Abstract
Vi demonstrerte for første gang en fremragende evne til å mediere rosiglitazon en dyp forbedring av LA-12-indusert apoptose i forbindelse med aktivering av mitokondrisk veien i humane tarmkreftceller. Denne effekten ble observert fortrinnsvis i G1 cellesyklus fase, uavhengig av p53 og PPARy-proteiner, og sammen med vesentlige endringer av utvalgte Bcl-2-familien proteinnivåer. Ytterligere stimulering av samarbeidende synergisk cytotoksiske virkningen av rosiglitazon og LA-12 ble vist i cellene mangelfulle for PTEN, hvor mitokondrie apoptotisk veien var mer stimulert og G1-fase-forbundet døende ble forsterket. Våre resultater tyder på at kombinert behandling med rosiglitazon og LA-12 kan være lovende kreft strategi i kolon-avledet svulster uavhengig av p53 status, og også gunstig i de defekte PTEN funksjon
Citation. Lauková J, Kozubík A, Hofmanová J, Nekvindová J, Sova P, Moyer MP, et al. (2015) Tap av PTEN Forenkler Rosiglitazon-mediert Forbedring av Platinum (IV) Complex LA-12-indusert apoptose i kolon kreftceller. PLoS ONE 10 (10): e0141020. doi: 10,1371 /journal.pone.0141020
Redaktør: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, USA
mottatt: 4 mai 2015; Godkjent: 02.10.2015; Publisert: 22 oktober 2015
Copyright: © 2015 Lauková et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den tsjekkiske Science Foundation (15-06650S) (https://www.gacr.cz, AHV) og IGA i departementet Helse av Tsjekkia (NT 11201-5 /2010) (https://iga.mzcr.cz, AK). Platinum Pharmaceuticals, A.S. (Dr. Petr Sova) og Incell Corporation LLC (Dr. Mary Pat Moyer) gitt støtte i form av forskningsmateriale, og deres spesifikke rolle er også indikert i Kunstner Bidrag delen av den elektroniske skjema for innsending.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Petr Sova er en ansatt i selskapet som eier immaterielle rettigheter i forbindelse LA-12 og medforfatter av patenter innen LA-12. Mary Pat Moyer er en ansatt i selskapet eie immaterielle rettigheter vedrørende NCM460 cellelinje. Disse kommersielle bevisn endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
introduksjon til
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ (PPARy) er et medlem av atom hormonreseptor superfamilie av ligand-aktiverte transkripsjonsfaktorer som er involvert i reguleringen av energimetabolismen, kreftutvikling og anti-inflammatoriske respons [1]. Selv om en hovedrolle av PPARy er vist i adipocyttdifferensiering og insulin allergi [2], er PPARy også kjent for å påvirke vekst og cellesyklus [3, 4], differensiering [5] og apoptose [6] av forskjellige typer av kreftceller, inkludert tykktarmen. Tilsvarende som i adipocytter er PPARy uttrykk også opprettholdt på et relativt høyt nivå i mange menneskers tykktarmskreft cellelinjer og primære colontumorer [7]. Mutasjonene av PPARy genet har blitt rapportert som sjelden hendelse i humane maligniteter inkludert kolon [8]. Det har blitt foreslått at PPARy-indusert genregulering kan bidra til tumorgenese, men betydningen av denne reseptoren bane i tykktarmskreftutvikling og behandling fremdeles kontroversiell.
