Abstract
De naturlige cytotoksiske reseptorer (NCR) er et unikt sett med aktivering proteiner uttrykt i hovedsak på overflaten av natural killer (NK) celler. De NCR, som inkluderer tre medlemmer; NKp46, NKp44 og NKp30, er kritisk involvert i NK-cytotoksisitet mot forskjellige mål, deriblant et bredt spekter av tumorceller avledet fra forskjellige opprinnelser. Selv om tumor ligander av NCR ikke er blitt identifisert ennå, kan det hende at selektiv måte ved hvilken disse reseptorene målrette tumorceller gir en utmerket basis for utvikling av nye anti-tumor terapi. For å teste den potensielle bruken av NCR som anti-tumormidler, genererte vi oppløselige NCR-Ig-fusjonsproteiner i hvilke den konstante region av human lgG1 ble fusjonert til den ekstracellulære delen av reseptoren. Vi demonstrerer, ved hjelp av to ulike menneskelige prostata kreft cellelinjer, at behandling med NKp30-Ig, dramatisk hemmer tumorvekst
in vivo
. Aktiverte makrofager ble vist å megle en ADCC reaksjon mot NKp30-Ig belagt prostata cellelinjer. Til slutt, Ig-fusjonsproteiner ble også vist å diskriminere mellom benign prostata hyperplasi og prostatakreft. Dette kan gi en ny diagnostisk modalitet i den vanskelige oppgaven med å skille mellom disse svært vanlige patologiske tilstander
Citation. Arnon TI, Markel G, Bar-Ilan A, Hanna J, Fima E, Benchetrit F et al . (2008) Harnes Løselig NK Cell Killer reseptorer for generering av Novel kreft immunterapi. PLoS ONE 3 (5): E2150. doi: 10,1371 /journal.pone.0002150
Redaktør: Fu-Sheng Wang, Beijing Institute of Infectious Diseases, Kina
mottatt: 12 februar 2008; Godkjent: 01.04.2008; Publisert: 14. mai 2008
Copyright: © 2008 Arnon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
immunmekanismer er tenkt å gi viktig beskyttelse fra. utvikling av kreftsykdommer. Studier av menneskelige pasienter og mus modeller har vist at svikt i sentrale immunologiske komponenter føre til økt mottakelighet for utvikling av kreft [1] – [3]. Natural killer (NK) celler er en viktig undergruppe av cytotoksiske lymfocytter som tilhører det medfødte immunforsvaret og er best preget av deres evne til spontant å drepe virusinfiserte og kreftceller [4]. Effektiviteten av hvilken NK-celler ødelegge en lang rekke cellelinjer antyder en viktig rolle i immunosurveillance. Faktisk samler kliniske og eksperimentelle data viser viktigheten av NK aktivitet i kreft eliminering
in vivo
; i mus, uttømming av NK-celler fører til en betydelig økt mottakelighet for kjemisk induserte kreft [1], mens i leukemipasienter redusert NK-cytotoksisitet ble vist å strengt korrelert med øket progresjon av sykdommen [5].
aktivering av NK-celler reguleres av et sett av overflatereseptorer som enten induserer eller hemmer den cytotoksiske respons [4], [6]. Den viktigste mekanisme som styrer NK inhibering er basert på erkjennelsen av MHC klasse I molekyler ved NK inhibitoriske reseptorer, slik som spekk-Ig-lignende reseptorer (kirs) og CD94 /NKG2A-komplekset. Denne mekanismen sikrer at NK-celler er kontinuerlig hindret fra å drepe friske celler som uttrykker normale nivåer av MHC klasse I-proteiner [7]. Imidlertid, mens MHC klasse I ekspresjon er nødvendig for å hemme NK cytotoksisitet, er nedregulering ikke nok til å fremkalle en reaksjon, som spesifikke aktiveringssignaler er også nødvendig. Disse signaler levert av et sett av oppløsnings reseptorer som gjenkjenner ikke-MHC klasse I-ligander, uttrykt på målcellene [8]. Dermed NK-celler er ikke bare i stand til å registrere fravær av MHC klasse I proteiner, men er også utstyrt med overflatereseptorer som tillater spesifikk påvisning av sine mål.
