene ble så sentrifugert ned (1000 rpm, 3 min) før resuspendering av pelleten med friskt MEM-alfa-medium. Cellene ble stående i en inkubator ved 37 ° C i 15 min., For å tilpasse dem til måletemperatur på 37 ° C i AFM.
Enten PC3 eller LNCaP-celler (ca. 2 μ
l
inneholdende 100 til 300 celler) ble deretter forsiktig injisert på den ikke-klebende BSA-belagte dekkglass, for deretter å fange en av dem med klebemidlet PDL-belagte cantilever: klebe~~POS=TRUNC cantilever ble plassert over en av de åpenbart friske celler (middels store, runde formet ved normal kontrast, noe blebs, ingen andre unormale indikasjoner i form) på BSA-belagte dekkglass, og senkes på en trinnvis måte inntil det var nær overflaten av denne celle. Deretter var det cantilever forsiktig i holdt kontakt med cellen i noen sekunder før den cantilever-bundet celle ble løftet vertikalt med ca 100 mikrometer [24]. Cellen ble tillatt å etablere fast adhesjon på cantilever for et par minutter. Noen celler (ca. 10%) nektet å følge fast til hendelen heller hengende løst som bestemmes ved forsiktig risting mikroskop og se cellen farten med den induserte agitasjon. I dette tilfelle ble cellen vasket av braket ved å løfte den ut av væsken og tilbake igjen for å fange opp en ny celle. I tilfelle av firmaet vedheft, ble cellen som brukes for vedheft eksperimenter og overvåkes av eksperimentator via lysmikroskop bildet under hele perioden av målinger.
celle adhesjon Force Målinger
Celle immobilisert på kraft-sensor ble skjøvet mot enten SCP1 mono eller Col-i-belagt lysbilde med en kontaktkraft på 100 PN. Kontakttiden mellom sonden cellen og dens substrat ble satt til 0s resulterer i en tvungen kontakt med effektivt 0,3 s for å begrense adhesjon satser (prosentandel av kurver med lim hendelser) til et område så lav som mulig. Adhesjons priser under 30% gir en høy sannsynlighet for å detektere enkle molekylære interaksjoner [24]. Ved høyere vedheft priser individuelle uforpliktende skritt tendens til å resultere fra flere molekylære bindinger som virker parallelt. For å kvantifisere forskjellen mellom cellelinjer og flater, ble denne korte kontakttid og lav kontaktkraft på 100pN anvendt gjennom hele eksperimenter. Tilbaketrekkingshastigheten ble satt til 3 mikrometer /s som et kompromiss mellom hydrodynamisk motstand, som øker med hastigheten (her ved ca. 5 pN) og termisk drift effekter som reduserer med hastighet. Tilbaketrekkings avstanden ble innstilt på 20 um for å gjøre rede for lange stagene (fig. 2A) og for å sikre at cellen hadde skilt fra substratet fullstendig etter hver syklus. Force målinger på SCP1 monolayer og Col-I ble utført innenfor samme kultur fatet, mens det for hver celle immobilisert på en cantilever en ny tallerken var forberedt. Dette resulterte i to eksperimenter pr kulturskål: Enten en LNCaP celle på cantilever vs. Col-I-belagte glass og deretter sammenlignet med den apikale overflate av SCP1 monolag eller et PC3 celle på cantilever vs. Col-I og deretter vs. SCP1 enkeltlag (fig. 2B). Rekkefølgen av substratene ble også reversert i løpet av de PC3 eksperimentene som viser identiske resultater. I hvert forsøk (sondering en type celle til en type av substrat) på minst 80 kraftkurver ble tatt mellom en celle på cantilever og en substrat type. Til sammen minst 10 uavhengige eksperimenter for hver kombinasjon av celle-substrat interaksjoner (LNCaP vs. Col-I, LNCaP vs. SCP1; PC3 vs. Col-I; PC3 vs. SCP1) ble utført, noe som gir minst 800 force kurver per klasse av interaksjon. Under hele forsøket, vi brukte optisk mikroskop for å overvåke sfærisk form og fast feste av cellen immobilisert til den PDL-belagte kraftsensor (fig. 2A). Videre viste vi ved langvarig celle kontakter av 1 min ved 500 pN Col-I at cellen immobilisert til den kraftsensoren kan opprettholde adhesjonskrefter på minst 8,5 nN uten å løsne fra sensoren.