Rosiglitazon, en syntetisk ligand av PPARy er en mye brukt anti -diabetic agent fra familien av legemidler som kalles tiazolidindioner. På grunn av sin evne til å hemme proliferasjon og /eller induserer kreft celledød, har rosiglitazon også vært undersøkt i en rekke studier som fokuserer på kreftbehandling. Selv om en utilstrekkelig antitumoreffektivitet av rosiglitazon har blitt vist i mange tilfeller når de anvendes i monoterapi, har dens lovende potensial som en adjuvans i kombinasjon med stråling [9] eller ulike typer antineoplastiske midler er rapportert. Rosiglitazon forbedret tykktarmskreftcelle følsomhet for de cytotoksiske effekter av 5-FU [10], cytokin TRAIL [11] eller all-trans-retinsyre [12]. Interessant, har additiv /synergicanticancer effekten av rosiglitazon og konvensjonelt brukt platinabaserte legemidler cisplatin eller karboplatin blitt demonstrert i tykktarm, lunge eller eggstokkreft cellelinjer
in vitro product: [13, 14]. Kombinasjon av carboplatin og rosiglitazon reduserte forekomsten av polypp dannelse hos mus modell av azoxymethane-indusert tykktarmskreftutvikling [13], tumorstørrelsen i hårløse mus med subkutant injisert A549 lungekreft celle-stammer xenografter [13] eller indusert en regresjon av K- Ras-drevet muselunge adenokarsinomer [14]. Forbehandling med rosiglitazon synergized også anticancer aktivitet av cisplatin i DMBA-indusert brystsvulster hos rotter [15]. Selv om noen molekylære mekanismene bak disse effektene har blitt foreslått, mange av dem fortsatt gjenstår å avklare. Videre er en fullstendig mangel på informasjon som finnes om de potensielle samarbeids kreft effekter av rosiglitazon med nye platinabaserte cellegifter.
LA-12, (OC-6-43) bis (acetato) (1- adamantylamin) amminedichloroplatinum (IV), representerer et nylig introdusert platina (IV) kompleks som inneholder en voluminøs hydrofob ligand 1-adamantylamin, slik at dens høyere hydrofobe egenskaper sammenlignet med andre platinabaserte medikamenter som cisplatin [16]. Handlingen av LA-12 har blitt nøye studert av oss og andre både
in vitro Hotell og
in vivo
, og resultatene fremhevet sin gunstige kreft potensial over flere konvensjonelt brukes platinabaserte cellegifter [17]. LA-12 hatt en sterk cytotoksisk effekt i ulike cisplatin-resistente kreftcellelinjer av ulik opprinnelse inkludert kolon [18-20]. I tillegg kunne LA-12 overvinne konfluens avhengig motstand av tykktarmskreftceller som ble beskrevet i platina (II) forbindelser cisplatin og oxaliplatin [21]. Vi har videre vist at en høyere effektivitet av LA-12 i kolon kreftceller ble knyttet til evnen til å overvinne den blokken M-fase entry utløst av oxaliplatin for å reparere den cellulære skader [22]. Nylig rapporterte vi på et høyere /unik evne til LA-12 sammenlignet med cisplatin for å indusere oppregulering av flere viktige proteiner involvert i apoptose regulering som Noxa, Bim, c-myc eller DR5 [23, 24]. Videre har den cellulært opptak av LA-12 er vist raskere og mer effektivt i forhold til cisplatin i human ikke-småcellet lungekarsinom [25]. Lovende kreft egenskaper av LA-12 ble også demonstrert
in vivo
i nakne mus med menneskekreft xenografter av tykktarm, prostata og eggstokkreft opprinnelse, der LA-12 var mer effektive i tumor eliminering forhold til satraplatin [26]. Men verken de detaljerte molekylære mekanismene som er involvert i celle og cytostatisk virkning av LA-12 i tykktarm kreft celler er fortsatt fullt ut forstått, og heller ikke er dens potensielle bruksområder i kombinasjonsbehandling.
I denne studien, var vi de første å demonstrere evne rosiglitazon å stimulere antiproliferativ og apoptotisk respons utløst av LA-12 i HCT116 menneskelige kolon adenokarcinomceller. Vi undersøkte de molekylære mekanismene som er ansvarlig for samarbeidende handling av narkotika, med et særlig fokus på modulering av cellesyklusprogresjon, PTEN involvering og aktivering av mitokondrie apoptotiske sti. Den cytotoksiske respons utløst ved kombinasjonen av rosiglitazon og LA-12 ble også undersøkt i andre koloncancercellelinjer og celler avledet fra normal tykktarm epitel.