Hoved NK aktivere reseptorer som er involvert i anerkjennelse og drap av svulster inkluderer NKG2D homodimer og de tre naturlige cytotoksiske reseptorer (NCR) NKp46, NKp44 og NKp30 [8]. Det relative bidraget av hver av disse reseptorene til NK-cytotoksisitet mot tumorer er forskjellig, noe som indikerer at det eksisterer ulike spesifikke lysis ligander [9]. Faktisk har flere spennings induserbar cellulære proteiner blitt identifisert som ligander for NKG2D reseptoren. MHC klasse I kjeden knyttet antigener (MICA og MICB) og UL16 bindende proteiner (ULBP1-4) [10]
I kontrast til NKG2D, de cellulære ligander av NCR er foreløpig ukjent, og de eneste NCR ligander identifisert så langt er viralt avledet proteiner [11] – [14]. Imidlertid indikerer betydelig bevis for at eksisterer cellulære ligander for NCR og at deres ekspresjon er kritisk for evnen til NK-celler til å ødelegge tumorer [9], [15] – [17]. Disse funnene støttes av kliniske studier som viser til flere tilfeller av AML en sammenheng mellom lave nivåer av NCR ligander i AML-pasienter og en dårlig prognose av sykdommen [18]. Videre har vi nylig vist at delesjon av et enkelt NCR genet, NKp46 musehomologen (NCR1), reduserer muligheten for NK-celler for å fjerne tumorceller
in vivo product: [19].
i det siste tiåret har kreft immunterapi studier utstrekning fokusert på forsøk på å utnytte den meget spesielle natur den adaptive immunresponsen for utvikling av nye behandlinger. Denne tilnærmingen førte til dannelsen av flere humaniserte antistoffer rettet mot spesifikke tumorantigener. Den imponerende klinisk suksess av antistoff-basert terapi åpnet porten for en intensiv søk etter flere svært spesifikke tumormarkører og siden 1995 flere antistoffer har blitt godkjent for klinisk bruk mens flere er til vurdering i onkologi studier [20], [21] .
for å utvide denne metoden, har ulike verktøy blitt brukt i et forsøk på å identifisere nye tumorantigener som ville være egnet for et bredere spekter av kreftformer og fortsatt beholde selektiv anerkjennelse. De NCR representerer et unikt eksempel for proteiner som har fått en slik bred spesifisitet og er sterkt tilpasset til å gjenkjenne kreftceller. For å oversette dette potensial til et terapeutisk verktøy, har vi generert immunglobulin (lg) fusjonsproteiner som inneholder den ekstracellulære del av reseptoren fusjonert til den konstante regionen av humant IgG1. Således, i likhet med antistoff-baserte tumorterapi tilnærming, hypotese vi NCR-Ig-fusjonsproteiner kan anvendes som «fokuserte missiler»; den ekstracellulære del gir tumorspesifisitet mens den konstante region av det humane lgG1 (Fc) tillater rekruttering av immunkomponenter, som forbedrer spesifikk tumor eliminering. Her viser vi den potensielle bruken av slik behandling ved hjelp av humane prostatakreft modeller.
Materialer og metoder
Cells
Vi brukte den menneskelige prostatakreft cellelinje DU145 og den menneskelige prostata kreftcellelinjen PC3 /
Luc
, som ble fremstilt som tidligere beskrevet [14]. Kort, PC3.38, en klone av den menneskelige prostata adenokarsinom cellelinje, avledet fra PC3 (ATCC, CRL-1435), ble smittet med rekombinant rLNC /
Luc
retrovirus (uttrykker luciferase genet nedstrøms til CMV promoter) og selektert ved G418 (400 ug /ml) generering av PC3 /
Luc
klon. Stabil uttrykk for luciferase i cellekultur ble rutinemessig bekreftet ved hjelp av CCCD kameraet.
Fusion proteiner og flowcytometri analyse
Produksjon av NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig og CD99- Ig ble beskrevet tidligere [13]. Styr humant IgG1 protein (hIgG1 kappa, PHP010) ble kjøpt fra Serotec (Oxford, UK).