Cell adhesjonskraften evaluering
for dataanalyse bare inntrekkjedenes deler av innflygings-retract sykluser ble evaluert. For å oppnå karakteristiske kvantitativ informasjon fra et spesialdesignet dataevaluering og trinn deteksjon programvare de kraft-avstandskurver, [25] ble brukt til å denoise signalet (sorte linjer i fig. 3), en basislinje (stiplede linjer i fig . 3), riktig for hydrodynamisk motstand og mulig drift og for å trekke følgende parametre:
det laveste datapunkt til venstre markerer kontaktkraft på 100 PN; den hvite stiplede linje representerer grunnlinjen som skjærer den for tilbake kurve ved den svarte sirkelen som avgrenser celleoverflaten; den svarte linjen er de-noised signal og de røde kors indikerer oppdaget de-vedheft trinn der adhesjonskraften evaluering finner sted. (A) Force kurve fra en PC3-celle i samspill med Col-I for å illustrere adhesjonskraften evaluering: Rød pil # 1: trinnhøyde av den første de-adhesjon hendelse i tilbaketrekkings kurve. Den avløsning kraften er absolutt mål fra Røde Kors ned til grunnlinjen; # 2: trinnhøyden av den andre de-adhesjon hendelse etter en kraft platå på 0,9 pm i lengde; # 3: trinn stilling av den første de-adhesjon hendelse; # 4: trinn posisjon av det andre de-adhesjon event. (For definisjoner se celle adhesjon Force Evaluering i Materialer og metoder). Karakteristikker fra hver av de fire forskjellige typer av forsøk er representert: (B) PC3 på Col-I, (C) PC3 på SCP1 monolag, (D) LNCaP på Col-I og (E) LNCaP på SCP1 monolag
trinnhøyden [pN] beskriver forskjellen i kraft målt før og etter en individuell løsgjøring hendelse, synlig som en kraft trinn. Algoritmen identifiserer et slikt skritt ved maksima i den deriverte av denoised signal som overvinne en viss terskel, og markerer det ved en liten rødt kors (se også fig. 3). Det siste trinnet i en kraft kurve er den mest pålitelige ene siden i motsetning til alle andre (mellomprodukt) trinn ingen annen forbindelse mellom celle og substrat vedvarer. Derfor er det siste trinn ikke er potensielt svekket av andre bindinger som finnes i parallell.
adhesjon sats [%] beskriver brøkdel av kurvene med minst en detektert kraft trinn.
antall trinn å beskrive gjennomsnittlig antall skritt oppdaget per kurven (bare telle kurver med minst ett oppdaget kraft trinn).
skritt posisjon [mikrometer] beskriver avstanden mellom kontaktpunktet (svart sirkel i skjæringspunktet mellom baseline og retrace kurve) og en kraft trinn.
arbeidet med avløsning [AJ] beskriver den energien utsvevende i løpet av den kraft eksperiment ved å integrere området mellom grunnlinjen (null kraft) og trekke kurven. (Merk:. Dette har ingen triviell forhold til adhesjonen energi faktisk bidra hastighetsavhengig viskøs og plastisk deformasjon av cellen og cellemembranen seg sterkt til arbeidet til løsgjøring langt fra den termodynamiske likevekt).
løsgjøring kraft [pN] beskriver den høyeste målte adhesjon (globalt maksimum) per kurve.
topp-posisjon [nm] beskriver avstanden mellom kontaktpunktet og hvor den løsgjøring adhesjonskraften ble detektert.
Alle krefter måles er relative krefter og således uavhengig av den konstante kraft forskyvning (av 5PN) på grunn av hydrodynamisk motstand av kraftføleren reiser ved konstant hastighet på 3 um /s.
platå trinn, for dette datasettet vises etter en kraft platå på minst 500 nm lengden på lasterater på mindre enn 2.7pN /s (se trinn 2 i fig. 3A).
på lasterater mellom 2,7 og 4,0 PN /s kriteriet var ikke klar nok til å unngå falsk positiv eller negativ skritt diskriminering.
bratte trapper dermed oppstå etter en økning i kraft på minst 4,0 PN /s.
Semi-kvantitativ Polymerase Chain Reaction (PCR)
Den semi-kvantitative PCR ble utført som beskrevet i Popov et al, 2011 [26]. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra PC3 og LNCaP-celler med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og 1 ug RNA ble anvendt for cDNA-syntese med AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR for integrin α1, α2, β1 og GAPDH (brukt for å normalisere cDNA-inngang) ble utført med Taq DNA-polymerase (Invitrogen) i en MGResearch instrument (Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Primer sekvenser og PCR-forhold er beskrevet i Popov et al, har 2011. All PCR resultatene gjengitt tre ganger uavhengig av hverandre.
