Abstract
Poten fulgens
root tradisjonelt brukt som folkemedisin i Meghalaya, India. Men systematisk evaluering av sin anticancer effekt var begrenset. Vi undersøkte anticancer potensialene for de forskjellige ekstrakter fremstilt ved oppdeling av metanol ekstrakt av roten med sikte på å oppdage viktige medvirkende faktorer fra de mest effektive fraksjoner. Metanol ekstrakt av
P
.
fulgens
røtter (PRE) ble fremstilt ved maserasjon som senere ble fraksjonert i heksan, etyl-acetat (EA) og
n
butanol løselige fraksjoner. Ulike analyser (klonogene assay, Strømningscytometri-analyse, Western Blot, semikvantitativ RT-PCR og nivået av endogen glutation) ble anvendt for å evaluere forskjellige parametre, slik som celleoverlevelsesevne, PARP-1 proteolyse, ekspresjon mønster av anti-apoptotiske og γ- glutamyl-cystein syntetase tung subenhet (GCSC) gener i begge MCF-7 og U87 kreftcellelinjer. Siden EA-fraksjonen viste mest effektive veksthemmende virkning, det ble ytterligere renset og et totalt ni forbindelser og noen monomere og dimere flavan-3-oler ble identifisert og karakterisert. Tre forbindelser viz., Epicatechin (EC), gallussyre (GA) og ursolic syre (UA) ble tatt på basis av deres høyere utbytte og 10 ug /ml av hver ble blandet sammen. Konsentrasjonen brukt i denne studien for PRE, EA og Hex-fraksjonen var 100 mikrogram /ml, som var høyere enn IC
50 verdi. Apoptotisk celledød i det PRE, EA-fraksjon og EC + GA + UA behandlede kreftcellekulturer var signifikant høyere enn i normale celler på grunn av undertrykkelse av anti-apoptotiske protein BCL2 etter behandling. Nedbryting av glutation av downregulating GCSC ble også observert. Induksjon av apoptose, og å redusere nivået av glutation er ansett for å være positiv aktivitet for et anticancermiddel. Derfor, modulering av GSH-konsentrasjon i tumorceller ved PRE og dens EA-fraksjon åpnet opp muligheten for en ny terapeutisk tilnærming fordi disse planteprodukter er ikke skadelig for normale celler og kan regulere tumor cellulær respons overfor forskjellige antikreftbehandlinger. Det ville således være interessant å undersøke effekten av disse planteprodukter eller EA-fraksjon i humant kreftbehandling
relasjon:. Tripathy D, Choudhary A, Banerjee UC, Singh IP, Chatterjee A (2015) Induksjon av apoptose og reduksjon av endogen glutation nivå av Ethyl-Acetate løselige fraksjon av metanol ekstrakt av røttene av
Poten fulgens
i kreftceller. PLoS ONE 10 (8): e0135890. doi: 10,1371 /journal.pone.0135890
Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN
mottatt: 22 april 2015; Godkjent: 27 juli 2015; Publisert: 18 august 2015
Copyright: © 2015 Tripathy et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av DBT, Govt. av India (BT /59 /NE /TBP /2010) til AC, UCB, og IPS; DBT fellesskap og DST-Inspire fellesskap (IF 120 044) til Alka Choudhary; DBT-fellesskapet til DT
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tradisjonelle medisinske planter som potensiell kreft forebyggende og terapeutiske midler har mottatt økende oppmerksomhet de siste årene [1,2]. Slekten
Poten
tilhører familien
Rosaceae
som omfatter ca 500 arter, og er i hovedsak fordelt i tempererte, arktiske og alpine soner av den nordlige halvkule [3].
Poten
ekstrakter anses å være trygt og ikke-giftig når den brukes til mennesker [4,5]. Ekstrakter fra roten av
Poten anserina
har vært brukt i behandling av visse virusinfeksjoner som folk medisinske urter i Tibet [6]. Det ble foreslått at tilstedeværelsen av høyere beløp av hydro og kondensert tanniner, flavonoider og triterpenes i de fleste plantedeler av
Poten
arter kan være en viktig faktor for de observerte biologiske effekter [7].