Materialer og metoder
Cell Culture og behandlinger
Menneskelig colon adenokarsinom cellelinjer HCT116 vekt (p53
+ /+, Bax
+/-, Chk2
+ /+, PTEN
+ /+), p53
– /-, Bax
– /-, Chk2
– /- og PTEN
– /- (hentet fra professor Bert Vogel, John Hopkins University, Baltimore, MD, USA, og T. Waldman , Georgetown University School of Medicine, Washington, USA, i 2007) [27] [28] ble opprettholdt i McCoy’s 5A medium (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, USA), supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml) og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike og Gibco, Invitrogen). Menneskelige kolon adenokarcinomceller DLD-1 (ATCC, CCL-221, oppnådd i 2009) ble og RKO (ATCC, CRL-2577, oppnådde i 2007) opprettholdt i RPMI eller DMEM (begge Gibco, Invitrogen, Life Technologies), henholdsvis, supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml) og 10% FBS. Den NCM460 voksent menneske normal tykktarm epitel-avledet cellelinje ble mottatt (i 2010) av en materialoverdragelse med Incell Corporation (San Antonio, Texas, USA) [29], og rutinemessig spredte under standardbetingelser i M3: 10TM mellom (Incell Selskap). Cellene ble dyrket i TPP (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sveits) dyrking retter, kolber eller plater i en fuktet inkubator ved 37 ° C i atmosfære av 5% CO
2, passert to ganger i uken etter eksponering for EDTA /PBS og trypsin løsninger. Antall celler ble bestemt ved hjelp av en casy Modell TT-celleteller og Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).
Tjuefire timer etter seeding, ble cellene forbehandlet (24 h) med 50 mikrometer rosiglitazon (RGZ ) (5 – [[4- [2- (metyl-2-pyridinylamino) etoksy] fenyl] metyl] -2,4-tiazolidindion, Cayman Chemical, Michigan, USA) og ble deretter behandlet (48 h) med 0,75 uM LA- 12 ([(OC-6-43) bis (acetato) (1-adamantylamin) aminedichloroplatinum (IV)], Platinum Pharmaceuticals, som, Brno, Tsjekkia). MEK1 /2 Inhibitor U0126 (# 9903, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK (# 550377, BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, USA) ble lagt til cellene en h før behandling med RGZ. Stamløsninger ble fortynnet i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich, Praha, Tsjekkia).
Cell Transfeksjon og RNA interferens
RNA transfections ble utført ved hjelp av X-tremeGENE siRNA Transfeksjon Reagens (Roche, Basel, Sveits) eller Lipofectamine ™ 2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens anbefalinger. Celler ble sådd ut i McCoys medium med 10% FBS, uten antibiotika og inkubert over natten. Kort tid før transfeksjon medium ble endret for Opti-MEM® jeg Redusert Serum Medium (Gibco, Invitrogen). Cellene ble transfektert med 100 nM siRNA tomannsboliger rettet mot PPARy (# 29455, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) eller ikke-target kontroll siRNA (# 37007, Santa Cruz Biotechnology). Etter 4 timer ble mediet forandret til McCoys medium med 10% FBS (PAA Laboratories GmbH og Gibco, Invitrogen) med antibiotika. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene forbehandlet (24 h) med RGZ og deretter behandlet (48 h) med LA-12.