Statistical Analysis
For å veie opp for de heterogene datasettene to statistiske analyser ble anvendt:
Først ble en t-test forutsatt ulike variasjoner brukt til å analysere vedheft rate, gjennomsnittlig antall skritt eller brøkdel av tjore-lignende til filopodia-lignende skritt å sammenlikne gjennomsnitt samlet inn fra enkeltceller mellom PC3 og LNCaP celler. Hver gjennomsnittet av en celle er markert som et rødt kors; gjennomsnittet av disse midler er indikert som bar med feil for gjennomsnittet i fig. 4 A B og fig. 5. For det andre, en parametrisk Kolmogorov-Smirnov test uten forutsetninger ble brukt for å sammenligne den trinnhøyde, step posisjon, avløsning kraft og arbeidet med løsrivelse fra alle kraftkurver mellom PC3 og LNCaP celler. Medianer er angitt som barer med kvartiler. Hver median av en celle er representert med et rødt kors i fig. 4 C og D. Resultater med en p-verdi mindre enn 0,05 er merket som viktig med en stjerne.
(A) Prosenter av force kurver med minst en de-adhesjon hendelsen. (B) Antall de-vedheft hendelser i en lim kurve. Feilstolper tilsvarer standard feil av gjennomsnittet. En signifikant p-verdi fra en uparet t-test av PC3 data med hensyn til LNCaP data er markert med * (p 0,05). Gjennomsnittet av hver enkelt celle er gitt ved et rødt kors. (C) Medianer av høyden til den enkelte de-vedheft trinn. (D) Medianer av plasseringen av disse de-vedheft arrangementer. (E) Medianer av avløsning kraft. (F) Medianer av arbeidet til avløsning. Kvartiler er angitt med doble flagg og medianen av hver enkelt celle er gitt ved et rødt kryss. Celle adhesjon force data ble kjøpt fra 16 PC3 eller 10 LNCaP celler i samspill med Col-I (henholdsvis 1485 og 760 tvinge kurver), og 17 PC3 eller 11 LNCaP celler i samspill med SCP1 monolag (1526 og 878 tvinge kurver henholdsvis).
Midler for andelen enkelt de-vedheft trinn som representerer den typiske kraft mønster av filopodia lignende trinn (fast) og tjore lignende trinn (stripete) for to cellelinjer PC3 og LNCaP. Hver gjennomsnittet av en celle er representert med et rødt kryss. Feilstolper tilsvarer standard feil av gjennomsnittet. En betydelig p-verdi fra en t-test mellom de ulike trinnene i en prostata carcinom cellelinje er angitt med * (p 0,05).
Resultater
PC3 og LNCaP Limingen og spredning i Co-kultur med SCP1
Første celle adhesjon ble analysert ved hjelp av time-lapse bildebehandling i opptil 12 timer. Cfda forhåndsmerkede PC3 og LNCaP-celler ble overvåket på en SCP1 monolag, og etter 4 timer, det meste av PC3-celler dukket spres på SCP1 monolaget, mens de LNCaP-celler først på små og runde (fig. 1A). Som vist på fig. S1, PC3-celler dyrket på glass eller Col-I-belagte glass har en nedre flat form faktor i forhold til LNCaP-celler, noe som indikerer en høyere kapasitet til å spre seg. Imidlertid form analyse av begge celletyper dyrket på SCP1 monolag ble ikke utført på grunn av risikoen for unøyaktige målinger av området, diameter og volum på grunn av de underliggende cellelegemer i de SCP1 cellene. Videre, ved å utføre kvantitativ analyse ved 4 og 12 timer, kunne vi viser at ca. 90% av PC3 cellene var i stand til å overholde de SCP1 monolaget allerede etter 4 timer, og at deres adhesjon også holdt seg nær 90% etter 12 timer (Fig. 1B). I kontrast, LNCaP cellene hadde lavere adhesjon til SCP1 (ca. 25%), som ikke økte betydelig etter lengre dyrking tid.
For å undersøke PC3 og LNCaP celleproliferasjon på SCP1 monolag, utførte vi co- kultur eksperimenter for opp til åtte dager. Fasekontrastmikroskopi ved dag 1 og 8 viste dannelse og forplantning av PC3 kolonier på toppen av SCP1cells, mens LNCaP-celler dannes små celleklynger, som ikke utvider seg, men heller i løpet av tilbakedannede (fig. 1C) av denne perioden.
Fig. Fig.
