Abstract
Bakgrunn
Det faktum at reseptorer for TNF-relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) er nesten alltid uttrykt i tykk- og endetarmskreft (CRC) representerer begrunnelsen for ansettelse av TRAIL-reseptorer rettet mot forbindelser for behandling av pasienter som er berørt av denne svulsten. Men første rapportene om bruk av disse bioaktive stoffer gitt skuffende resultater. Vi antok derfor at tap av membranbundet TRAIL-R kan være en funksjon av noen CRC og at evalueringen av membranfarging snarere enn den totale ekspresjon av TRAIL-R kan forutsi responsen til TRAIL-R rettet mot forbindelser i denne tumor .
Sikt og metoder
Derfor vurderte vi immunfluorescens mønster av TRAIL-reseptorer og E-cadherin å vurdere brøkdel av membranbundne TRAIL-reseptorer i 231 utvalgte pasienter med tidlig stadium CRC gjennomgår bare kirurgisk behandling. Videre undersøkte vi om membranfarging for TRAIL-reseptorer samt tilstedeværelse av KRAS-mutasjoner eller mikro ustabilitet (MSI) hadde en effekt på overlevelse og dermed en bedre prognose.
Resultater
som forventet, nesten alle CRC prøver farget positivt for TRAIL-R1 og 2. i stedet membranfarging for disse reseptorene var positiv i bare 71% og 16% av prøvene hhv. Ingen sammenheng mellom KRAS mutasjonsstatus eller MSI-fenotype og prognose kunne påvises. TRAIL-R1 fargeintensitet korrelert med overlevelse i univariat analyse, men bare membran farging av TRAIL-R1 og TRAIL-R2 på cellemembraner var en uavhengig prediktor for overlevelse (cox multivariat analyse: TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12 -3,77]; TRAIL-R2. p = 0,033, RR 3,63 [1,11 til 11,84])
Konklusjoner
i motsetning til dagens forutsetninger, er tap av membranfarging for TRAIL-reseptorer felles for tidlig stadium CRC som erstatter den prognostiske betydningen av sin fargeintensitet. Unnlatelse av å oppnå terapeutiske effekter i nyere kliniske forsøk med TRAIL-reseptorer rettet mot forbindelser kan være på grunn av utilstrekkelig utvalg av pasienter som har svulster med membranbundne TRAIL-reseptorer
Citation. Kriegl L, Jung A, Horst D, Rizzani A, Jackstadt R, Hermeking H, et al. (2012) mikro Ustabilitet, KRAS Mutasjoner og Cellular Fordeling av TRAIL-reseptorer i Early Stage tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (12): e51654. doi: 10,1371 /journal.pone.0051654
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 23 februar 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Kriegl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) med tilskuddet DFG TO 605 /2-1 til EDT og av Else Kröner-Fresenius Stiftung med tilskuddet 2011_A226 til EDT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) er en vanlig kreft sto for over 1 million krefttilfeller over hele verden og som representerer den fjerde tumor-relaterte dødsårsaken. Dessverre, mens helbredende kirurgisk behandling er mulig hos pasienter med svulster i innledende fasen, forblir prognosen for pasienter med avansert sykdom skuff [1].
I de senere årene, fremskritt i forståelsen av biologien til CRC har førte til etablering av flere mekanismebaserte terapier. Etter godkjenning av f.eks rollen til EGF-R og VEGF-R i spredning og angiogenese, har flere forbindelser som cetuximab, panitumumab eller bevacizumab gått klinisk undersøkelse og ble vist til positivt påvirke pasientenes overlevelse [2] – [4]. Det er forventet at en fullstendig opptelling av bidraget gitt av enkeltsignalveier til kreftutvikling vil tillate anvendelsen av terapier som er skreddersydd til et begrenset antall individuelle molekylære mål.
