Abstract
ekstrakt av ingefær (
Zingiber officinale Roscoe
) og dens store stikkende komponenter, [6] -shogaol og [6] -gingerol, har vist seg å ha en anti -proliferative effekt på en rekke tumorcellelinjer. Imidlertid er den anticancer aktivitet av ingefær ekstrakt i bukspyttkjertelkreft dårlig forstått. Her viser vi at etanol hentet materialer av ingefær trykt cellecyklusprogresjonen og dermed forårsaket død av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, inkludert Panc-1 celler. Den underliggende mekanisme innebar autosis, en nylig preget form for celledød, men ikke apoptose eller necroptosis. Ekstraktet markert økt LC3-II /LC3-I ratio, redusert SQSTM1 /p62 protein og forbedret vacuolization av cytoplasma i Panc-1 celler. Det aktivert AMPK, en positiv regulator av autofagi, og hemmet mTOR, en negativ autophagic regulator. De autofagi hemmere 3-metyladenin og klorokin delvis forhindret celledød. Morfologisk, men fokus membran brudd, kjernekraft krymping, focal hevelse i perinukleær plass og elektron tette mitokondrier, som er unike morfologiske trekk autosis, ble observert. Ekstraktet forbedrede reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjon, og antioksidanten N-acetylcystein svekket celledød. Vår studie viste at daglig intraperitoneal administrasjon av ekstraktet signifikant forlenget overlevelse (P = 0,0069) i en peritoneal formidling modell og undertrykte tumorvekst i en orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen (P 0,01) uten alvorlige bivirkninger. Selv [6] -shogaol men ikke [6] -gingerol viste lignende effekter, analyser kromatografisk antydet nærværet av andre bestanddelen (e) som virkestoff. Sammen utgjør disse resultatene viser at ingefær ekstrakt har potent anticancer aktivitet mot kreft i bukspyttkjertelen celler ved å fremkalle ROS-mediert autosis og garanterer videre etterforskning for å utvikle en effektiv legemiddelkandidat
Citation. Akimoto M, Iizuka M, Kanematsu R, Yoshida M, takenaga K (2015) Anticancer Effekt av Ginger Extract mot kreft i bukspyttkjertelen celler Hovedsakelig gjennom reaktive oksygen arter-mediert Autotic celledød. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10,1371 /journal.pone.0126605
Academic Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, SPANIA
mottatt: 06.01.2015; Godkjent: 05.04.2015; Publisert: 11 mai 2015
Copyright: © 2015 Akimoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-in-Aid fra: Shimane University «SUIGANN» Project (https://www.shimane-u.ac .jp) (til KT); Vitenskapelig forskning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan (https://www.mext.go.jp) (ingen 25.430.110 til KT.); og Japan Arteriosclerosis Research Foundation (til KT). Dette arbeidet ble også støttet av støtte for Super Science videregående skoler fra Japan Science and Technology Agency til Izumo High School (https://rikai.jst.go.jp) (til KT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært aggressiv svulst med mange chemotherapy- og strålebehandling bestandig fenotyper. Forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen øker årlig over hele verden, og ble den fjerde vanligste årsaken til kreft-dødsfall i verden. Faktisk, estimert antall nye kreft i bukspyttkjertelen tilfeller var 277 000 i 2008 og 338 000 i 2012, og det var 266.000 bukspyttkjertelkreftdødsfall i 2008 og 331.000 i bukspyttkjertelen kreftdødsfall i 2012 [1, 2]. Som de fleste av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er diagnostisert på et ubrukelig stadium [3, 4], er den samlede 5-års relativ overlevelse lav, og median overlevelsestid er bare 6 måneder til og med hos pasienter som får god behandling. For å få nye kunder for utvikling av forebyggende og terapeutiske strategier, har mange forskningsinnsatsen vært fokusert på å forstå de molekylære mekanismene bak bukspyttkjertelkreft progresjon [3, 4].