Poten fulgens
Wall. Ex Hook, vanligvis kjent som Himalayan Mure på engelsk, er en viktig medisinplante av høyere delene av Himalaya. Ulike etniske grupper i Nord-Øst India bruker ulike plantedeler som en kilde til medisin, men deres virkemåte er ennå ikke etablert. Innbyggerne i denne regionen tradisjonelt tygge betel-nøtt (
Areca catechu
), betel blader (
Piper betel
) og kranen roten av
P
.
fulgens
for ulike plager [8] men til tross for sin omfattende bruk lite er kjent om dens Phytochemistry og virkningsmekanisme. Tidligere studier på metanol ekstrakt av roten av
P
.
fulgens
har vist bedre overlevelse av mus med Ehrlich ascites celler, og også en doseavhengige inhiberende virkning på veksten av MCF-7-celler [9]. Et nylig forsøk på å isolere og karakterisere rene forbindelser fra etyl-acetat-løselige fraksjon av metanolekstrakt av røttene av
P
.
fulgens
har gitt ni forbindelser inkludert to nye ursane typen triterpenoids Fulgic syre A og Fulgic syre B. Begge disse nye forbindelser viser god antioksidantaktivitet [10]. Mer omfattende studier med ulike analytiske teknikker har fastslått at flavans inkludert oligomeric flavanoler fulgt av triterpene syrer er de viktigste bestanddelene av roten av
P
.
fulgens product: [11].
Denne studien tar sikte på å undersøke effekten av ulike fraksjoner av
P
.
fulgens
rot ekstrakt på celleoverlevelse, celleproliferasjon, apoptose og endogen GSH-nivået i pattedyrcancerceller, og for å bestemme de viktige medvirkende faktorer for slik virkning fra den mest effektive fraksjon av denne roten ekstrakt. Vi viser at
P
.
fulgens
rot ekstrakt og dens etylacetat løselig fraksjon hemme veksten av kreftceller ved å indusere apoptose. Vi har også analysert status av endogent glutation (GSH) i de behandlede kreftceller og vist sin uttømming, anses å være en positiv virkning av en hvilken som helst kjemoterapeutisk middel fordi senke nivået av endogent GSH gjør at cellen mer følsom for medikamentet [12]. Siden GSH ble funnet å spille en viktig rolle i celledød regulering og dens uttømming krever for utførelsen av apoptose [13], derfor arbeidet med å utvikle kreft narkotika rettet mot redoks systemer, for eksempel, glutation og thioredoxin, har tiltrukket seg oppmerksomhet.
Materialer og Metoder
plantemateriale
Roots av
P
.
fulgens
, et ikke-truede plante, ble samlet inn fra 20 forskjellige planter på Shillong topp skogareal (høyde 1700 moh, 25 ° 34 nordlig bredde og 91 ° 54 East grad) av Meghalaya delstaten i India etter å skaffe en skikkelig godkjenning av skogen offiser. En kupong eksemplar ble avsatt i herbarium av Botanisk institutt, North-Eastern Hill University, Shillong (sjonsnummer 11906). Roten materiale (1 kg) ble luft tørket under skyggen for en uke og malt i en mikser jeksel til et grovt pulver.
Utvinning og isolasjon
ursolic syre, euscaphic syre, corosolic syre, fulgic syre A og B, epicatechin, catechin, gallussyre, p-hydroksybenzaldehyd sammen med flere dimere flavan-3-oler ble isolert slik det er beskrevet i våre tidligere kommunikasjon [10]. I korthet metanol ekstrakt (MeOH) (80:20) på
P
.
fulgens
røtter (PRE) ble fremstilt ved maserasjon som senere ble fraksjonert i heksan (Hex), etyl-acetat (EA) og
n
butanol løselige fraksjoner. Etyl-acetat-ekstraktet ble underkastet vakuum-væskekromatografi under anvendelse av heksan-etylacetat og kloroform-metanol-gradienter under dannelse av fem sammenslåtte fraksjoner, E1 til E5. Kolonnekromatografi av fraksjon E1 ga ursolic syre, euscaphic syre og corosolic syre. To stereoisomere triterpene syrer, fulgic syre A og fulgic syre B ble separert fra fraksjon E2 ved hjelp av HPLC. Fraksjoner E3 til E5 etter kolonnekromatografi og reversfase-HPLC ga fenolene catechin, epicatechin, gallussyre, p-hydroksybenzosyre, ulike monomere og dimere flavan-3-oler [10,11]. Isolering ordningen er vist i figur 1.