Immunoblotting analyse
Cellene ble lysert i 1% SDS lysebuffer inneholdende protease inhibitor cocktail (# P2714, Sigma-Aldrich) eller protease inhibitor cocktail Set i (# 5391313, Calbiochem, Merck Millipore, Bedford, MA, USA), for fosfoprotein påvisning NAVO
4 og NaF ble tilsatt til lysis løsning. DC ™ Protein Assay (# 500-0113, Bio-Rad Laboratories, Praha, Tsjekkia) ble brukt for protein kvantifisering. Proteiner ble deretter separert på 15% SDS-polyakrylamidgel og blottet på en PVDF-membran (Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Membranene ble blokkert i 5% fettfri melk eller BSA i 1 time ved RT, vasket med TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 0,1% Tween), og inkubert over natten i primære antistoffer fortynnet i 5% ikke- lettmelk ved 4 ° C. Immundeteksjon ble utført ved bruk av følgende primære antistoffer: monoklonalt mus anti-p53 (1: 000, DO-1, # 126) dannet mot aminosyrene 11-25 av p53 av human opprinnelse, polyklonalt kanin-anti-Akt (1: 500, # 8312) mot aminosyrene 345-480 av akt1 av human opprinnelse, monoklonalt mus anti-cyklin B1 (1: 1000, # 245) mot et rekombinant protein som tilsvarer human cyklin B1, monoklonalt mus anti-Cyclin D1 (1: 1000, # 20044) mot rekombinant full lengde humant protein, monoklonalt mus anti-PTEN (1: 500, # 7974) mot aminosyrene 388-400 av PTEN av human opprinnelse, polyklonalt kanin anti-P21 (1: 000, # 397) dannet mot en peptidkartlegging ved den C-terminale ende av p21 av human opprinnelse, polyklonalt kanin-anti-p27 (1: 1000, # 528) frembrakt mot en peptidkartlegging ved den C-terminale ende av p27 av human opprinnelse (alle fra Santa Cruz Biotechnology), polyklonalt kanin-anti-fosfo-Akt (Ser473) (1: 500, # 9271) fremstilt ved å immunisere dyr med en syntetisk fosfo-peptid svarende til rester som omgir Ser473 av mus Akt-renset ved hjelp av protein A, polyklonalt kanin anti-Bak (1: 1000, # 3792) fremstilt ved immunisering av kaniner med et syntetisk peptid (KLH-koblet) som svarer til den amino-terminale rester av humant Bak-renset ved hjelp av protein A, polyklonalt kanin anti-Bax (1: 1000, # 2772) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid (KLH-koblet) svarende til de amino-terminale rester av humant Bax-renset ved protein A, polyklonalt kanin anti-Bud (1: 1000, # 2002) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid (KLH- koplet) svarende til rester rundt spaltningssetet til human Bid-renset ved hjelp av protein A, monoklonalt kanin anti-Bim (1: 1000, # 2933) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid svarende til rester som omgir Pro25 av Bim, monoklonalt mus anti -Chk2 (1: 000, # 3440) fremstilt ved å immunisere dyr med avkortet rekombinant GST-Chk2, polyklonalt kanin-anti-spaltet caspase-3 (1: 500, # 9661) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid svarende til amino-terminal rester som grenser til (Asp175) i humant caspase-3, polyklonalt kanin-anti-spaltet caspase-9 (1: 500, # 9505) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid som tilsvarer aminoenden ester som omgir til Asp330 av human caspase-9 – renset ved hjelp av protein A, polyklonalt kanin anti-ERK (1: 1000, # 9102) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid (KLH-koblet) avledet fra en sekvens i den C-terminale ende av rotte P44 MAP kinase-renset ved hjelp av protein A , polyklonalt kanin-anti-fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (1: 1000, # 9101) fremstilt ved å immunisere dyr med en syntetisk fosfo-peptid svarende til rester som omgir Thr202 /Tyr204 av human P44 MAP kinase-renset ved hjelp av protein A , polyklonalt kanin-anti-spaltet PARP (Asp214) (1: 1000, # 9541) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid svarende til carboxyenden rester som omgir Asp214 i human PARP-renset ved hjelp av protein A, polyklonalt kanin anti-peroksisom proliferator- aktivert reseptor γ (PPARy) (1: 500, # 2435) som er produsert ved immunisering av kaniner med et syntetisk peptid svarende til rester som omgir Asp69 av humant PPARy, polyklonalt kanin-anti-Puma (1: 1000, # 4976), produsert ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid svarende til den karboksy-terminale region av human Puma-renset ved hjelp av protein A, monoklonalt kanin anti-survivin (1: 1000, # 2808) fremstilt ved å immunisere dyr med et syntetisk peptid svarende til rester som omgir cystein 60 av humant survivin ( alt fra Cell Signaling Technology), mus monoklonalt anti-Noxa (OP180; Calbiochem-MERC, Praha, Tsjekkia) med immunogen av GST-fusjon med humant rekombinant Noxa, mus anti-cytokrom c (1: 500, # 556433, BD Pharmingen ™, San Jose, USA) med syntetiske peptider av due cytokrom c som immunogen, monoklonalt mus anti-kompleks IV subenheten II (anti-cyt oksidase subenheten II) (# A-6404, Invitrogen ™, Life Technologies) med menneskelig kompleks IV subenhet II som immunogen. Membranene ble deretter vasket og inkubert med sekundære antistoffer-anti-mus IgG (1: 3000, # NA931) og anti-kanin-IgG-antistoff (1: 3000, # NA934) (begge fra Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) for 1 time ved RT. Påvisning av antistoffkompleksene ble utført med pepperrot peroksydase-substrater Immobilon vestlige Chemiluminescent HRP-substrat (# WBKLS0500, Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Anti-β-aktin-antistoff (1: 5000, A5441, Sigma-Aldrich), med noe modifisert β-cytoplasmisk aktin N-terminalt peptid, Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile- Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys, konjugert til KLH som immunogen, ble anvendt for en lasting kontroll.