Ginger (
Zingiber officinale Roscoe
), er en rhizomatous flerårig plante, mye brukt som et krydder i mat og drikke og benyttes først og fremst som et middel for fordøyelsessykdommer inkludert dyspepsi, kvalme, gastritt, oppkast, kolikk og diaré [5, 6]. Ingefær ekstrakt og dens stikkende komponenter, for eksempel [6] -gingerol og [6] -shogaol, er også kjent for å utvise mange biologiske effekter inkludert anti-inflammasjon, antioksydasjon og anticancer aktivitet [5, 6]. På grunn av sin sterke anti-inflammatorisk aktivitet, har ingefær nylig fått oppmerksomhet som et middel for artrose og revmatoid artritt [7, 8]. Med hensyn til anticancer aktivitet, ingefær og dens bestanddeler har vist seg å hemme proliferasjonen av og induserer apoptose av forskjellige typer cancerceller
in vitro product: [9-15]. I tillegg har bruken av ingefær for chemoprevention av tykktarmskreft vakte oppsikt [16-18]. Imidlertid har anticancer aktivitet av ingefær ekstrakt og dens bestanddeler mot bukspyttkjertelkreft er dårlig undersøkt.
I denne studien undersøkte vi anticancer aktivitet av ingefær ekstrakt mot bukspyttkjertelkreftceller både
in vitro
og
in vivo Hotell og undersøkt sitt potensial mekanisme. Her rapporterer vi at ingefær ekstrakt fører til reduksjon av cellenes levedyktighet og tumorvekst av PANC-1-celler hovedsakelig gjennom ROS-mediert autosis, en nylig karakterisert form for celledød.
Materialer og Metoder
celler og cellekultur
menneske~~POS=TRUNC kreft i bukspyttkjertelen celler, Panc-1, ASPC-en, BxPC-3, CAPAN-2, CFPAC-en, MIAPaCa-2 og SW1990, og mus kreft i bukspyttkjertelen celler, Panc02 , ble anvendt i denne studien. PANC-1 og MIAPaCa-2-celler ble oppnådd fra RIKEN Cell Bank BRC (Tsukuba, Japan), og andre humane pankreatiske cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA). Panc02 celler ble vennlig levert av Dr. T. Hollingsworth, University of Nebraska Medical Center [19, 20]. Panc-1-Luc-ZsGreen celler og Panc02-Luc-ZsGreen celler som uttrykker ildflue luciferase og ZsGreen ble etablert ved lentiviral transduksjon av plasmidet pHIV-Luc-ZsGreen, som har blitt deponert hos Addgene (https://www.addgene.org /Bryan_Welm /), og etterfølgende kloning. Humane lunge alveolære epitelceller (HPAEpiC) ble anskaffet fra ScienCell (Carlsbad, CA, USA) og ble opprettholdt i alveolar epitelcelle-medium (AEpiCM) supplementert med 2% føtalt bovint serum (FBS), epitelial cellevekst supplement (EpiCGS) og penicillin /streptomycin. Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble oppnådd fra Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, USA) og ble dyrket i EBM-2 supplert med EGM SingleQuats (Lonza). Mitokondrier DNA-mindre P29 (ρ
0P29) celler og cybrid P29mtP29 celler som ble gjeninnført med P29 mtDNA inn ρ
0P29 celler ble etablert fra Lewis lungekarsinom P29 celler [21]. Colon kreft celler (Colo320DM, HT29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], mage kreftceller (MKN1, MKN45) [23], lungekreft celler (A549, QG56, PC-10, PC-en) [24 ], brystkreft celler (MCF7, BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-468) [25, 26], leukemiceller (THP-1, K562) [27], osteosarcom-celler (Saos-2) [28 ], livmorhalskreft celler (HeLa) [29], hepatomceller (HepG2) [30], fibrosarkom celler (HT1080) [29], og mus colon carcinoma LuM1 celler avledet fra tykktarm 26 tumor [31] ble også brukt i denne studien . HT29, LS174T, SW480, SW620 og MDA-MB-468 ble kjøpt fra ATCC. MCF7 og HT1080 celler ble hentet fra JCRB Cell Bank. THP-1 og K562 celler ble vennlig levert av Dr. Y. Honma, Shimane Universitetet medisinske fakultet. Magekreft cellelinjer ble levert av Avdeling for patologi (Dr. S. Morikawa), Shimane Universitetet medisinske fakultet. Andre cellelinjer ble levert av Dr. A. Nakagawara, Chiba Cancer Center Research Institute. Karakteristikker av cellelinjene anvendt i denne studien er beskrevet andre steder [19-31]. Leukemicellelinjer ble dyrket i RPMI1640 medium inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 40 ug /ml gentamicin. Andre cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% FBS og 40 ug /ml gentamicin i en fuktet atmosfære med 21% O
2/5% CO
2 (normoxia) eller 1% O
2/5% CO
2 (hypoksi). Hypoksiske dyrkningsforhold ble oppnådd i en fuktet automatisk O
2 /CO
2 inkubator (Wakenyaku, Kyoto, Japan).