Cellelinje og klonogene celleoverlevelsesanalyse.
MCF-7 (human brystcancer cellelinje) og U87 (human ondartet gliom cellelinje) ble kjøpt fra Nasjonalt senter for Cell Science (Pune, India). Celler ble dyrket i Dulbeccos MEM-medium (DMEM, Invitrogen-Gibco) supplementert med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen-Gibco), 100 u /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen-Gibco) og 2 mM L-glutamin ( Invitrogen-Gibco).
celle~~POS=TRUNC survivality ble evaluert med en klonogene analyse både i kreftcellelinjer. I korthet ble cellene trypsinert, og egnede celletall (2000 og 3000 celler) ble sådd i tre 25 cm
2 kolber hver for ubehandlede kontroller, ble fire kolber belagt ved en celletetthet (1000 celler). Fem timer etter såing, ble cellene eksponert i 24 timer med 5 til 150 mikrogram /ml av rot ekstrakt (PRE) av
P
.
fulgens
eller 10 til 120 mikrogram /ml EA eller heksadesi- eller
n
butanol-fraksjonen. Etter behandlingen ble cellene vasket to ganger med mediet, og til slutt kolber ble inkubert i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C med frisk Dulbeccos MEM-medium med 10% føtalt kalveserum i 10 dager. Koloniene ble fiksert og farget med 0,2% krystallfiolett i 70% etanol. Hver analyse ble utført i triplikat og kolonier inneholdende minst 50 celler ble tellet. Antallet overlevende kolonier (behandlede prøver) ble normalisert mot antall kolonier i ubehandlede prøvene.
Behandling detaljer
I alle forsøkene som ble utført etter colonogenic analysen, ble kreftceller behandlet med 100 mikrogram /ml PRE, EA-fraksjon og Hex-brøkdel av metanol ekstrakt av røttene av
P
.
fulgens
. Ved blanding av tre forbindelser, som ble isolert fra EA-fraksjonen dvs. epicatechin (EC), ursolic syre (UA) og gallussyre (GA), som hver ble tatt 10 ug /ml. Disse tre forbindelsene ble tatt fra tre forskjellige EA-underfraksjonene (fraksjon 1, 3 og 4), og deres valg er basert på deres høyere utbytte. I alle disse forsøkene cellene ble eksponert for 24 timer.
Cell drepe evne ved PRE og EA-fraksjonen til normale celler og kreftceller
Dette ble bestemt av trypanblått eksklusjon analysen. Fersk samlet humane perifere blod lymfocytter ble brukt som normale celler og MCF-7 og U87-celler ble brukt som kreftceller.
Heparinisert perifert blod fra ble oppnådd etter å ha sitt skriftlige samtykke til deltakelse to friske mannlige donorer (HPBL) og brukte kort tid etter sin samling. Perifere blodmononukleære celler ble isolert ved hjelp av Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) tetthetsgradient-sentrifugering (spesifikk vekt 1,077 g /ml) i 30 minutter ved 400
g
fra disse nytappet heparinisert fullblod . Lymfocytter kulturer ble satt opp i RPMI 1640 medium supplert med 10% varmeinaktivert FCS. Penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) og 2 mM L-glutamin ble tilsatt til mediet. Lymfocyttene ble stimulert med PHA og etter 24 timer lymfocytter ble behandlet med PRE og EA-fraksjonen (100 og 150 ug /ml) i 24 timer. Disse kulturene ble inkubert ved 37 ° C og ble høstet snart etter behandlingen. Denne studien ble godkjent av Institutional and Human Etisk komité. I tilfelle av kreftceller, ble MCF-7 og U87-celler anvendt og behandlet med PRE og EA-fraksjonen (100 og 150 ug /ml) i 24 timer. Cellene ble vasket med friskt medium og deretter inkubert i 10 minutter ved romtemperatur med 0,4% slutt trypanblått. Døde celler ble farget blå, og live de ble unstained. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Cell drepe evne ved PRE og EA-fraksjonen ble også vurdert ved flow-cytometri analyse (S1 File).