Fremstilling av cellefraksjoner
cellene ble høstet ved trypsinering, sentrifugert ved 200 g i 5 minutter, resuspendert i fraksjon buffer (150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 5 mM Tris og 0,01% digitonin pH 7,2-7,4) og etterlatt i romtemperatur i 20 minutter for å lyse. Lyserte celler ble sentrifugert ved 13 000 rpm, ble supernatantene anvendt for cytoplasmatiske fraksjoner og pelletene ble resuspendert i den samme mengde av fraksjon buffer blandet med 4x Laemmlli buffer, kokt i 10 minutter, og prøvene etter protein kvantifisering ble anvendt i immunblotanalyse.
Analyse av mitokondriemembranen potensial (MMP)
Påvisning av MMP ble utført ved hjelp av 0,2 mikrometer tetramethylrhodamine etyl ester perklorat (TMRE Molecular Probes®, Eugene, OR, USA) som beskrevet tidligere [30] og analysert ved hjelp av flowcytometri (FACS Calibur
TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Dataene ble evaluert av Cellquest-programvare (Becton Dickinson) og resultatene ble uttrykt som prosenter av cellene med nedsatt MMP.
Annexin V /propidiumjodid- apoptose analysen
For eksternalisering av fosfatidylserin som en markør for apoptose, ble cellene høstet, vasket med PBS og farget med annexin V FITC-konjugert antistoff (# ANXV-FT100, Apronex, Praha, Tsjekkia) i 20 min i RT med produserer «bestemt medfølgende buffer. Like før analyse, 5 ug /ml propidiumjodid (PI) (# P-4170, Sigma-Aldrich) ble tilsatt. Fluorescens ble deretter målt ved hjelp av flow cytometer (FACS Calibur
TM, Becton Dickinson). Ved hjelp av celle quest programvare, ble resultatene uttrykt som prosent av cellene som var positive for annexin V og negative for propidiumjodid (apoptotisk).
cellesyklusanalyse
Cellene ble behandlet som beskrevet tidligere [22] og analysert ved flowcytometri (FACSVerse
TM, Becton Dickinson); minst 20 000 hendelser ble oppsamlet per prøve. Data ble analysert ved hjelp ModFit LT versjon 3.1 programvare (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Rusk og doublet celler ble utelukket, og bare enkeltceller ble tatt for cellesyklusanalyse. Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av cellene i G1, S og G2 /M-fasen.
aktiv caspase-3 deteksjon
Cellene ble høstet, vasket i PBS, fiksert og farget ved bruk av FITC aktiv caspase-3 apoptose kit (# 550480, BD Pharmingen ™) i henhold til produsentens protokoll. Prosentandelen av celler med aktiv caspase-3 ble detektert ved strømningscytometri (FACS Vers
TM, Becton Dickinson) og analysert ved hjelp av BD FACSuite programvare versjon 1.0.5 (Becton Dickinson).
Samtidig påvisning av aktive caspase-3, og cellesyklusprogresjon
cellene ble høstet, vasket i PBS, fiksert og farget ved bruk av FITC aktiv caspase-3 apoptose kit (# 550480, BD Pharmingen ™) i henhold til produsentens protokoll. Deretter ble cellene vasket og farget med propidiumjodid for cellesyklusanalyse som beskrevet ovenfor. Prosentandelen av celler i G1, S og G2 /M fase med aktiv caspase-3 ble detektert ved strømningscytometri (FACS Vers
TM, Becton Dickinson) og analysert ved hjelp av BD FACSuite programvare versjon 1.0.5 (Becton Dickinson).