Immunohistochemistry
prostata vev, både hyperplasic og ondartede, ble fiksert i formalin. Mikrobølgeoppvarming av de formalinfikserte, parafin vevssnitt i citratbuffer ble utført for å hente antigener. Seksjonene ble deretter farget ved de forskjellige NCR-Ig eller kontroll-Ig (8 ug /ml, sluttkonsentrasjon), etterfulgt av biotinylert-geit-anti-human-Fc (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). For påvisning ble det avidin-biotin-peroksidasekompleks metode som anvendes sammen med Vectastain kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Farging ble gradert som prosentandelen av positive celler (prostata hyperplasic eller maligne) fra totalt 100 celler. Vi evaluerte også intensiteten av fargingen som 0 = ikke, 1 = svak 2 = moderat, og 3 = sterk. Fargete snitt ble analysert ved to patologer. Immunhistokjemiske resultatene ble betraktet som positive når prosentandelen av positivt fargede prostatiske celler gått 50% og intensiteten var høyere enn 1.
tumorimplantering og behandling
For det DU145 modellen vi s.c. injisert mannlige naken mus med den menneskelige prostata svulst linje DU145 (4 × 10
6). To uker etter injeksjon når tumorene ble synlige, ble musene behandlet med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, kontroll humant lgG1 eller PBS. Behandlinger ble administrert 5 ganger (dag 2, 7, 15, 25 og 34) og inkludert en initial større dose av proteiner (20 mg /kg) etterfulgt av lavere doser (10 mg /kg). Tumorprogresjon ble evaluert etter tre dager ved å måle diameteren av svulstene.
For det PC3 /
Luc
modell, male nakne mus (4-8 uker gamle) ble injisert med 15 x 10
6 PC3 /
Luc
celler inn i fm plass på venstrekanten av hver mus. Tre uker etter tumor-implantering, ble mus injisert i.p. med 4 ug /kg av NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, kontroll humant lgG1 eller PBS annenhver dag over en periode på 3-4 uker.
avbilding av tumoren PC3 /
Luc
xenotransplantater
Alle mus ble undersøkt for tumor ekspresjon før og ved slutten av behandlingsprosedyrer. Bare de mus som innen 21 dager fra injeksjon uttrykt en påviselig størrelsen på svulsten, som vurderes av CCCD kamera, ble valgt for ytterligere manipulasjoner. Før bildebehandling, ble musene bedøvet med 4% kloralhydrat (Fluka-Sigma, Israel). Fem minutter før bildebehandling, mus ble injisert intraperitonealt med 126 mg /kg kroppsvekt av en vandig oppløsning av Beetle lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Musene ble deretter plassert i et lystett kammer med en CCCD kamerasystem (Roper Scientific, Princeton Instrument, Trenton, NJ) og fotografert med et første supplert kontrollert lys for å ta en grå-skala legeme referansebilde. Fotoner som sendes ut fra musen ble deretter detektert i fullstendig mørke, oppsamlet og integrert i en periode på 2 min. En pseudo fargebilde representerer lysintensiteten (blå som den minst intense og rødt som den mest intense). Målingene er en integrering av den totale summen skredtatte, trukket av bakgrunnen integrert lys som slippes ut fra en lik området i samme mus.
Farmakokinetiske analyser
in vivo
kvinnelige CB17.SCID mus ble injisert ip med en enkelt dose (5 mg /kg kroppsvekt) av NKp46D2-Ig eller NKp30-Ig. Nivåer av fusjonsproteiner i serum ble bestemt ved forskjellige tidspunkter, inkludert 0 (pre-dose) 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 og 336 timer etter doseadministrasjon. På hvert tidspunkt ble 3 mus ble avlivet blodprøver oppsamlet i separasjons rør, som ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter før sentrifugering (for å tillate koagulering). Etter 30 minutter ble rørene umiddelbart sentrifugert (10 minutter ved opptil 10.000 ved romtemperatur), og serum ble oppsamlet. Nivåer av NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig fusjonsproteiner i serum ble analysert ved hjelp av en standard ELISA-analysen.
apoptose analysen
PC3 /
Luc
eller DU145 cellene (50000 /ml) ble inkubert med 5, 10 eller 50 ug /ml NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-lg eller PBS i 2 timer på is. Cross -linking antistoff (mot humant lgG1) ble deretter tilsatt ved sluttkonsentrasjoner som er lik 1/10 av mengden av fusjonsprotein tilsatt tidligere (0,5, 1 eller 5 ug /ml). Celler ble enn inkubert ved 37 ° C i 48 timer, og andelen av apoptotiske celler ble bestemt ved anvendelse av en standard Annexin V /PI analyse.