Effekt på celleproliferasjon i MCF-7 og U87 celler
celleproliferasjonstest ble utført i MCF-7 og U87-celler etter å behandle cellene med PRE, EA og Hex-fraksjoner. Celler ved en tetthet på 5 x 10
5 ble dyrket i 25 cm
2 kolber i DMEM-medium ved 37 ° C og 5% CO
2. Etter 24 timer etter såing, ble cellene eksponert for PRE, EA eller Hex-fraksjon ved en sluttkonsentrasjon på 100 ug /ml i 24 timer og endelig fiksert i 70% etanol.
Alle de ovennevnte faste cellene vasket i PBS og resuspendert i 500 ul av propidiumjodid-løsning (20 ug /ml propidiumjodid, 0,2 mg /ml RNase) i 1 time inkubasjon ved romtemperatur i mørket. 10.000 celler ble ervervet for hver prøve og analyseres dem i en FACS Calibur (Becton-Dickinson) ved anvendelse av Cellquest-programvare for å kvantifisere cellesyklus avdelinger for å beregne prosentandelen av celler fordelt i de forskjellige cellesyklusfaser.
Flow cytometrisk analyse av mitokondriemembranpotensialet
ødsling av mitokondriemembranen potensialet er ansett for å være en mitokondriell avbrudd hendelse før apoptose. Det er forårsaket av en plutselig økning i den indre mitokondrie-membran permeabilitet, som er kjent som den mitokondrielle permeabiliteten overgangen [14]. Mitokondriell skade ble bedømt ved bruk av den lipofile fluorescerende probe 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetra-etyl-benzimidazol-carbocyanine jodid i henhold til produsentens protokoll (JC-1; BD Mitoscreen JC-1 kit, Cat 51302). Apoptotisk celledød ble evaluert i MCF-7 og U87-celler behandlet med og uten PRE, EA-fraksjon, Hex-fraksjon og blanding av EC, UA og GA ved hjelp JC-1 flekk. I korte trekk, ble JC-en arbeidsoppløsning fremstilt i 1xAssay buffer og tilsatt 0,5 ml JC-1 flekken til 1×10
6 MCF-7 eller U87-celler i 10 minutter ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Cellene ble vasket to ganger med 1 x Assay-buffer ved romtemperatur og til slutt JC-1 fluorescens ble målt ved bruk av et Becton Dickinson FACSCalibur analytisk strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Prosentandelen av celler av grønn (530 nm) og røde (590 nm) av fluorescens JC-1 ble analysert.
Immunoblotting
Immunoblotanalyse analyser ble utført for å påvise ekspresjon av PARP og β- actin proteiner i ubehandlede og behandlede MCF-7 og U87-celler. Celler ble sådd ut i 25 cm
2 kolber i en konsentrasjon på 4 x 10
5 og 20 timer etter at de ble utsatt for PRE, EA, Hex og blanding av EC + GA + UA i 24 timer. Celler ble samlet opp kort tid etter behandlingen.
Alle de oppsamlede cellene ble vasket med PBS og proteinene ble ekstrahert i cellelyseringsbuffer (50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40 , 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS og 0,42% NaF) som inneholdt protease-inhibitor (1 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 100 U /ml aprotinin). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av bicinchonic syre proteinanalysen og 40 ug protein lysatene fra hver prøve ble fylt i Novex Tris-glycin 4-20% gradiaent geler og elektroforese ble utført i NuPAGE elektroforese system fra (Invitrogen, USA). Proteiner ble overført til PVDF-membraner (Sigma) etter en standard protokoll. Membranene ble undersøkt med en 1: 1000-fortynning av et kanin-polyklonalt antistoff mot PARP Ab-3 (Neo-Markers, USA) og muse-monoklonalt antistoff mot β-aktin (AC-15; ab6276, Abcam, USA). Membranene ble blokkert i 5% ikke-fett tørrmelk, nylaget i TBST (10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) buffer. Alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus IgG (Abcam, USA) anvendt som sekundært antistoff, og immundeteksjon ble oppnådd ved å behandle blot med substratet oppløsning av BCIP /NBT (Bangalore Genei, India). Hele forsøket ble gjentatt to ganger.