En annen nylig eksempel på en mekanisme-basert terapi er representert av utviklingen av forbindelser rettet mot «døds-reseptorer» TRAIL-R1 og TRAIL-R2 for å selektivt indusere apoptose i kreftceller [5]. Utviklingen av slike midler er basert på begrunnelsen gitt av studier som viser at å slå ut av TRAIL eller blokkering av TRAIL-reseptorer fører til økt tumor og metastasedannelse
in vivo product: [6] og at tap av TRAIL-reseptorer uttrykk i humane kreftvevet korrelerer med dårlig prognose og tumorresidiv (Anmeldt av Walczak og kolleger [7]). I denne forbindelse kan vi nylig viser at membranfarging for TRAIL-reseptorer bestemmer prognosen for pasienter rammet av leverkreft [8] og at uttrykket av TRAIL-bindende løselig decoy reseptor OPG korrelerer med tumorstadium og metastasedannelse hos pasienter som lider ved colon-karsinom [9]. På det nåværende flere TRAIL-reseptorer rettet mot forbindelser er under klinisk undersøkelse i ulike kreft enheter [5], [7].
Tidligere retrospektive studier som viser en nesten ufravikelig farging for TRAIL-reseptorer i kolorektal kreft prøvene representert begrunnelsen for sysselsetting av TRAIL-reseptorer målsøkende midler i behandlingen av denne svulsten. Uventet imidlertid kvantitativ vurdering av TRAIL-reseptorer fargeintensitet ble assosiert med forskjellige prognostiske utfall i disse studiene [10] – [13]. I tillegg første rapportene om tidlig fase kliniske studier med TRAIL-reseptorer rettet mot forbindelser CRC viste skuffende resultater, spørre videre etterforskning på en mulig rolle av reseptorene for TRAIL som terapeutisk mål i denne svulsten.
For å løse dette problemet vi undersøkt en kohort av pasienter med tidlig fase kreft i tykktarmen uten knute eller fjernmetastaser som gjennomgår ingen annen behandling enn kirurgi, og kategorisert tumorprøver i henhold til tilstedeværelse eller fravær av TRAIL-reseptorer på overflaten av tumorceller som et alternativ til den eneste semikvantitativ vurdering av TRAIL-reseptorer farging ansatt i tidligere studier. Vi fant at kolorektal kreft viser en heterogen uttrykk mønster av TRAIL-reseptor-1 og -2 med hensyn til deres membranøs forekomst. Forskjeller i uttrykket av TRAIL-reseptorer i ulike subcellulære avdelinger, snarere enn deres fargeintensitet uavhengig spådde prognose for CRC pasienter, og dermed representerer en markør identifisere en undergruppe av svulster som har mistet følsomhet for reseptor-mediert apoptose.
Materiale og metode
Kliniske prøver
kolorektalkreft prøver fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon med kurativ intensjon mellom 1994 og 2004 ved Universitetet i München ble hentet fra arkivene til institute of Pathology av vårt universitet. Innsamling av prøver og av pasientenes informasjonen ble gjennomført i anonymisert form i avtale om retningslinjene for etisk komité ved Universitetet i München. Bare kolorektal adenokarsinomer med moderat differensiering (G2 ifølge WHO klassifisering), T-kategorier T2 og T3 som hverken nodal (N0) eller fjernmetastaser (M0) ved diagnosetidspunktet, og dermed i stadium I og IIA henhold til TNM klassifisering av tykktarmskreft, ble vurdert (T2 /T3N0M0 G2) [14]. Videre, for å minimalisere en mulig påvirkning av radio- eller chemo-terapi på TRAIL-reseptorer status [15], [16] og på pasientenes prognose ble pasienter som gjennomgikk neoadjuvant eller adjuvant behandling i tillegg til kirurgisk behandling ekskludert fra dette kullet. Overlevelsesdata ble hentet fra svulsten registret München (www.tumoregister-muenchen.de). Tilfeller ble sensurert hvor pasienter ble tapt til observasjon eller døde av andre årsaker enn kolorektalkreft. Studien oppfylt kravene til etikkomiteen av Ludwig-Maximilian Universität i München.