Reagenser
[6] -Shogaol og [6 ] -gingerol ble kjøpt fra TOKIWA phytochemical CO., Ltd (Chiba, Japan).
Utarbeidelse av ingefær ekstrakt (SSHE)
pulver av de bakenforliggende delene av Syussai Shoga (ingefær i japansk), som ble dyrket i Hikawa området Izumo, Shimane prefecture, ble ekstrahert med etanol (10: 1; volum til vekt) i 20 min i en sonikator vannbad. Etanol ble avdampet ved 80 ° C, hvilket ga et urent etanolekstrakt av ingefær (referert til som SSHE). Ekstraktet ble veid og oppløst i etanol eller dimetylsulfoksid (DMSO) ved den ønskede konsentrasjon.
cellevekst og levedyktighet assay
cellevekst og levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT (3- (4- , 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay. I korthet ble celler (2×10
4 celler /brønn) ble dyrket i 96-brønns vevskulturplater og behandlet i triplikat i 100 pl DMEM /10% FBS inneholdende forskjellige konsentrasjoner av SSHE eller oppløsningsmidlet alene for den samme periode. Ved slutten av inkubasjonen ble 10 ul av MTT (2,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) tilsettes til brønnene for å tillate dannelse av MTT formazankrystaller i 4 timer. Etter at mediet var fjernet, ble krystallene oppløst i 100 ul DMSO. Absorbansen ble registrert ved 550 nm. Cellelevedyktigheten ble også undersøkt ved en trypan blått fargestoff utelukkelse test.
cellesyklusanalyse
PANC-1-celler behandlet med SSHE i 20 timer ble fiksert i 70% etanol og lagret ved -20 ° C inntil bruk. De fikserte cellene ble vasket med Dulbeccos PBS (DPBS) og inkubert med 100 pg /ml RNase A og 50 ug /ml PI (Sigma-Aldrich Japan). Cellene ble deretter utsatt for flowcytometrisk analyse ved bruk av et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Måling av mitokondrier membranpotensialet
Mitokondrier membranpotensialet ble overvåket ved den JC- 1 mitokondriemembranen potensial Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). For denne analysen ble 100 ul /ml av den JC-1-fargeløsning tilsatt til PANC-1-celler behandlet med SSHE i 20 timer i 6-brønners plater, og cellene ble inkubert i 15 min. Etterpå ble cellene løsnet ved trypsinering, vasket to ganger med analysebuffer, og deretter utsatt for strømningscytometri.
Annexin V /propidiumjodid (PI) farging
Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Beckman Coulter Inc., Pasadena, CA) ble brukt til å påvise annexin V og /eller PI-positive celler. Kort sagt ble Panc-1 celler ble vasket med is-kaldt DPBS og deretter farget med Annexin V-FITC i 15 minutter ved romtemperatur i mørke og PI i iskald bindingsbuffer. Annexin V og /eller PI-positive celler ble talt opp ved hjelp av en FACS Calibur strømningscytometer.