DNA-fragmentering analyse
Fragmentering av DNA som en indikasjon på apoptose er en vanlig analyse i narkotika-celle interaksjonsstudier. De MCF7 og U87-celler (5 x 10
5 celler /kolbe) ble dyrket i 24 timer og deretter utsatt for PRE, EA eller Hex-fraksjon ved en sluttkonsentrasjon på 100 ug /ml i 24 timer. Celler ble vasket en gang med iskald PBS og resuspendert i 250 ul lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM EDTA, pH 8,0 og 0,5% (w /v) Triton X-100). Etter sentrifugering ved 12 000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble ekstrahert en gang med fenol /kloroform (1: 1) og én gang med kloroform /isoamylalkohol (24: 1). DNA ble utfelt med natriumacetat (pH 5,2) ved -20 ° C over natten. DNA ble så pelletert og deretter spaltet med DNase-fri RNAase (Amersham Biosciences UK Ltd, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) ved 37 ° C i 20 min. Elektroforese ble utført i en 2,0% (w /v) agarosegel og ble undersøkt under UV gjennomlysnings følgende etidiumbromidfarging for å bestemme graden av apoptotiske DNA-fragmentering.
semikvantitativ RT-PCR (revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon )
uttrykk for BCL2, survivin, CIAP, XIAP, GCLC (glutamat-cystein ligase katalytisk subenhet) og GAPDH ble analysert i MCF-7 og U87-celler etter behandling med PRE, EA, Hex og blanding av EC + GA + UA. Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp RNAeasy kit (Qiagen GmbH, Hilden Tyskland). cDNA ble reverstranskribert fra 1 pg av total RNA fra hver prøve ved anvendelse Quantiscript revers transkriptase, Quantiscript-RT-buffer og RT-primer-blanding av QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen GmbH, Hilden Tyskland) i henhold til produsentens protokoll.
Amplifisering av cDNA ble utført i 20 pl løsning inneholdende 2 ul cDNA, 10 pmol primer-par for BCL2, survivin, XIAP, CIAP og GAPDH (for primer sequences- tabell A i S1-fil) og 10 ul av RT qPCR Master bland (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). PCR bestod av innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, fulgt av 25 reaksjonssykler (30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C, og 30 sekunder ved 72 ° C) og en avsluttende syklus ved 72 ° C i 10 min. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. De amplifiserte PCR-produktene ble separert ved agarose gelelektroforese og visualisert med ethydium bromid. Den mengde av hvert mål-mRNA ble påvist, og normaliseres til den av GAPDH-mRNA.
Bestemmelse av GSH nivå
Total cellulær GSH-innhold ble beregnet ved metoden ifølge Akerboom og Sies [15] i MCF -7 og U87-celler etter behandling med PRE, EA, Hex og EC + GA + UA. Celler ble utsådd i 25 cm
2 kolber i en konsentrasjon på 5 x 10
4 og når cellene nådde konfluens mellom 75-80%, PRE eller EA-fraksjonen eller Hex-fraksjonen eller EC + GA + UA ble tilsatt i 24 timer. Både behandlede og ubehandlede celler ble flashet i iskald 0,1 M fosfat-bufret saltvannsoppløsning (pH 7,4), og volumet ble fylt opp til 1 ml. Cellene ble tellet i et hemocytometer og bearbeidet for bestemmelse av total GSH nivå som tidligere beskrevet [16]. I korthet, etter deproteinisering med 10% iskald 5-sulfosalisylsyre 190 ul prøve suspensjon ble tatt ut og tilsatt til 700 ul NADPH (0,3 mM), 100 pl DTNB (6 mM) og 10 ul GSH-reduktase (6 enheter /ml) og den optiske tetthet av prøvene ble målt ved 412 nm ved hjelp av UV-synlig spektrofotometer (Cecil serie 1000, Camlab, UK). Den GSH-konsentrasjoner ble bestemt ved sammenligning med standarder.
statistikker og
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt pluss eller minus standardavvik (SD). Statistisk analyse av dataene ble utført av paret t-test og p-verdiene. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultatene fra klonogene overlevelse analyse av data er representert som en sigmoidal passer kurve med en lineær X skala, funksjonen brukte var Boltzmann. Y-verdi på X
0 anses for å være halvveis mellom de to grenseverdier på Y-aksen, og dette er ansett å være den konsentrasjon av inhibitor 50 (IC
50) verdi.