Bygging av microarray
Kolorektal microarray (TMA) ble konstruert som beskrevet tidligere [17]. I korthet fem mikrometer H E farget deler av formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) tumorprøver ble brukt til å definere representative områder av levedyktig svulstvev. Fra disse områdene 1,0 mm diameter nål kjerne-biopsier ble tatt fra tilsvarende områder på FFPE- tumor blokker med en vev arrayer (Beecher Instruments, Sun Prarie, WI, USA). Kjernene ble plassert i mottaker parafin matriseblokker ved definerte koordinater. For å sikre at representative deler av tumorene ble undersøkt tre kjerner av hver tumor ble tatt. For å ta også svulst heterogenitet i betraktning, ble kjerner hentet fra sentrale svulst områder så vel som fra invasive fronten. Kjernene i parafin blokken ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C for å forbedre adhesjonen mellom kjerner og parafin i mottakerens blokken.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemisk farging ble utført på 5 um deler av TMA blokker. Anti-TRAIL-R1 monoklonalt geit antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Tyskland Art.nr. sc-6823), Anti-TRAIL-R2 monoklonalt kanin antistoff (Calbiochem, California, USA Art.nr. PC392), E- cadherin monoklonalt mus-antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble påført som primært antistoff. Coimmunofluorescence ble utført ved hjelp av følgende fluorescein merket sekundære antistoffer: for TRAIL-reseptorer FITC-konjugert anti-geit IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) og for CDH1 en Cy3-konjugert anti-mus IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA). Disse antistoffene ble tidligere brukt og validert [8]. Antigen gjenfinning ble utført ved å koke delene på Target Retrieval Solution (Dako, Hamburg, Tyskland) ved hjelp av en mikrobølgeovn 2 ganger hver 15 min ved 750 W. Endogen peroksidase ble blokkert ved inkubering i 7,5% hydrogenperoksid i 10 minutter. Vectastain ABC-Kit Elite Universal (Vector Laboratories, CA, USA) sammen med AEC kromogen (Zytomed Systems) ble brukt for utvikling. Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoksylin (Vector).
Evaluering av TRAIL-R1 og TRAIL-R2 immunhistokjemi
TRAIL-R1 og TRAIL-R2 farging ble evaluert av gradering fargeintensitet i henhold til en semikvantitativ poengsum som strekker seg fra 0 til 2, henholdsvis for negative, svake og sterke positive grader av immunoreaktivitet (figur 1). I henhold til grunnen er at en forutsetning for funksjonell aktivitet til TRAIL-reseptorer er den membranoverflate-ekspresjon [18], ble en andre evaluering utført ved å kategorisere tumorprøver i henhold til tilstedeværelse eller fravær av TRAIL-reseptorer flekker på cellemembraner, uavhengig av den samtidige tilstedeværelsen av cytoplasmatic farging og dens fargeintensitet (figur 2). I tillegg til den inspeksjon ved konvensjonelle lys-mikroskopi, til mer følsomt diskriminere mellom membranen og cytoplasmatic farging for TRAIL-reseptorer, ble det immunofluorescens mønster av ko-farging av TRAIL-reseptorer og E-cadherin utført ved hjelp av konfokal mikroskopi (representative fargemønstre i figur 3). Bilder ble tatt med en LSM 700 enhet (Zeiss) med en Plan Apochromat 20 × /0.8 M27 objektiv, ZEN 2009 programvare (Zeiss) og følgende innstillinger: bildestørrelse 2048 x 2048 og 16 bit; pixel /oppholdstid på 25,2 us; pikselstørrelse 0,31 mikrometer; lasereffekt 2%; Hoved gevinst 600-1000. Etter bilde fange de opprinnelige LSM filene ble konvertert til TIFF-filer. For å utelukke prøver intraobserver variabilitet ble evaluert to ganger av en observatør som ikke hadde noen tidligere kjennskap til prognose eller andre klinikk-patologisk variabler. Eksempler på noen av TRAIL-reseptorer farging i kreftprøvene eller i ikke-tumor colonic vev er henholdsvis vist i figur 1, figur 2, og i figur S1.
(A) Prosent av prøvene viser ingen farging, eller svak sterk immunoreaktivitets. (B-D): representant typisk mikroskopisk utseende TRAIL-R1 farging (B:. Ingen farging C: svak og D: sterk farging). (D til F): farging av TRAIL-R2 (E:. Ingen farging F: svak og G: sterk farging). De foreliggende delene er representant for en grad 2 colonic kreft i stadium II (T3N0M0) ved forstørrelse på 630 ×.