Måling av ROS generasjon
Produksjonen av ROS ble målt ved flowcytometri med 2 «, 7»- dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) (Molecular probe-Life Technologies, Carlsbad, California) og mitokondrie superoxide indikator MitoSOX Red (Invitrogen) som prober. Kort sagt ble PANC-1-celler behandlet med SSHE inkubert med 10 pM av H2DCFDA eller 5 uM av MitoSOX Red i serumfritt DMEM i 10 minutter. Mediet ble fjernet, og cellene ble løsnet med en kort behandling med 0,25% trypsin i Hanks balanserte saltoppløsning. Etter tilsetning av ferskt kulturmedium, ble cellene oppsamlet ved sentrifugering, vasket en gang med DPBS og suspendert i DPBS. Fluorescens ble overvåket ved hjelp av FACSCalibur flowcytometer eller under en laser konfokal mikroskop (Fluoview FV1000, Olympus, Tokyo).
Western blotting
Celle ekstrakter ble utarbeidet av lyseceller med RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksykolat, 0,1% natrium-dodecyl-sulfat, 2 mM EDTA, protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor cocktail) på is i 20 min. Lysatene ble sentrifugert ved 12.000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble anvendt for etterfølgende analyser. SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og Immunoblotanalyse analyser ble utført som tidligere beskrevet [32]. De primære antistoffer som brukes var kanin monoklonalt anti-SQSTM1 /p62 (D5E2, 1: 1000 fortynning, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kanin polyklonale anti-LC3B (1: 1000 fortynning, Cell Signaling), kanin polyklonale anti-fosfo mTOR (S2481) (1: 1000 fortynning, Cell Signaling), kanin monoklonalt anti-mTOR (7C10, 1: 1000 fortynning, Cell Signaling), kanin monoklonalt anti-fosfor-AMPKα (t172) (40H9, 1: 1000 fortynning, Cell signalering), og kanin monoklonalt anti-AMPKα antistoff (23A3, 1: 1000 fortynning, Cell Signaling). De sekundære antistoff HRP-konjugert kanin eller anti-mus IgG (1: 3000 fortynning, Cell Signaling). For lasting kontroller, anti-β-aktin-antistoff (sc-47 778, 1: 3000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt. Signaler ble visualisert ved hjelp av ECL pluss (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Membranene ble skannet med en Luminoimaging Analyzer LAS4000 (GE Healthcare).
Immunofluorescent flekker
Panc-1 celler behandlet med løsemiddel alene eller SSHE ble fiksert med 4% formaldehyd /5% sukrose i DPBS i 20 minutter, renset med DPBS, og permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i DPBS i 4 min. I noen eksperimenter, ble cellene farget med 100 nM av MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) i 10 minutter før fiksering. Cellene ble blokkert med 3% BSA /0,1% glycin i DPBS i 1 time, vasket, og deretter inkubert med kanin-monoklonalt anti-AIF (D39D2, 1: 200 fortynning, Cell Signaling) eller kanin polyklonalt anti-LC3B-antistoff (1: 200 fortynning) i 1 time. Etter grundig vasking med DPBS ble cellene inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG (1: 300 fortynning, Invitrogen) i 1 time. Cellene ble kontra med DAPI og observert under et laser scanning konfokalt mikroskop.
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) analyse
Ubehandlet Panc-1 celler og celler behandlet med 200 ug /ml for SSHE 28 h ble plassert i 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i 30 mM HEPES-buffer (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl
2, pH 7,4) i 2 timer ved 4 ° C og post-fiksert med 1 % OsO
4 i 1 time ved 4 ° C. Prøvene var dehydrert med gradert alkohol og innebygd i TAAB812 harpiks (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, UK). Ultratynne snitt ble farget i 1 time i 3% vandig uranyl-acetat, vasket, og motfarget med 0,3% bly-citrat, og de ble undersøkt på et transmisjonselektronmikroskop (EM-002B, JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
GFP-LC3 plasmid og transfeksjon
EGFP-LC3B fusjon plasmid (PCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP) ble konstruert ved kloning LC3B cDNA, som ble forsterket av PCR, inn i en PCMX-SAH /Y145F-GFP vektor [33]. Konstruksjonen ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Panc-1 alen ble transient transfektert med plasmid hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble cellene eksponert for SSHE og undersøkt under en laser scanning confocal mikroskop.