Makrofag-mediert dreping assays
effektorceller vi brukte bukhinnemakrofager avledet fra CD1 hårløse mus 5 dager etter Thioglycolate injeksjon. Hentet makrofager ble så aktivert i 2 timer med LPS (1 mg /ml). Radioaktivt merket PC3 /
Luc
eller DU145 cellene (1 * 10
4 /brønn på flat 96-brønns plate) ble inkubert med LPS-aktiverte makrofager ved de angitte E:T forholdstall. Spesifikk lysis ble bestemt etter 48 timer.
Resultater
Godkjenning av ondartet primære humane prostatakreft med NKp30 og NKp46
NKp46 og NKp30 er snør uttrykt på overflaten av hvile som samt aktiverte NK-celler og er dominant involvert i drapet på ulike tumorcellelinjer
in vitro
. Men siden de cellulære ligander av disse reseptorene er fortsatt ukjent, lite er kjent om deres uttrykk mønster og distribusjon i ulike patologiske innstillinger.
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen solid svulst blant menn i USA og nest største årsaken til kreft dødsfall i vestlige land [22]. Dessverre er det ingen effektive behandlinger tilgjengelig i dag for den fatale hormon-ildfast stadium av sykdommen. For å teste om menneskelige prostatakreft er anerkjent av NCR vi farget PC3 /
Luc Hotell og DU145 cellelinjer med NKp30 og NKp46 proteiner kondensert til humant IgG1. Vi har tidligere vist at bindingssetet for NKp46 til forskjellige tumorer er plassert på membranen proksimale domene og damp region av reseptoren (D2), og at ekspresjon av D2 kondensert til humant IgG (NKp46D2-Ig) muliggjør bedre gjenkjennelse av mål celler [13]. Som vist i figur 1 a og b, som begge PC3 /
Luc
og DU145-celler ble spesifikt farget ved NKp30-Ig og NKp46D2-Ig, men ikke av kontroll CD99-lg (grå histogrammer), hvilket således indikerer uttrykket av ligander for disse to NK-aktiverende reseptorer på prostata tumorcellelinjer.
(a, b) NKp30-Ig og NKp46D2-Ig spesifikt bindes til humane prostatacellelinjer. PC3 /
Luc product: (a) og DU145 (b) cellelinjer ble farget med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig eller tak CD99-lg, fulgt av PE-konjugert mus-anti-human lgG1-antistoff. Grey histogrammer representerer bakgrunnsfarging av styre CD99-Ig-fusjonsprotein, og de sorte tomme histogrammer representerer farging av enten NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig, som angitt i toppen av hvert histogram. Dette representerer et eksperiment av tre utført. (C) Immunohistokjemisk farging av primære humane prostata adenokarsinom og benign prostata hyperplasi (BPH) ved NKp30-Ig og NKp46D2-Ig. Kutt fra formalinfiksert og parafin-embedded menneskelige prostata adenokarsinom (øvre panel) og BPH (nedre panel) ble antigen-hentes av mikrobølge citrate behandling. Glassene ble deretter farget med NKp30-Ig, negativ kontroll CD99-Ig eller NKp46D2-Ig etterfulgt av biotinylert-geit-anti-human-Fc og avidin-biotin kompleks HRP. Substrat for HRP var AEC (rød farge) og lysbilder ble kontra farget med Hematoxylin. Figuren viser en representativ farging ved X400 forstørrelse. Arrow i NKp30-Ig farging av adenokarsinom (øverst til venstre panel) peker på en representant membranfarging. Fargeintensitet for Øverst til venstre og øverst til høyre paneler regnes som to (se Methods). (D) Uttrykk for NKp30 og NKp46 ligander er rikt på ondartede prostatakreft. Cuts fra forskjellige pasienter som lider av benign (
n
= 8) eller ondartet (
n
= 9) prostatakreft ble utarbeidet og farget som ovenfor. Farging ble utført i tre paralleller. Analyse av fargeintensitet (0-3) og prosentandel av fargede tumorceller ble utført av to patologer. Positiv farging ble definert da fargeintensitet var over en og omfattet minst 50% av cellene, som beskrevet i «materiale og metoder».