(A) prosentandel av tumorprøver som viser membranfarging for TRAIL-R1 og Trail- R2. Representant typisk mikroskopisk utseende TRAIL-R1 farging med dominerende cytoplasmatic (B) eller membranfarging (C). Typisk mønster av TRAIL-R2 farging med overveiende cytoplasmatic farging (D) eller membranfarging (E). Forstørrelse, × 800. De foreliggende delene er representant for en grad 2 colonic kreft i stadium II (T3N0M0) ved forstørrelse på 630 ×.
Representant mønster av co-farging av TRAIL-R1 og E-cadherin på cellemembraner av kolorektal kreft celler ved konfokal mikroskopi som viser (A) et mønster av fremherskende membranfarging lignet med (B) ikke-membranøs farging. Farging for TRAIL-R1 (grønn, venstre panel), E-cadherin (rød, midtre panelet) og overlegg av disse flekker (panel høyre).
Analyser av KRAS-mutasjoner
for analysene av mutasjoner i ekson 2 av KRAS onkogen i kodon 12/13, ble materiale igjen fra kun 200 av de 231 pasientene (86,6%). Derfor, ble genomisk DNA ekstrahert fra mikrodisseksjon av vevsområder inneholdende tumor som tidligere beskrevet [19]. Pyro-sekvensering ble gjort ved hjelp av pyro-gull kit (Qiagen, Tyskland) og HotStar Taq-polymerase (Qiagen, Tyskland). Den PF2 primer ble anvendt for å bestemme anti-sense-sekvenser. Den PyroMark Q24 enhet (Qiagen, Tyskland) og PyroMark ™ Q24 programvare ble brukt til sekvensering, og sekvensanalyser [20], [21].
mikrostabilitetsanalyse
For å bestemme status av mikro stabilitet [mikro stabilitet (MSS) eller mikro ustabilitet høyverdig (MSIH)], to mononukleotid gjenta markører BAT-25 og BAT-26 ble undersøkt. DNA ble amplifisert i en dupleks PCR (Qiagen DNA Multiplex PCR kit, 100 nM BAT25 og 100 nM BAT26-spesifikke primere – Tabell S3) som gjelder den følgende syklus profil: denaturering ved 95 ° C i 15 minutter, 34 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 57 ° C i 90 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 60 sek, med en avsluttende forlengelsestrinn ved 60 ° C i 30 minutter, som tidligere beskrevet [22], [23]. 1 pl av PCR-produktet ble blandet med 18,5 ul av sterkt deionisert formamid (hidi formamid) og 0,5 pl DNA Size Standard LIZ 500 /(-250) (begge Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Denne blanding ble denaturert i 3 minutter ved 94 ° C, umiddelbart satt på is, og separert ved å bruke en ABI 3130 Genetic Analyzer. Resultatene ble analysert ved hjelp GeneMapper programvare (Applied Biosystems).