Dyreforsøk
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av dyreforsøk. Protokollen ble godkjent av Izumo Campus Animal Care og bruk komité Shimane University (Permission Antall: IZ26-7). Alle musene ble plassert i dyrets sentrum av Shimane Universitetet DMF under spesielle patogenfrie frie betingelser ved en kontrollert temperatur på 23 ± 2 ° C, relativ fuktighet 55 ± 10%, og med 12 timer lys /12 timer mørke sykluser. De fikk mat og vann
ad libitum
. Mus ble undersøkt for deres helse under hele forsøksperioden minst en gang en dag etter tumorinjeksjon. Alle operasjoner ble utført under medetomidin (0,3 mg /kg) /midazolam (4,0 mg /kg) /butorfanol (5,0 mg /kg) anestesi. Mus ble normalt avlives av CO
2 inhalasjon på slutten av en studie. For peritoneal formidling modell, Panc02-Luc-ZsGreen celler (5×10
5 celler /mus) ble injisert intraperitonealt som en cellesuspensjon til 7 uker gamle mannlige C57BL /6 mus (Crea Japan, Tokyo, Japan), og ble musene randomisert og gruppert i kontrollgruppen (n = 8) og SSHE grupper (n = 8). De behandlingsregimer ble startet dagen etter tumorinokulasjon. Mus ble avlivet i en CO
2 kammeret når de var døende, målt ved en mangel på vedvarende målrettet respons på milde stimuli. All innsats inkludert subkutan injeksjon meloksikam (5 mg /kg) ble gjennomført for å redusere lidelse. Eksperimentet ble utført to ganger, og de kombinerte data ble underkastet analyser. For ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen, Panc-1-Luc-ZsGreen-celler (1×10
6 celler /mus) ble implantert med 50% Matrigel i bukspyttkjertelen av 6-ukers-gamle hunn nakne mus (BALB /c nu /nu, Japan SLC, Shizuoka, Japan) [32]. En uke etter injeksjonen ble de randomisert og gruppert i kontrollgruppen (n = 6) og SSHE grupper (n = 6). De behandlingsregimer ble startet en uke etter svulst injeksjon. For mus kolonkarsinom eksperimenter, LuM1-celler (3 x 10
5 celler) ble implantert subkutant i BALB /c-mus (n = 6 for kontroll og SSHE gruppe). Volumene av LuM1 svulster ble evaluert ved å måle to vinkelrette diametre med calipers. Tumor volum (V) ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: V =
(en
2
xb) /2
, der
et
er liten diameter og
b
stor diameter. I SSHE gruppen ble musene administrert intraperitonealt 80 mg /kg SSHE en gang daglig. I kontrollgruppen, ble musene administrert løsemiddel alene DPBS.
Bioluminescent avbildning
In vivo
bioluminescent avbildning ble utført ved hjelp av IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA). Alle mus ble injisert intraperitonealt med 150 mg /kg D-luciferin (Promega, Fitchburg, WI) og bedøvet med 2,5% isofluran. Ti minutter senere ble fotoner fra dyrenes hele kropper avbildes ved hjelp av IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences) i henhold til produsentens instruksjoner. Data ble analysert ved å leve image 2,50 programvare (Caliper Life Sciences).
Blood hematologi og biokjemi test
Mus ble bedøvet, og blod ble samlet fra hjertet. Perifere blodprofiler ble analysert av Sysmex KX-21NV automatisert hematologimaskin (Sysmex, Kobe, Japan). Nivåene av hvite blodceller (WBC), røde blodceller (RBC), blodplater (PLT), hemoglobin (HGB), hematokrit (HCT), midlere blodlegemevolum (MCV), midlere blodlegemehemoglobin (MCH), og midlere blodlegemehemoglobin konsentrasjon (MCHC) ble undersøkt. Glukose (Glu) nivåer, total kolesterol (T-Cho) nivåer, alaninaminotransferase (ALAT) og aspartat aminotransferase (AST) nivåer, og blod urea nitrogen (BUN) nivåene ble analysert med en automatisert analysator for klinisk kjemi, SPOTCHEM EZ SP- 4430 (Arkray, Inc., Kyoto, Japan), ved hjelp av SPOTCHEM II-teststrimler.
omvendt-fase væskekromatografi (HPLC)
væske~~POS=TRUNC kromatografiske separasjoner ble oppnådd ved anvendelse av en reversfase C- -18, 3 um, 2,4 x 250 mm kolonne (Cosmosil. NAKARAI tesque, Inc., Kyoto, Japan) ved en strømningshastighet på 1 ml /min. Den mobile fase var 70% metanol. Elueringsprofilen ble overvåket ved hjelp av UV-spektrofotometri ved 228 nm.