For å unnskylde våre observasjoner, vi analysert uttrykket av ligander til NKp30 og NKp46 på primær prostatisk adenocarcinoma og benign prostatahyperplasi (BPH) avledet fra humane pasienter. Formalinfiksert parafin-embedded prostata kreft ble farget med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig eller kontroll fusjonsproteiner (slik som CD99-Ig). Figur 1c viser representative eksempler på farget vev og figur 1d oppsummerer resultatene oppnådd fra 9 adenokarsinom og 8 godartet prostata kreftvev. Som vist, var 7/9 og 5/9 prostata-adenokarsinomer positivt farget med henholdsvis NKp30-Ig og NKp46D2-Ig, som angir eksistensen av ligander for NKp30 og NKp46 på de ondartede cellene. Uttrykket av disse antigenene omfattet 50-95% av kreftceller med ulike grader av intensitet og viste både intracellulært og membranal distribusjon (figur 1c, pil øverst til venstre panel poeng til membranfarging). I motsetning til dette alle BPH delene testes ble negativt farget ved NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig, som i de fleste tilfeller mindre enn 10% av cellene ble farget og intensiteten var under 1. Det er viktig, verken adenokarsinomer eller de BPH seksjonene ble farget ved hjelp av styre Ig-fusjonsproteinet CD99-Ig (og andre kontrollproteiner, data ikke vist). Disse resultater viser at på samme måte som prostata cancer-cellelinjer dyrket i kultur, primære tumorer avledet selektivt å uttrykke ligander for NK-lysis reseptorene NKp30 og NKp46D2. Videre er ekspresjon av disse ukjente ligander indusert bare på senere stadier av sykdommen som adenokarsinom allerede har utviklet seg.
NKp30-Ig hemmer veksten av prostatacancercellelinje DU145
in vivo
Ig fusjonsproteiner har tidligere blitt benyttet som effektive terapeutiske agenter i klinisk praksis [23]. Her viser vi at både NKp30-Ig og NKp46D2-Ig spesifikt binder menneskelig vev avledet fra prostatakreftpasienter, noe som indikerer tilstedeværelse av spesifikke (selv om ukjent) ligander (figur 1b og c).
For å avgjøre om NKp30 og NKp46D2 smeltet til humant IgG1 kunne mekle effektiv antitumorrespons
in vivo
, injisert vi hårløse mus med den menneskelige prostata svulst linjen DU145. To uker etter injeksjon, når tumorene ble synlige, (definert som dag 1 i figur 2) mus ble behandlet med NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, kontroll humant lgG1 eller PBS (merk forklaringen til figur 2 for behandlingsforløpet og vekst evaluering) . I begge kontrollgrupper som får humant IgG1 (
n
= 10) eller PBS (
n
= 10), dyr viste en rask vekst av svulster (figur 2). Tilsvarende NKp46D2-Ig-behandlede mus (
n
= 9) viste en gradvis økning i tumorer størrelse, noe som indikerer ingen terapeutisk effekt. I motsetning til dette, behandling med NKp30-Ig (
n
= 10) resulterte i en bemerkelsesverdig undertrykkelse av tumorutvikling; som fra den andre administrering av NKp30-Ig (ved dag 7), forble tumorer størrelse konstant i tre uker, og bare en moderat progresjon ble påvist i de følgende dager (figur 2). Videre i 5 av 10 mus som ble injisert med NKp30-Ig, svulstene forsvant etter den andre injeksjonen (dag 7) og ikke dukke opp igjen selv opp til to måneder etter siste injeksjon.