RNA isolering og real-time RT-PCR
RNA isolering.
Umiddelbart etter samlingen, 1×10
6 celler ble resuspendert i 200 mL PBS, homogenisert i 400 ul kit Lysis /bindingsbuffer og frosset ved -80 ° C inntil tiden for RNA-isolering. Total RNA isolering ble utført med høy Pure RNA Isolation Kit (Roche, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA mengde og renhet ble bestemt ved UV-spektroskopi og en målt andel av RNA ble transkribert til cDNA omvendt.
cDNA-syntese.
cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved Transcriptor First Strand cDNA- Synthesis kit (Roche, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner hjelp av medfølgende oligo-dT primere (1 mL) og tilfeldig heksamerprimere (2 pl) på et totalvolum på 20 ul.
real-Time kvantitativ PCR.
0,5 mL av hver cDNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ PCR hjelp TaqMan Gene Expression Master Mix og TaqMan genuttrykk analyser (Life Technologies, USA) CCND1, cyclin D1 (Hs00765553_m1), BIRC5, survivin (Hs04194392_s1), CDKN1A, p21 (Hs00355782_m1), CDKN1B, p27 (Hs01597588_m1), CCNB1, cyclin B1 (Hs01030099_m1), HPRT1 (Hs99999909_m1) i henhold til produsentens instruksjoner i et totalt reaksjonsvolum på 10 pl. Alle PCR-reaksjoner ble utført i tre tekniske replikater på RotorGene 6000 instrument (Corbett Life Science, Australia). PCR termiske profilen var som følger: 50 ° C i 2 min (UDG inkubasjon), 95 ° C i 10 min (enzymaktivering), etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. NTC og RT-kontroller ble inkludert i hver kjøring. Dataanalyse ble utført ved hjelp av ddCt metoden med HPRT1 brukes som husholdningsgenet.
Statistiske data analyse
Data er uttrykt som middelverdi +/- S.E.M. av tre uavhengige forsøk, og statistisk analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Fishers Least signifikant forskjell (LSD) test med statistisk signifikans p 0,05, bruker Statistica for Windows-programvare, V 10 (Statsoft, Inc., Tulsa, OK, USA) .
for å undersøke nærmere det interaktive (synergisme eller additivitet) cytotoksiske effekter mellom stoffene, resultatene av apoptose analyse (annexin V /propidiumjodid-analyse, strømningscytometri, andel av annexin V positiv, propidium jodid negative HCT116-celler) etter behandling med flere forskjellige doser av rosiglitazon (opptil 75 mm) og LA-12 (opp til 1,5 mikrometer) eller kombinasjoner ble undersøkt. Bygging av regresjonskurver og beregning av equieffective mengder av agenter i blandingen ble gjort ved hjelp av isobolographic analyse i GraphPad Prism 6 programvare. Stoffet doser som er tilstrekkelige for synergistisk effekt ble beregnet og typen av responsen ble bestemt.
Resultatene
RGZ forbedret HCT116 human colon cancer cell følsomhet for LA-12-indusert caspase-avhengig apoptose
Forbehandling av HCT116 vekt- human adenokarsinom-cellelinje med rosiglitazon effektivt stimulerte LA-12-indusert apoptose, som demonstrert ved signifikant økning i prosentandel av cellene med spesifikke fosfatidylserin eksternalisering (figur 1A; S1 figur), og spalting av caspase-3 og dets substrat PARP (figur 1B). En isobolographic analyse av apoptotisk respons på HCT116-celler til flere forskjellige doser av rosiglitazon og LA-12 anvendt i kombinasjon (se Materialer og metoder) klart demonstrert en signifikant synergistisk effekt (data ikke vist). Ved hjelp av en pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK, fikk vi bekreftet at de apoptotiske virkningene av stoffet kombinasjonen fullt avhengig caspaseaktivering (Fig 1A og 1B). Den betydelige stimulering av apoptotiske effekter (fosfatidylserin eksternalise) indusert av LA-12 og rosiglitazon kombinasjonen sammenlignet med de individuelle stoffene ble også påvist i human tykktarm adenocarconima DLD-1 og RKO cellelinjer (figur 1C).