Resultater
Effekt på klonogene effektivitets
MCF-7 og U87-celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av PRE og EA, heksadesi- og butan-utvunnet fraksjoner. Mens PRE, EA-fraksjon og Hex-fraksjonen forårsaket doseavhengig reduksjon i kloningseffektiviteten i begge cellelinjer (Fig 2A-2D) i butanol-fraksjonen ikke gjorde dette (figur 2B). Imidlertid er graden av reduksjon i kloningseffektivitet i begge cellelinjene var maksimum med PRE. Verdien av inhiberingskonsentrasjon (IC
50) utledet fra den sigmoide kurve som passer var 39,34 ug /ml med PRE mens det for EA det var 48,4 ug /ml i MCF-7-celler. For U87, disse verdiene var 64,2 og 134,3 pg /ml (figur 2A) med henholdsvis PRE og EA-fraksjonen.
Etter den angitte tid for behandling, ble cellene opprettholdt uten testmaterialene i 10 dager. På dag 10, ble de voksne kolonier telles, og prosentandelen overlevelse fraksjon ble deretter beregnet og vist i (A og B) i MCF-7-celler og (C og D) i U87-celler. Resultatene ble uttrykt som betyr ± SD for tre uavhengige bestemmelser.
PRE og EA-fraksjonen drepe flere kreftceller enn normale celler
Hyppigheten av døde celler er mer i kreftcellene enn normale lymfocytter etter behandling med PRE eller EA-fraksjonen (tabell 1). Betydelig økning i sub-G1 celler i kreftcellelinjer (målt ved FACS) i forhold til de normale lymfocytter etter behandlingen med PRE eller EA-fraksjonen også peke på økt apoptose i MCF-7 og U87 (Fig A i S1-fil) .
strømningscytometrisk analyse av celler etter behandling med ekstraktet
fordelingen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av DNA-innhold i MCF-7 ( figur 3A) og U87-celler (figur 3B). Som vist i figuren, ble ingen signifikant akkumulering av celler i en hvilken som helst fase observert i noen av de behandlede cellelinjer. Men den økede fraksjonen av celler i sub-G1 fasen ble observert i prøvene som er behandlet med PRE (49% i MCF-7 og 45% i U87-celler) og EA-fraksjon (MCF-7: 31%, U87: 21%). høyre panelet på figur 3A og 3B viste signifikant økning i hyppigheten av sub-G1-celler etter behandling med PRE og EA-fraksjon. Heksan-fraksjonen ikke forandre frekvensen i sub-G1 faseceller.
Høyre panel-Prosentandelen av celler på ulike stadier i både MCF7 og U87-celler med og uten behandling. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, Students’t-test sammenlignet med ubehandlede kontroll
Analyse av mitokondriemembranpotensialet ved JC1 merking viste at prosentandelen av polariserte celler ble signifikant redusert i både MCF-7 og U87. celler etter behandling med enten PRE, EA eller blanding av EC + GA + UA (fig 4A og 4B, fig B i S1-fil). Reduksjonen av polariserte celler var mindre med Hex-fraksjon i begge cellene. De ubehandlede celler meste utstilt rød fluorescens, som indikerer en intakt mitokondrie membran potensial. Ved behandling med PRE eller EA eller EC + GA + UA antall celler forbedret, som vist ved grønn fluorescens. panelet til høyre på figuren (Fig 4A og 4B) viste signifikant økning i cellene med mitokondrie membran depolarisering etter behandlingen med PRE, EA-fraksjon og blandingen av EF + GA + UA.