Statistisk analyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikant sammenheng mellom datasettene ble testet av uparede Student
t
test. Survival of mus ble analysert ved bruk av log-rank test. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
SSHE hemmer cellesyklusprogresjon og induserer død av bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Behandling av Panc-1 celler med SSHE for 20 timer resulterte i en arrest i G0 /G1-fasen av cellesyklus (figur 1A). En økning i subG1 brøkdel, en funksjon av apoptose, var marginal. SSHE slutt indusert død Panc-1 celler og andre humane og mus bukspyttkjertelcancercellelinjer (figur 1B). Normale celler slik som HUVEC og HPAEpiC var mer resistente mot SSHE i forhold til Panc-1-celler (figur 1C). Ved de senere stadier av celledød av Panc-1 celler, fokal plasmamembranen brudd og krymping av kjernen var tydelige (Fig 1 D). Det bør bemerkes at fragmentering av kjernen, en annen funksjon av apoptose, ble sjelden observert på dette stadiet. SSHE var også effektiv i å indusere død av Panc-1-celler i henhold til hypoksiske betingelser (figur 1E). Det også forårsaket en betydelig veksthemming og død i en rekke andre tumorcellelinjer, for eksempel kolonkreft, magekreft, lungekreft, brystkreft, leukemi, osteosarkom, hepatoma, livmorhalskreft og fibrosarcoma (S1 figur).
(A) Celle syklus. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene, til 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer, fiksert, farget med PI, og deretter underkastet cytometri. (B) Celleviabilitet. Bukspyttkjertelcancercellelinjer ble behandlet med bærer alene eller i forskjellige konsentrasjoner av SSHE i 42 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. barer; SD. (C) Virkning av SSHE på normale celler. HUVEC, HPAEpiC og Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene eller 100 ug /ml SSHE i 38 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. barer; SD. (D) Morfologi. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene (venstre) eller 200 ug /ml SSHE i 40 timer (til høyre). (E) Effekt av SSHE på Panc-1-celler under hypoksiske betingelser. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene eller i forskjellige konsentrasjoner av SSHE til 42 timer. Celleviabilitet ble bestemt av MTT-analysen.
SSHE induserer autotic celledød i stedet for apoptose eller necroptosis i Panc-1 celler
For å undersøke mekanisme hvor SSHE indusert død Panc -1 celler, vi undersøkt ulike markører for apoptotiske celler. JC-1-analysen viste en markant reduksjon av mitokondrier membranpotensialet etter SSHE behandling (figur 2A). Annexin V /PI farging viste også en økning i prosentandelen av annexin V-positive og /eller PI-positive celler, avhengig av konsentrasjonen av SSHE (figur 2B). Men den pan-caspase inhibitor zVAD-FMK ikke bøte celle overlevelse (figur 2C). Dessuten spaltes caspase 3 var nesten ikke påvisbar etter behandling med 200 ug /ml SSHE i 24 timer. Etter behandling SSHE, ble nesten 30% av cellene PI positiv, mens behandling av cellene med pifithrin-μ og TRAIL aktivert caspase-3 (figur 2D), som sammenfaller med en tidligere rapport [34]. Basert på data som tyder på at SSHE verken økte andelen av subG1 fraksjonen (fig 1A) eller indusert fragmentering av kjerner (Fig 1D), kunne vi ikke få konkrete bevis for apoptose i SSHE-behandlede Panc-1 celler. I tillegg translokasjon av apoptose-induserende faktor (AIF), en mitokondriell caspase-uavhengig død effektor, inn i kjernen var ikke åpenbar (figur S2), og necrostatin-1, en inhibitor av RIP1 kinase-mediert necroptosis, mislyktes i å forhindre SSHE- indusert celledød (S2 fig). Således ble hverken mitokondrier-uavhengig apoptose eller necroptosis involvert i SSHE-indusert celledød.