Analyse av uttrykk for spleise former KRAS4A og KRAS4B
For denne undersøkelsen tilstrekkelig materiale ble igjen for bare 128 av 231 tumorprøver (55,4 %). Derfor hele RNA ble isolert fra microdissected tumor områder ved hjelp RNeasy sett (Qiagen, 74404) som tidligere beskrevet [24]. RNA-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av UV-fotometri. 200-1000 ng av RNA-isolater ble reverstranskribert i nærvær av 100 uM tilfeldige heksamerprimere og 200 U RevertAid revers transkriptase (begge ved Fermentas, St. Leon, Tyskland; SO142, EP0441). 2 ul av den urensede RT-reaksjon ble anvendt som templat i RT-qPCRs anvender Lys Cycler 480 Probes Master (Roche; 04902343001) med spesifikke primer-par og universelle prober ProbeLibrary (Roche – Tabell S3). Cp (kritisk punkt) verdier av RT-qPCRs spesifikke for
KRAS4A, KRAS4B Hotell og referansen genet
HPRT product: (
hypo-xantin phosphoribosyl- transferase
) ble bestemt å ansette en LightCycler 480 enhet (Roche). Alle konsentrasjoner av
KRAS4A, KRAS4B
-spesifikke RNA ble normalisert på uttrykk for
HPRT
genet (ΔCp). Forsøk ble utført i duplikater og gjentatt minst to ganger. For å validere det eksperimentelle system, relative mengder av de to spleisevarianter KRAS4A og KRAS4B ble vurdert i cellelinjer SW948 og HCT15 som det hadde blitt beskrevet som SW948 uttrykke mer KRAS4A variant enn HCT15 celler [25]. Dette resultatet var reproduserbar (figur S3) således validere det eksperimentelle oppsett. Videre vårt lese ut system vist høy robusthet som kalibreringskurver ved bruk av definerte mengder av templat-DNA viste linearitet i det minste over fire log skaleres ned til 100 kopier av den spesifikke type av RNA (figur S3).
Statistisk analyse
Kryss tabuleringer ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test. Kaplan-Meier-analysen ble brukt til å estimere kreft spesifikk overlevelse. Betydningen av Kaplan-Meier statistikken ble testet bruk av log-rank test. Multivariat analyse ble gjort ved hjelp av multivariat Cox regresjonsmodell. Statistikken ble beregnet ved hjelp av SPSS versjon 15.0 (SPSS Inc.). p-verdier og 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Pasienter og prøver
screening for kreftprøver ble utført på pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon med kurativ intensjon. mellom 1994 og 2004 ved vår institusjon. Valg av prøvene var begrenset til kolorektal adenokarsinomer med moderat differensiering (G2), T-kategorier T2 og T3 hos pasienter som verken nodal (N0) eller fjernmetastaser (M0) ved diagnosetidspunktet, og begrenset til pasienter som får kun kirurgisk behandling . Dette resulterte i en samling av 231 pasienter for analysen. Samlingen besto av 55% menn og 45% kvinnelige pasienter. 64% av pasientene var eldre enn 65 år (gjennomsnittsalder 56 ± 8,1 år), mens de resterende 36% av pasienten hadde en gjennomsnittsalder på 75 ± 6,9 år. 85% av pasientene ble diagnostisert med en svulst i stadium T3 mens 15% av pasientene ble rammet av en svulst i fase T2. Overlevelsen data ble sensurert så tilfelle oppfølging ble avviklet eller pasienter døde av andre årsaker enn kolorektalkreft. Egenskapene til denne pasientgruppen er oppsummert i tabell 1.
TRAIL-R1 og TRAIL-R2 flekker i kolorektal kreft prøver
For å vurdere farging av TRAIL-reseptorer i tumorprøver vi først utført en semi-kvantitativ analyse basert på kategorisering av prøvene i henhold til den manglende flekker, eller tilstedeværelse av en svak eller sterk fargeintensitet for de respektive reseptorer. I henhold til dette kriteriet, 87 (38%) av tykktarmskreft prøvene viste en sterk positiv farging, 129 (56%) viste en svak farging, mens 15 (6%) prøver farget fullstendig negative for TRAIL-R1 (figur 1). Som TRAIL-R2 i tumorprøver ble undersøkt, var en sterk farging observert i 110 (48%) av tilfellene en svak farging i 116 (50%), mens bare 5 (2%) prøver farget negativt for TRAIL-R2 (figur 1). I en etterfølgende analyse fastslått at det cellulære fordelingen av TRAIL-R1 og TRAIL-R2 ved å kategorisere tumorprøver i henhold til tilstedeværelse eller fravær av farging for de respektive TRAIL-reseptorer på cellemembraner. Som bedømt ved immunhistokjemisk farging og den overlappende immunfluorescens mønster av TRAIL-reseptorer og av E-cadherin, membranfarging for TRAIL-R1 kunne påvises i 163 (71%) tilfellene, mens negativ farging eller utelukkende cytoplasmatic farging ble påvist i 68 (29 %) saker. For TRAIL-R2 membranfarging ble observert i 36 tilfeller (16%); cytoplasmatic eller negativ farging ble observert i 195 tilfeller (84%).