(a) Prosentandel av apoptotisk (annexin V positiv /propidiumjodid negativ, strømningscytometri) HCT116 wT-celler og (b) spalting av kaspase-3 og PARP (Western blotting) etter forbehandling (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 pM) og etterfølgende behandling (48 timer) med LA-12 (0,75 uM), i fravær (DMSO) eller nærvær av Z-VAD-FMK (10 uM). (C) Prosent av apoptotisk (annexin V positive /propidiumjodid negativ, flowcytometri) RKO eller DLD1 celler etter forbehandling (24 timer) med rosiglitazon (RGZ, 50 mm) og påfølgende behandling (48 h) med LA-12 (0,75 mikrometer ). Resultatene er midler + standardavvik eller representanter for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans: P 0.05, * versus kontroll, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for med /uten z-VAD-FMK.
Mitokondrier spiller en uunnværlig rolle i forbedring av HCT116 celle apoptose etter deres kombinert behandling med rosiglitazon og LA-12
apoptotiske respons på HCT116 wT celler behandlet med kombinasjonen av rosiglitazon og LA-12 er forbundet med stimulering av mitokondriell reaksjonsveien, som antydet med forbedret frigjøring av cytokrom c i cytoplasma (figur 2A), spalting av caspase-9 (figur 2B) og slipp av MMP (figur 2C). En funksjonell rolle av mitokondrier ble ytterligere bekreftet ved hjelp av HCT116 Bax – /- celler, hvor de apoptotiske virkninger av medikamentkombinasjonen ble signifikant undertrykt. Dette ble demonstrert ved en blokkering av caspase-9 og PARP-spaltning (figur 2B), og slipp av MMP (figur 2C) i HCT116 Bax – /- celler behandlet med kombinasjonen av rosiglitazon og LA-12 sammenlignet med sine motparter wt. Etter den HCT116 vekt- cellen behandling med medikamentkombinasjon, et øket nivå av pro-apoptotiske BH3-bare proteiner Noxa og Bim (23 og 15 kDa, som tilsvarer EL og L-form, henholdsvis) ble observert, mens nivået av Puma og bud holdt seg stort sett uforandret. En svak økning i Bax og Bak proteinnivå var også tydelig i LA-12-behandlede HCT116 WT celler (figur 2D).
(a) Utgivelsen av cytokrom c inn i cytoplasma (cytoplasmafraksjonen) av HCT116-celler forbehandles (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM) og ble deretter behandlet (48 h) med LA-12 (0,75 uM), påvist ved Western blotting etter cellefraksjonering. (B) Spaltning av caspase-9, PARP, Bax proteinnivå (Western blotting), og (c) forandringer i mitokondriemembranpotensialet (MMP, flowcytometri) i HCT116 wt og Bax – /- celler behandlet som i A). (D) Nivået på Noxa, Bim, Puma, Bud, Bax og Bak protein (Western blotting) i HCT116 WT celler behandlet som i a). Resultatene er midler + standardavvik eller representanter for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans: P 0.05, * versus kontroll, ‡ versus RGZ eller Ο versus LA-12, og Δ for vekt versus Bax – /-. Celler
Den rosiglitazone- og LA-12-indusert apoptose skjer fortrinnsvis i G1 fasen av cellesyklus HCT116
En samtidig flowcytometri analyse av celle apoptose (caspase-3 spaltning) og cellesyklus viste at celler behandlet med medikamentkombinasjonen fortrinnsvis dø fra G1 (og i liten grad også S ) fase (figur 3A og 3B). Under betingelsene for Bax mangel, signifikant lavere prosentdel av cellene som ble behandlet med medikamentkombinasjonen gjennomgikk apoptose sammenlignet med sine motparter som uttrykker Bax, og disse apoptotiske celler var i G1 cellesyklus fase (figur 3A).