(A) Mitokondriell membranpotensialet. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer og deretter underkastet den JC-1-assay. Friske celler med funksjonelle mitokondrier som inneholder røde JC-1 J-aggregater og apoptotiske eller usunn celler med kollapsede mitokondrier som inneholder hovedsakelig grønne JC-1 monomere ble oppdaget av cytometri. (B) Annexin V /PI farging. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 24 timer og deretter underkastet annexin V /PI farging. (C) Virkning av zVAD-FMK (zVAD) på SSHE-indusert celledød. Panc-1-celler ble inkubert i 42 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. barer; SD. (D) Caspase-3 aktivering. Panc-1-celler ble inkubert med 200 pg /ml SSHE i forskjellige tidsperioder, eller behandlet med 10 uM pifithrin-μ og 100 ng /ml TRAIL i 60 timer (tjente som positiv kontroll). Cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse med anti-kaspase 3 antistoff.
På den annen side, SSHE markert øket den LC3-II /LC3-l-forhold, en indikator på autophagosome dannelse, i en dose- og tidsavhengig måte. SSHE også redusert SQSTM1 /P62 protein nivåer, en av de spesifikke substrater degradert gjennom autofagi-lysosomal sti, i Panc-1 celler (figur 3A og 3B). SSHE aktivert AMPK, en positiv regulator av autophagy, og hemmet mTOR, en negativ regulator autophagic (figur 3C og 3D). De autofagi hemmere 3-metyladenin og klorokin delvis forhindret celledød (Fig 3E). Morfologisk SSHE-behandlede celler viste massiv vacuolization av cytoplasma omtrent 24 timer etter behandlingen (figur 4A). Disse cytoplasmatiske vakuoler var sannsynlig autophagosomes fordi GFP-LC3 puncta dukket opp etter behandling med SSHE (fig 4B). Noen LC3 puncta ble samlokalisert med MitoTracker-positive mitokondrier i celler behandlet med 100 ug /ml SSHE i 20 timer, noe som tyder på at forekomsten av mitophagy (figur 4C). Således virket SSHE-indusert celledød å være autophagic celledød. Imidlertid analyser TEM 28 timer etter behandlingen viste SSHE elektrontette vakuoler mitokondrier, tomme og fokal perinukleært svelling (figur 4D), som ikke observeres i klassisk type autofagi [35]. Dermed konkluderte vi med at SSHE-indusert celledød var caspase-uavhengig og lignet autofagi celledød. Denne formen for celledød sammenfaller godt med autosis, en nylig preget Na
+, K
+ – ATPase-regulert form for celledød [36]. Dessverre, fordi hjerteglykosidet digoksin, en motstander av Na
+, K
+ – ATPase som er rapportert å hemme autosis [36], var for cytotoksisk til Panc-1 celler, vi kunne ikke evaluere effekten på SSHE-indusert celledød.
(A) Virkning av SSHE på ekspresjonen av autophagy-relaterte proteiner. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 24 timer. Cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse med anti-SQSTM1 /p62 eller anti-LC3 antistoff. P-Actin fungert som en lasting kontroll. (B) Time-forløpet av omdannelsen av LC3-I til LC3-II. Panc-1-cellene ble behandlet med 200 ug /ml SSHE i de angitte tidsrom. (C) AMPK og mTOR uttrykk. Panc-1-cellene ble behandlet med 200 ug /ml SSHE i forskjellige tidsrom. Cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse med anti-AMPK, anti-fosfo-AMPK-antistoff, anti-mTOR, eller anti-fosfo-mTOR. P-Actin fungert som en lasting kontroll. (D) AMPK aktivering og mTOR-hemming SSHE. Intensiteten av båndene i (C) ble kvantifisert ved Bilde J programvare. (E) Virkning av 3-metyladenin (3-MA) og klorokin (CQ) på SSHE-indusert celledød. Panc-1-cellene ble behandlet med SSHE ved den angitte konsentrasjon i fravær eller nærvær av 10 pM 3-MA (venstre) eller 40 pM CQ i 42 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Western blot bilder (A-C) har blitt beskåret for presentasjon. Bilder i full størrelse er presentert i S13 Fig barer; SD.