Derfor, mens de fleste tumorprøver farget helt positivt for TRAIL-reseptor 1 og 2, den fraksjon av tumorprøver som viser membranfarging for disse reseptorene var betydelig Nedre. Når uttrykket intensitet og den cellulære fordelingen av TRAIL-reseptorer i tumorprøver ble analysert i forhold til forskjellige klinisk-patologiske variabler, inkludert KRAS-mutasjonstatus og nærværet av mikro ustabilitet, kunne ingen korrelasjon detekteres som bedømt ved Fishers eksakte test (tabellene S1 og S2).
Prognostic betydningen av TRAIL-reseptor uttrykk og cellulær lokalisering ved kolorektalkreft
Når uttrykket av TRAIL-reseptorer ble vurdert i forhold til overlevelse av pasienter med kolorektal kreft, TRAIL R1 fargeintensitet (høy uttrykk vs. lav /ingen uttrykk) var assosiert med en betydelig bedre prognose: 5-års overlevelse for pasienter som har svulster med samlet høyere TRAIL-R1 uttrykk var 70% vs. 56% av pasienter med lav eller helt uten farging for TRAIL-R1; 10-års overlevelse for disse pasientene var henholdsvis 31% vs. 25% (p = 0,008; figur 4A). I tillegg, når tumorprøver ble kategorisert i henhold til tilstedeværelse eller fravær av membranfarging for TRAIL-reseptorer, pasienter med tumorer som oppviser TRAIL-R1 flekker på overflaten av cellemembraner ble vist å ha en bedre prognose lignet med pasienter med cytoplasmatic eller ingen farging (5- års overlevelse 65% vs. 44%, 10-års overlevelse: 30% vs. 22%, p = 0,003 – 4B)
(A) Survival tomt på pasienter rammet av tykktarmskreft iht. . til TRAIL-R1 fargeintensitet. I dette og de følgende grafer sensurert tilfeller er indikert med en crossball. (B) overlevelseskurver for de samme pasientene «befolkning kategorisert i henhold til TRAIL-R1 flekker på cellemembranen. (C) Survival tomten av pasienter i henhold til fargeintensitet for TRAIL-R2 (sterk vs svak uttrykk). (D) overlevelse tomt på samme pasient befolkning kategorisert i henhold til TRAIL-R2 cellulær distribusjon. (E) Overlevelse av pasienter i henhold til membranfarging status for begge TRAIL-reseptorer. Kaplan-Meier-kurver representerer total overlevelse relatert til membranfarging av TRAIL-reseptor 1 og 2 kontra pasienter som har svulster flekker negative for begge TRAIL reseptorer.
Når TRAIL-R2 farging ble vurdert, sin intensitet i uttrykket ikke signifikant korrelert med overlevelse (p = 0,17, figur 4C). Hvis imidlertid var pasientene delt i henhold til tilstedeværelse eller fravær av flekker på cellemembraner, membranfarging for TRAIL-R2 i tumorprøver korrelerte med en vesentlig bedre pasientoverlevelse (5 års overlevelse: 83% vs. 57%; 10- års overlevelse: 38% vs. 26% p = 0,015; figur 4D). Når pasientenes overlevelse ble analysert i henhold til den doble positivitet for TRAIL-reseptorer, dvs. når overlevelsen av pasienter med samtidig membranfarging for TRAIL-R1 og TRAIL-R2 ble sammenlignet med pasienter som viser ingen farging eller cytoplasmatic flekker bare, overlevelse av pasienter med membranfarging for både TRAIL-reseptorer og økte til 92% vs. 44% av pasientene uten noen membran farging (p = 0,012, figur 4E). En ytterligere analyse med tanke på mulig at, som tidligere rapportert, KRAS mutasjoner, en redusert mengde av spleisevariant KRAS4A i forhold til spleisevariant KRAS4B, eller en MSI-fenotype kan påvirke overlevelse av pasienter med kolorektal kreft [26] – [28] , klarte ikke å vise noen signifikant prognostisk effekt i våre pasienters kohort (figur S2).