Den øvre delen indikerer prosentdelen av celler som viser polarisasjonen av mitokondriemembranen og den nedre del viser prosentandelen av celler som har mitokondriemembranen depolarisering. Alle disse forsøk ble gjentatt to ganger. Høyre panel viser prosentandelen av depolariserte celler etter hver behandling. * P 0,05, Students «t-test sammenlignet med ubehandlet kontroll. (C) Virkning av PRE, heksan og etylacetat løselige fraksjon behandling på DNA nedbrytning og fragmentering i MCF7 og U87-celler. DNA-prøvene er merket som: (M) molekylvektmarkør, (1) ubehandlede celler, (2) celler behandlet med heksan-fraksjon, (3) celler behandlet med PRE og (4) celler behandlet med etylacetat fraksjonen. Resultatene er representative for to uavhengige eksperimenter. Konsentrasjonen ble brukt 100 mikrogram /ml og behandlingen ble gitt i 24 timer.
DNA-fragmentering analyse
For å validere induksjon av apoptose av PRE, EA eller blanding av EF + GA + UA både i MCF-7 og U87-celler, ble DNA-fragmentering analyse utført (figur 4C). Det ble observert at behandling med PRE og EA-fraksjonen (100 ug /ml) i 24 timer viste DNA degradering i assosiasjon med DNA ladde i U87-celler (panel 3 og 4), men i MCF-7-celler delvise og fullstendige DNA degradering var observert i felt 3 og 4, henholdsvis uten DNA ladde. DNA degradering ble ikke observert i disse cellelinjer etter behandling med heksan-fraksjon i 24 timer. Til sammen PRE og EA-løselige fraksjon indusert DNA degradering i både U87 og MCF-7cells som er den biokjemiske kjennetegn på apoptotisk celledød.
Påvisning av PARP-1 proteolyse og uttrykk nivå av apoptose hemmere
for å bekrefte at den celledød indusert av PRE, EA eller blanding av EC + GA + UA både i MCF-7 og U87-celler som var på grunn av apoptose, spalting av PARP ble målt i begge cellelinjene etter 24 h behandling (figur 5A). PARP-1 proteolyse ble påvist etter behandling med PRE, EA og blanding av EC + GA + UA i begge celler (figur 5A). I samsvar med denne observasjonen ble det betydelig reduksjon i ekspresjonen av BCL2 i begge MCF-7 og U87-celler også observert ved behandling med PRE, EA fraksjon og mix-forbindelsene (figur 5B og 5C). Behandling med Hex-fraksjon mislyktes i å redusere nivået av BCL2 i begge celletyper. Dess BCL2, ble ekspresjonen av inhibitorer av apoptose proteiner reduseres også etter at disse behandlingene i MCF-7-celler, mens i U87-celler slik reduksjon ble ikke observert.
(A) Bestemmelse av PARP spaltning. Nedre panel viser kvantitativ densitometrisk analyse av nivået av PARP med og uten spaltning i de behandlede og ubehandlede MCF-7 og U87-celler. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. To uavhengige ubehandlede prøver ble anvendt. Verdiene er normalisert til respektive p-aktin-verdier. Uttrykk mønster av BCL2, Survivin, XIAP og CIAP bruker semikvantitativ RT- PCR i (B) MCF-7 og (C) U87-celler behandlet med eller uten pre, EA, Hex fraksjoner og EC + GA + UA (to uavhengige utvalg). Høyre sidepanel viser kvantitativ densitometrisk analyse av uttrykket profilen til gener mRNA nivå. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter og er normalisert til respektive GAPDH verdier.
Nivå av redusert glutation (GSH) og uttrykk nivå av GCLC
Nivå redusert GSH i MCF-7 og U87-celler er vist etter behandling med PRE, EA, Hex og EC + GA + UA (fig 6B og 6D). Konsentrasjonen av GSH ble signifikant redusert i begge celler etter behandling med PRE, EA og GA EC + + UA.