Mann hårløse mus injisert med den menneskelige prostata svulst linje DU145 (4 × 10
6), ble behandlet med NKp30-Ig (
n
= 10), NKp46D2-Ig (
n
= 9) , kontroll humant IgG1 (
n
= 10), eller PBS (
n
= 10). Dag 1 er definert ved to uker etter injeksjon når svulster ble synlig. Behandlinger ble administrert 5 ganger (dag 1, 7, 15, 25 og 34, merket med piler) og inkludert en initial større dose av proteiner (20 mg /kg) etterfulgt av lavere doser (10 mg /kg). Tumorprogresjon ble evaluert etter tre dager ved å måle diameteren av tumorer. Grafene viser gjennomsnittlig diameter (mm) av svulstene i hver gruppe målt i dager 1-45.
Behandling med NKp30-Ig reduserer PC3 /
Luc
tumorvekst
in-vivo
å studere en komplisert biologisk prosess som tumorvekst og terapi innvirkning
in vivo
krever en modell som er både følsom og presis nok til å oppdage selv subtile utviklingen. Nylig ble en ny bioluminesens basert bildeteknologi som gjør at ikke-invasiv påvisning av tumorceller
in vivo
ble rapportert [14], [24]. Denne strategien er avhengig av engraftment av kreft hos mennesker som stabilt uttrykker en reporter gen, for eksempel
luciferase product: (
Luc
), inn i mus. Ekspresjon av luciferase muliggjør
in-vivo
overvåkning av den relative størrelse og fordeling av tumorer og kan derfor også påvise metastatisk utvikling. Videre er dette systemet meget følsom og pålitelig i påvisning av små tumorer som er vanskelig eller til og med umulig å oppfatte i andre fremgangsmåter, for eksempel direkte målinger av tumorstørrelse eller FACS-analyse av tumorekstrakter [24]. Av denne grunn har vi brukt human prostatacancer-cellelinjen PC3 merket ved stabil ekspresjon av luciferase-genet (PC3 /
luc
) som tidligere ble brukt i andre lignende
in-vivo-modeller
[14 ].
for å overvåke effekten av NKp30-Ig og NKp46D2-Ig fusjonsproteiner på progresjon av PC3 /
luc
prostatakreft cellelinje
in vivo
, vi injisert mannlige naken mus med PC3 /
Luc
celler. Tre uker etter injeksjon (betegnet som «startpunkt»), ble tumorvekst vurdert av CCCD kameraet og de mus som uttrykker tumorer som var stor nok for å sende en integrert signalintensiteten av 100 fotontellinger og over, ble valgt for ytterligere behandling med NKp30 -ig (
n
= 16), NKp46D2-Ig (
n
= 9) eller med PBS som kontroll (
n
= 8). Behandlingen inkluderte en i.p. injeksjon av PBS eller 4 mg /kg kroppsvekt av det aktuelle fusjonsprotein, gitt hver annen dag i en måned. Ved slutten av behandlingsperioden (betegnet som «sluttpunkt»), tumorstørrelse ble evaluert på nytt i CCCD kameraet.
Som vist i figur 3a og oppsummert i figur 4b, behandling av mus med NKp30-Ig hadde en dramatisk effekt på tumorvekst. Mens i kontrollgruppen (figur 3c og 4), rask økning i tumorstørrelse ble observert i nesten alle dyrene (87,5%), NKp30-Ig-treate førte til en betydelig reduksjon i tumorprogresjon; i 50% av musene som ble behandlet med NKp30-Ig tumoren ble drastisk redusert til 20% eller belg av sin opprinnelige størrelse (sett på som «effektiv behandling»), viste 25% partiell effekt, mens 25% ikke reagerte og utviklet progressive tumorer. Videre, i de musene som effektiv behandling, ble det oppnådd, ble det ikke observert selv tilbakefall 3 måneder etter den siste NKp30-Ig administrering. Viktigere, NKp30-Ig terapeutisk effekt var ikke avhengig av den opprinnelige størrelsen på svulsten, som respons eller manglende respons ikke korrelerer med den første signal detekteres fra svulsten, målt i «startpunktet» (angitt i tall over hver kolonne) .