til slutt, for å vurdere den spesifikke påvirkning av TRAIL-reseptorer flekker på overlevelse, en Cox regresjonsanalyse inkludert samtidig den cellulære fordeling av TRAIL reseptorer, deres fargeintensitet og andre relevante klinisk-patologisk variabler ble utført. Dette viste at membranfarging for TRAIL-R1 og for TRAIL-R2 individuelt og uavhengig spår overlevelsen av våre kolorektal kreftpasienter kollektiv (TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12 til 3,77]; TRAIL-R2: p = 0,033 , RR 3,63 [1,11 til 11,84]). I kontrast, til tross for signifikant sammenheng funnet i lang-rank test, kan fargeintensitet /uttrykk for TRAIL-reseptorer ikke bli bekreftet som uavhengig risikofaktor for tilbakefall (tabell 2).
diskusjon
TRAIL-reseptorer i patofysiologien og behandling av tykktarmskreft
tapet av TRAIL-reseptorer har vist seg å spille en viktig rolle i kreftutvikling. Spesielt flere ulike studier støtter tanken om at TRAIL signaliserer spiller
in vivo
en viktig funksjon i å forebygge metastasedannelsen [29] – [32]. Nylig ble det også vist at uttrykket av TRAIL-reseptorer korrelerer med at av flere markører for apoptose og dermed gi en kobling mellom den funksjonelle rollen til disse reseptorene og deres prognostisk betydning [33].
Tidligere rapporter om nesten allestedsnærværende uttrykk for TRAIL-reseptorer i CRC representert begrunnelsen for bruk av TRAIL-reseptorer målsøkende midler for behandling av denne svulsten. Overraskende imidlertid, mens hyppig tap av TRAIL-reseptorer rapportert for flere kreft enheter kan representere et hinder for den kliniske effekten av slike forbindelser [8], [10], [34], [35] ingen systematisk evaluering av membranfarging av TRAIL reseptorer i CRC prøvene er tilgjengelig. Videre første rapportene om tidlig fase kliniske studier med TRAIL-reseptorer målretting agonistiske antistoffer i CRC klarte ikke å vise klare tegn til effekt [36] spørre videre etterforskning på TRAIL-reseptorer som terapeutisk mål i behandlingen av denne svulsten. For å løse dette problemet, basert på våre siste funn i leverkreft [8] vi innført evaluering av den cellulære fordeling av TRAIL-reseptorer som kriterium for å vurdere deres prognostisk betydning. Også for å redusere potensielle vektingsfaktorer, bestemte vi oss for å analysere en homogen pasient kollektiv med svulster i tidlig stadium uten metastaser under operasjonen bare.
Prognostic relevansen av TRAIL-reseptorer fargeintensitet
Etter avtale med tidligere studier [10], [12], [13], i vårt kohort de aller fleste av prøvene viste positiv farging for TRAIL-R1 og TRAIL-R2, omtrent halvparten av prøvene viste en sterk farging (figur 1). Som vi vurdert den prognostiske betydningen av TRAIL-reseptorer flekker, TRAIL-R1 intensitet flekker score (sterk vs lav /ingen flekker) viste en signifikant korrelasjon med overlevelse på lang-rank test, høyere TRAIL-R1 fargeintensitet bli assosiert med bedre overlevelse (p = 0,008, figur 4A); i motsetning til dette TRAIL-R2 fargeintensitet, KRAS-status, den relative mengde av spleisevariant KRAS4A eller MSI-fenotype viste ingen sammenheng med overlevelse (figur 4C, fig S2). Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier som rapporterte en positiv sammenheng mellom pasientenes overlevelse og uttrykk for TRAIL-R1 [10], [33]. Av ukjente grunner ble ingen effekt [13] eller enda en negativ korrelasjon for TRAIL-R1, men trendy positiv korrelasjon for TRAIL-R2 med overlevelse også rapportert [12].