(A) Phase kontrast. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene eller 100 ug /ml SSHE i 40 timer. barer; 100 um. (B) LC-3 puncta. PANC-1-celler transfektert med PCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP-vektoren ble behandlet med vehikkel alene eller 100 ug /ml SSHE i 24 t og ble observert under et konfokalt lasers mikroskop. barer; 20 um. (C) Dobbelt farging med MitoTracker og anti-LC3 antistoff. Panc-1-cellene ble behandlet med bærer alene, 100 ug /ml eller 200 ug /ml SSHE i 24 timer, farget med 100 nM av MitoTracker Red i 10 minutter, løst, og deretter bearbeidet for LC3 immunofarging. barer; 20 um. (D) ultrastructure. Panc-1-celler behandlet bærer alene eller sammen med 200 ug /ml SSHE i 28 timer ble behandlet for TEM-analyse. Original forstørrelse, x2,500. PC, perinukleær plass.
Mitokondriell ROS generasjon er involvert i SSHE-indusert celledød
Endringer i ROS generasjon, som vurderes av H2DCFDA farging, etter behandling av Panc-1 celler med SSHE viste en bifasisk mønster. På et tidlig stadium (ca. 10 h), ble ROS generasjon hemmet av SSHE (S3 Fig). Men forlenget behandling resulterte i en sterk økning i ROS generasjon (figur 5A og 5B). MitoSOX Red flekker viste også økt produksjon av mitokondrie superoksid (S4 fig). Den antioksidanten N-acetylcystein (NAC) betydelig svekket celledød indusert av SSHE som vurderes av trypan blått fargestoff utelukkelse test (figur 5C). Disse resultatene antydet ROS generering som en årsak til SSHE-indusert celledød.
(A) Panc-1-celler behandlet med bærer alene, 100 ug /ml SSHE eller 200 ug /ml SSHE i 20 timer ble farget med 10 uM H2DCFDA i 10 minutter og umiddelbart observert under et konfokalt lasers mikroskop. (B) Panc-1-celler behandlet som i A ble utsatt for cytometri. (C) Virkning av NAC på SSHE-indusert celledød. Panc-1-cellene ble behandlet med 200 ug /ml SSHE i nærvær eller fravær av 10 mM NAC i 42 timer. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved en trypan blått fargestoff utelukkelse test. barer; SD.
Mitokondrier er rapportert å være den viktigste kilden til ROS nødvendig for autofagi induksjon [37]. For å undersøke om mitokondrie ROS spille en rolle i SSHE-indusert autotic celledød, benyttet vi mitokondrie-DNA (mtDNA)-mindre ρ
0P29 celler som er avledet fra Lewis lungekarsinom P29 celler og P29mtP29 celler som ble etablert av å gjeninnføre vill skriver mtDNA inn ρ
0P29 celler. Når ρ
0P29 celler ble behandlet med SSHE de knapt produsert ROS, mens P29mtP29 celler tilstrekkelig produsert ROS (S5 fig). Interessant, ρ
0P29 celler ble avslørt for å være motstandsdyktig mot SSHE sammenlignet med P29mtP29 celler (S5 Fig).
SSHE forsinker tumorvekst av kreft i bukspyttkjertelen
Når Panc02-Luc-ZsGreen celler (5 x 10
5 celler) ble intraperitonealt transplantert inn i C57BL /6 mus, har de en tendens til å danne spres noduler fortrinnsvis omkring bukspyttkjertelen og på peritoneal overflate, og musene utviklet ascites (ca. 2,4 ml /mus når døende) ( S6 fig). Vi undersøkte den terapeutiske effekten av SSHE i denne peritoneal formidling modell.