To uavhengige ubehandlede prøver ble anvendt i denne studien. Nedre panel viser kvantitativ densitometrisk analyse av ekspresjonsprofilen av GCLC mRNA-nivå. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter og er normalisert til GAPDH respektive verdier. Nivåene av glutation i (B) MCF-7 celler og (D) U87-celler behandlet med eller uten PRE, EA, Hex fraksjoner og EC + GA + UA. To uavhengige ubehandlede prøver ble anvendt i denne studien. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre forskjellige eksperimenter. * P. 0,05, Students «t-test sammenlignet med ubehandlede kontroll
Denne reduksjonen i GSH-nivået er ledsaget av mindre ekspresjon av GCLC i de behandlede MCF-7 og U87-celler (Fig 6A og 6C).
Diskusjoner
P
.
fulgens
root-lager og hele urt blir ofte brukt som folkemedisin av innbyggerne i nordøst India, Nepal og Bhutan for ulike plager [8]. Ved å bruke forskjellige analytiske teknikker med råekstraktet ble det vist at tilstedeværelsen av triterpene syrer og B-type flavan-3-oler i ekstraktet som er generelt kjent for forskjellige biologiske aktiviteter [11]. Løsemiddel løsemiddel partisjonering av metanol ekstrakt ga heksan, etyl-acetat,
n
butanol og vandig ekstrakt. Denne studien viste lovende anticancer aktivitet av råolje metanolholdig ekstrakt av
P
.
fulgens
rot og dens EA-fraksjonen mot MCF-7 og U87-celler. Konsentrasjonen brukt i denne studien for PRE, EA- og Hex-fraksjon var 100 ug /ml, som var høyere enn den enkelte IC
50 verdi. Alle disse ekstraktene ble evaluert tidligere for antioksidant og cytotoksiske aktiviteter, og EA-fraksjonen ble funnet å være den mest aktive [10]. I denne studien ble det observert at behandling med PRE eller EA-fraksjonen drept betydelig flere kreftceller enn normale celler. Både PRE og EA-fraksjon forårsaket doseavhengig reduksjon i kloningseffektiviteten i begge cellelinjer, men en slik reduksjon i kloningseffektiviteten ble ikke observert med heksan og
n
butanol-fraksjoner. Siden EA-fraksjonen viste mest effektive veksthemmende virkning, det ble videre renset og undersøkt for deres antikreft-aktivitet.
Tidligere ni forbindelser og noen monomere og dimere flavan-3-oler ble identifisert og karakterisert fra EA-fraksjonen av metanol rot ekstrakt av
P
.
fulgens product: [10]. Fra disse ni forbindelser, tre forbindelser nemlig., Epicatechin (EC), gallussyre (GA) og ursolic syre (UA) ble valgt og blandet sammen. Valget av disse forbindelser ble laget fra tre forskjellige underfraksjoner og var basert på deres høyere utbytte med hensyn på mengde; GA (3,6%), UA (3,3%) og EC (2,7%) i rå metanol ekstrakt [10,11]. UA ble funnet å være den mest aktive forbindelse blant de isolerte triterpene syrer med IC
50 5,3 og 7,8 uM i DPPH
• og ABTS
+ • antioksydant-analyse [10,11].
i denne studien ble MCF-7-celler var mer følsomme enn U87-celler, siden signifikant reduksjon i cellevekst ble oppnådd ved lavere konsentrasjon av PRE og EA-fraksjon. En slik inhibering i vekst av disse cellelinjer kunne tilskrives enten på grunn av inhibering i celleproliferasjon eller drepe cellene. Den flowcytometrisk analyse viste en økt andel av cellene i sub-G1 indikerer celledød som kan skyldes apoptose. For å få ytterligere bevis for apoptose, testet vi om døende celler utstilt andre kjennetegn ved programmert celledød. Strømningscytometrisk analyse viste signifikant reduksjon av polariserte celler i mitokondriemembranen mens Immunoblotanalyse Resultatene viste spaltet PARP-1-protein i prøvene behandlet med PRE, EA-fraksjon og blandingen av EC + GA + UA. PARP er aktivert ved et mellomliggende trinn av apoptose og inaktiveres ved proteolytisk spaltning ved et sent stadium av caspase3 og caspase7. Slik proteolytisk spaltning av PARP er ansett som kjennetegner apoptose [17]. Dermed tyder presentere resultater som olje ekstrakt av
P
.