( a) caspase-3-aktivering (% av alle celler med aktiv caspase-3) relatert til cellesyklusprogresjon (flowcytometri) i HCT116 wt og Bax – /- celler etter deres forbehandling (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 pM ), og etterfølgende behandling (48 timer) med LA-12 (0,75 uM) (b) Prosent av apoptotiske celler (med aktiv caspase-3) i G1 cellesyklus fase, kvantifisering av data fra a). Resultatene er midler + standardavvik eller representanter for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans: P 0.05, * versus kontroll, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for vekt versus Bax – /-. Celler
Som p53 og Chk2 kan fungere som viktige cellesyklusen (inkludert G1 eller M-fase inngang) og apoptose regulatorer, undersøkte vi deres mulige involvering i modulering av rosiglitazon-mediert forbedring av HCT116 celle følsomhet for LA-12-indusert apoptose. Våre resultater viste at både p53 og Chk2 produkter kan utleveres for apoptose utløses av medikamentkombinasjon, som tilsvarende reaksjon (caspase-3, caspase-9, PARP spaltning) ble observert i foreldre og passende slå ut (p53 – /-, Chk2- /-) cellelinjer (fig 4)
Spalting av caspase-9, caspase-3, PARP og nivået av Chk2 og p53-proteiner i HCT116 vekt, Chk2 -. /- og p53 – /- celler forbehandlet (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM), og ble deretter behandlet (48 h) med LA-12 (0,75 uM), påvist ved Western blotting. Resultatene er representanter for tre uavhengige eksperimenter.
PTEN mangel støttet G1 fase relatert økning av mitokondrier avhengig apoptose indusert av rosiglitazon og LA-12 i HCT116 cellene
Kombinert behandling av HCT116 vekt- celler med rosiglitazon og LA-12 induserte en nedgang i PTEN nivå (figur 5A), som ble ledsaget av en øket aktivering av Akt (fosforylering ved Ser473), uten endringer i det totale protein kinase nivå (S2 fig). For å undersøke den funksjonelle rollen til PTEN, ble den cytotoksiske respons til medikamentkombinasjonen sammenlignet i HCT116-celler som uttrykker eller som mangler protein. HCT116 PTEN – /- celler mer følsomme for apoptotiske effekter av LA-12 alene, og enda mer til sin kombinasjon med rosiglitazon, som vist ved en forbedret PARP og caspase-9 spalting (figur 5A), og en økt dråpe av mitokondriemembranen potensial (fig 5B) i forhold til sine HCT116 vekt- motstykker. En foretrukket dreping fra G1 cellesyklus fase indusert av medikamentkombinasjonen i HCT116 wt cellene ble ytterligere enda mer understøttet i fravær av PTEN, hvor andelen av apoptotiske celler (med caspase-3 aktivering) økte signifikant (figur 5C). Stimulering av legemiddelkombinasjonen-indusert G1-fase-relatert apoptose var også tydelig på senere tidspunkter av behandlingene (data ikke vist).
(a) Spaltning av PARP, caspase-9 og PTEN nivå (Western blotting), (b) forandringer i mitokondriemembranpotensialet (MMP, flowcytometri), og (c) andelen av apoptotiske celler (med aktiv caspase-3) i G1 cellesyklus fase i HCT116 vekt- eller PTEN – /- celler forhåndsbehandlet (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM), og ble deretter behandlet (48 h) med LA-12 (0,75 uM). (D, e) Prosent av HCT116 vekt og PTEN – /- celler i de enkelte cellesyklusfaser (flow cytometri) etter behandlingene som er angitt i a-c). Resultatene er midler + standardavvik eller representanter for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans: P 0.05, * versus kontroll, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for vekt versus PTEN – /-. Celler
Mens rosiglitazon alene ikke påvirker cellesyklus distribusjon i forhold til kontroll, vi har observert en signifikant reduksjon i prosentandelen av celler i HCT116 wt G1 fase, og samtidig økning i G2 /M-fasen etter deres eksponering for LA-12 eller dets kombinasjon med rosiglitazon (figur 5D).