Prognostic relevansen av den cellulære fordeling av Trail- reseptorer som alternativ til fargeintensitet
i forsøket på å ytterligere avklare dette spørsmålet, vi senere vurderes om tilstedeværelse eller fravær av membranfarging av TRAIL-reseptorer kan bedre korrelere med overlevelse da den eneste evaluering av deres fargeintensitet. I motsetning til den nesten allestedsnærværende farging for TRAIL-reseptorer, en betydelig fraksjon av prøvene viste negative membranfarging for TRAIL-R1 og TRAIL-R2 (figur 2). Ved å vedta dette kriteriet, fem-års overlevelse hos pasienter som har svulster som stiller TRAIL-R1 eller TRAIL-R2 flekker på cellemembraner var høyere enn for pasienter som viser ingen farging eller cytoplasmatic flekker bare (figur 4). Pasienter som har svulster med dobbel-positiv membranfarging for både TRAIL-reseptorer levde betydelig lengre i forhold til pasienter som viser dobbelt negative membranfarging (figur 4E). Det faktum at i den multivariate analysen omfatter effekten av den cellulære fordeling av TRAIL-reseptorer så vel som for sin fargeintensitet, sistnevnte kan ikke bekreftes som uavhengig prognostisk faktor antyder at påvisning av TRAIL-reseptorer flekker på cellemembranen er den viktigste faktor for overlevelse: dette er forenlig med de tilgjengelige data for pasienter som lider av leverkreft [8], med siste
in vitro
bevis på rollen TRAIL-reseptorer intern i motstanden mot TRAIL [18] , og med forestillingen om at membranbundne TRAIL-reseptorer er utsatt for virkningen av sirkulerende TRAIL. Tidligere studier har vist ingen prognostisk betydning for TRAIL-R2, eller bare en trend mot en positiv sammenheng mellom uttrykket av denne reseptoren og overlevelse [12]; vi hypoteser om at man ikke forstår rollen TRAIL-R2 i å bestemme pasientenes overlevelse i tidligere studier reflekterer høyere prognostisk betydning av den cellulære fordeling av TRAIL-reseptorer vs. at av deres fargeintensitet.
Kliniske konsekvenser av den funksjonelle betydningen av TRAIL-reseptorer flekker på cellemembraner
Tap av uttrykk for TRAIL-reseptorer har potensielle konsekvenser med hensyn til ansettelse av agonistiske antistoffer rettet mot TRAIL-reseptorer på dette tidspunktet under klinisk undersøkelse som kreftterapi: selv om vi kunne bekrefter at det store flertallet av svulster farget positivt for TRAIL-reseptorer, fant vi at tap av TRAIL-reseptorer på cellemembranen er en hyppig trekk ved CRC med dominerende prognostisk betydning; Det bør derfor vurderes om unnlatelse av å vise tegn på effekt i siste kliniske forsøk ved hjelp av TRAIL-reseptorer agonistiske antistoffer [36] kan være forårsaket av utilstrekkelig utvalg av pasienter som har svulster med membranbundne TRAIL-reseptorer. På den annen side, på grunn av summering av prognostiske effekten av TRAIL-R1 og TRAIL-R2, pasienter som viser membranfarging for både reseptorer kan tjene ved samtidig administrering av antistoffer rettet mot både reseptorer eller ved administrasjon av rekombinant TRAIL [37] .
det faktum at, uavhengig av deres cellulær lokalisering, nesten alle tumorprøver viste en viss grad av farging for TRAIL-reseptorer er i tråd med tanken om at genetisk tap eller mutasjon av TRAIL-reseptorer er en sjelden hendelse i kreftceller [34], [38]. Forskjeller i den cellulære distribusjonen av disse reseptorene antyder i stedet at nedskrivning av TRAIL-reseptorer menneskehandel til den ytre cellemembranen eller mekanismer for intern spille en rolle i å bestemme den funksjonelle tap av TRAIL-reseptorer. Til denne forbindelse, endocytose mediert av clathrin ble nylig beskrevet som årsak til motstand mot TRAIL i brystkreftceller [18] og en rekke forbindelser ble vist å øke ekspresjon av TRAIL-reseptorer, så vel som deres lokalisering på cellemembraner [39], [ ,,,0],40].