Herre nakne mus ble injisert med PC3 /
luc
tumorceller (15 × 10
6) inn i SC venstre flankene. Tre uker etter tumor-implantering, ble mus injisert (IP) annenhver dag over en periode på en måned med 4 mg /kg av NKp30-Ig (
n
= 16) (a), NKp46D2-Ig (
n
= 9) (b) eller PBS (
n
= 8) (c). Tumor progresjon ble overvåket ved måling av lysemisjonen fra hver enkelt mus i initieringen ( «startpunkt») og til slutt ( «sluttpunkt») av behandlingsperioden. Y-aksen representerer den relative (i prosent) forandringer i svulststørrelsen etter behandling, som beregnet fra den integrerte lysemisjonen målt på hvert tidspunkt (vist ovenfor tall kolonner). Krymping av tumor med 20% eller mindre av sin opprinnelige størrelse ble omtalt som «effektiv behandling «. Dette tallet er en oppsummering av to eksperimenter og inkluderer alle musene som ble testet.
NKp30-Ig behandling undertrykte betydelig vekst både DU145 og PC3 /
Luc
, men med en mer fremtredende effekt på PC3 /
Luc
(tall 2-4). Dette kan ikke tilskrives forskjeller i ligand uttrykk (figur 1a) og kunne reflektere økt progressive veksten av DU145 forhold til PC3 /
Luc
. I motsetning til NKp30-Ig og i overensstemmelse med resultatene presentert ovenfor (figur 2), NKp46D2-Ig behandling hadde bare en marginal effekt (figur 3b og 4); 66,6% av mus behandlet med NKp46D2-Ig viste progressiv tumorvekst, mens 22,2% og 11,1% var delvis herdet eller effektivt behandlet, henholdsvis.
(a) Visualisering av tumorprogresjon og distribusjon
in vivo
. Figuren viser et bilde visualisering av en representativ dyr av hver behandling. Skalaen på høyre side av hver figur beskriver fargekartet til fotonet teller. Den integrerte lys utslipp ( «I») er angitt i venstre på hvert bilde. (B) Sammendrag av behandlingseffekt. Tabellen nedenfor beskriver den samlede effekten av behandlinger, som vist i detalj i figur 3.
Figur 4a viser en illustrasjon av en representant mus fra hver behandlingsgruppe. I de fleste tilfeller ble det ikke observert metastaser. De tumormålinger som er beskrevet ovenfor (figur 3) representerer hele tumormassen påvises i hvert dyr.
Disse resultatene viser klart det terapeutiske potensialet av NKp30-Ig-fusjonsprotein for human prostata cancer behandling
in vivo
.
farmakokinetikk NKp30-Ig og NKp46D2-Ig
til sammen våre resultater tyder på at NKp30-Ig, men ikke NKp46D2-Ig kan undertrykke tumorvekst
in vivo
. Denne selektive effekten var overraskende siden både NKp30-Ig og NKp46D2-Ig på samme måte binde seg til PC3 /
Luc
, DU145 (figur 1a og b) og menneskelige prostata kreft prøver
in vitro plakater (figur 1c ). Således må forskjellene mellom det terapeutiske potensialet av NKp46D2-Ig og NKp30-Ig resulterer fra andre egenskaper ved proteinene som påvirker effektiviteten av behandlingen.
En av de viktigste faktorene i cancerterapi er t
1/2 av det terapeutiske middel. For å formidle en signifikant anti-tumor effekt fusjonsproteinene må være i stand til å nå serum og forbli stabil i flere timer.
For å estimere den relative stabilitet av fusjonsproteiner
in vivo
, mus ble gitt en enkelt dose (5 mg /kg kroppsvekt) av enten NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig og deretter overvåket for spesifikke proteinnivåer i serum noen få timer til 14 dager. Den maksimale nivå av proteiner, målt i serum var lik for begge NKp46D2-Ig og NKp30-Ig (figur 5a og b). Imidlertid tydelige forskjeller ble observert i de kinetikk og stabilitet av de to fusjonsproteiner; høye nivåer av NKp46D2-Ig ble identifisert i serum etter en time fra injeksjon, enskjønt falt raskt i blodet, og i løpet av 2 timer omtrent 50% av proteinet ble nedbrutt. Videre, etter 24 timer, kun små spor av NKp46D2-Ig ble funnet (figur 5b). I motsetning til dette ble det høyeste nivået av NKp30-Ig detektert i serum allerede 30 minutter etter injeksjon og ble opprettholdt i nesten 2 dager, reduseres først etter 120 timer (figur 1A). Disse observasjoner viser den relative stabilitet av NKp30-Ig
in vivo
og kan forklare, i det minste delvis, svikt i NKp46D2-Ig for å produsere en terapeutisk effekt.
Mus ble injisert i.p. med en dose (5 mg /kg) av NKp30-Ig (a) eller NKp46D2-Ig (b). Serumprøve ble samlet opp (ved 0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 og 312 timer etter injeksjon) og nivåer av NKp30-Ig eller NKp46D2-Ig ble bestemt i et standard ELISA-analyse. Figuren viser den gjennomsnittlige mengden av fusjonsproteiner detektert i serumet til tre mus måles ved hvert tidspunkt. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD av triplicates.
NKp30-Ig forbedrer makrofager-mediert cytotoksisitet mot tumorceller
in vitro
Flere mekanismer har blitt foreslått for evne tumor antistoffer å megle deres effekt
in vivo
. En mulig måte ved hvilken slike antistoffer kan hemme tumorvekst er ved å binde seg til overflaten reseptorer som er involvert i cellesyklusregulering [25]. Vi vil derfor først testet om binding av NKp30-Ig til sine ukjente kreft ligander kan indusere direkte apoptose eller veksthemming av tumorceller i kultur. PC3 /
luc
og DU145-celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av NKp30-Ig, NKp46D2-Ig eller tak Ig-fusjonsprotein i 48 timer i nærvær av et tverrbindings antistoff. Etter behandling, ble prosentandelen av apoptotiske celler bestemt ved Annexin V og propidiumjodid (PI) farging. Inkubasjon av enten PC3 /
luc
eller DU145 celler med ulike fusjonsproteinene ikke hadde noen effekt på apoptose satser (figur 6a og b) som den midlere spontan apoptose av PC3 /
luc
og DU145 -celler (ca. 25% og 8%, henholdsvis) forble lik og var ikke påvirket av noen av behandlingene. I tillegg ble ingen cellesyklus-stans observert, som evaluert ved tymidininkorporering assays (data ikke vist). Lignende resultater ble oppnådd etter inkubering i 24 timer eller 72 timer (data ikke vist).
(a, b) NKp30-Ig ikke induserer apoptose i tumorceller. PC3 /
luc product: (a) eller DU145 (b) celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, styrer Ig eller PBS i nærvær av et tverrbindings antistoff. Etter 48 timer ble den prosentandel av apoptotiske celler bestemt ved Annexin V og PI farging. Figuren viser en av tre eksperimenter utført. (C, d) NKp30-Ig kan mediere tumor opsonisering av makrofager. Radioaktivt merket PC3 /
Luc product: (c) eller DU145 (d) celler ble inkubert med LPS-aktiverte makrofager ved de angitte E:T forholdstall. Spesifikk lysis ble bestemt etter 48 timer. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± s.d av tre paralleller. Figuren representerer en av tre eksperimenter utført. (E) Infiltrasjon av makrofager til tumorvevet. Humane prostata tumorer (DU145) dyrket i nakne mus ble fiksert i 10% bufret formalin. Parafin-embedded seksjoner ble farget i Hematoxylin og eosin. Pilene viser tumor associated- makrofager (X380). Dette tallet representerer en av fem seksjoner testet.
Siden kreftceller ikke påvise noen iboende følsomhet for NKp30-Ig
in vitro
, vi neste testet kapasiteten NKp30- Ig å indusere effektor-mediert dreping av tumorceller. Makrofager er tidligere brukt som viktige aktører i antistoffavhengig tumorkontroll
in vivo product: [26], [27]. For å evaluere evnen til NKp30-Ig for å forbedre makrofager-mediert lysis av tumorceller, ble musene først injisert (i.p.) med tioglykolat for å bevirke en lokal ikke-patogent betennelse og rekruttere stort antall makrofager i peritoneum hulrom. Fem dager senere ble musene avlivet og makrofager ble isolert.
