Abstract
Hypoksi-induserbar faktor-2α (HIF-2α, eller EPAS1) er viktig for kreft progresjon, og er en antatt biomarkør for dårlig prognose for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Men molekylære mekanismene bak EPAS1 overekspresjon er ikke fortsatt fullt ut forstått. Vi utforsket en rolle i en enkeltnukleotidpolymorfi (SNP), rs13419896 ligger innenfor intron 1 av
EPAS1
genet i regulering av sitt uttrykk. Bioinformatiske analyser antydet at en region inkludert rs13419896 SNP spiller en rolle i regulering av
EPAS1
genekspresjon og SNP endrer bindingsaktiviteten av transkripsjonsfaktorer.
In vitro
analyser viste at et fragment som inneholder SNP locus fungere som et regulatorisk område og som et fragment med
En
allel viste høyere trans aktivitet enn en med
G
, spesielt i nærvær av overexpressed c-Fos eller c-juni Videre NSCLC pasienter med
En
allel viste dårligere prognose enn de med
G
på SNP selv etter justering med ulike variabler. I konklusjonen, kan genetisk polymorfisme av
EPAS1
genet føre til variasjon av sine genuttrykk nivåer for å drive utviklingen av kreft og tjene som en prognostisk markør for NSCLC
Citation. Putra AC , Eguchi H, Lee KL, Yamane Y, Gustine E, Isobe T, et al. (2015)
En
Allele på rs13419896 av
EPAS1
er assosiert med Enhanced Expression og dårlig prognose for ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0134496. doi: 10,1371 /journal.pone.0134496
Redaktør: Tiffany Seagroves, University of Tennessee Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 02.04.2015; Godkjent: 09.07.2015; Publisert: 11 august 2015
Copyright: © 2015 Putra et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research (C) (nr 23592766) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP ), Grants-in-Aid for Scientific Research på «Innovative Areas (No. 221S0001)» fra japanske departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, og Strategic Research Foundation Grant assistert Project for private universiteter, MEXT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hypoksi-induserbar faktorer (HIFs) er heterodimere transkripsjonsfaktorer som er medlemmer av Per-ARNT-Sim (PAS) familie. De aktiveres ved hjelp av et antall av signalerings innganger, inkludert hypoksi, nærings sult, inflammasjon, onkogene signaler, mekaniske spenninger, og i noen tilfeller, interne genetisk polymorfisme [1-4]. De HIF transkripsjonsfaktorer består av alfa subenheter (HIF-1a, HIF-2a, HIF-3α) som er regulert av de nevnte signaler mens beta subenheter kjent som aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (ARNT) er konstitutivt uttrykt og stimulere transkripsjon av mer enn hundre mål gener knyttet til patofysiologiske respons [5, 6]. Blant alfa subenheter, har HIF-1α og HIF-2α blitt grundig undersøkt. Selv medlemmer av alfa subenheter deler likheter i deres struktur, funksjon og regulering
in vitro
, deres roller
in vivo
er uensartet under utvikling og tumorigenesis [3, 5, 7].
Den menneskelige HIF-2α genet som kalles endothelial PAS domene protein 1 (
EPAS1
), inneholder 16 eksoner og spenner over 90 kb på 2p21-p16. Ekspresjon av human HIF-2α er blitt identifisert i lunge, carotis legemer, endotelceller, gliaceller, kardiomyocytter, renal fibroblaster og hepatocytter hvor det spiller en viktig rolle i reguleringen av oksygen fysiologi [3, 8]. Dette er av særlig viktighet i lungen, ettersom det utgjør området for oksygen utveksling og tilveiebringer luft-væske-grensesnittet for dette formål. HIF-2a-proteiner er uttrykt i type II pneumocytes og pulmonære endotelceller som svar på hypoksi, så vel som i epitel og mesenkymale konstruksjoner som gir opphav til det vaskulære endotelet [9, 10]. Videre ble høye nivåer av HIF-2α uttrykk knyttet til økt tumorstørrelse, invasjon og angiogenese i murine modeller av lungekreft [11,12]. Forbedret uttrykk for HIF-2α protein i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vev ble rapportert å være en betydelig maker for dårlig prognose [13-15].
Nylig har det blitt rapportert at flere enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) i
EPAS1
er forbundet med utviklingen av slitasjegikt [16], prematuritetsretinopati [17], maksimal metabolsk ytelse i elite utholdenhetsutøvere [18], fysiologisk tilpasning i stor høyde populasjoner [19- 22], og mottakelighet mot nyrecellekreft (RCC) og prostatakreft [23, 24]. Men effekten av disse SNPs på uttrykket nivåer av
EPAS1
blir neppe forstått.
Blant disse SNPs, fokuserte vi på Hap-tag SNPs av
EPAS1
genet som kan bidra til tilpasning til høyde hypoksi i Sherpas [22], vurderer lunge som et mål organ. Bioinformatiske analyser bedt oss om å undersøke hvilken rolle rs13419896 SNP i reguleringen av
EPAS1
genekspresjon og en forening med prognose for NSCLC.
Materialer og metoder
bioinformatiske analyser
Vi avhørte transkripsjonsfaktor kromatin immunoprecipitation (Chip-seq) datasett fra Encyclopedia of DNA Elements (KODE) konsortium med University of California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser (https://genome.ucsc.edu /kode /) for å finne ut kandidat transkripsjonsfaktorer som kan binde på eller i umiddelbar nærhet til rs13419896 SNP nettstedet. Allel spesifikk overvåking av transkripsjonsfaktorer bundet til fragmentet inneholder rs13419896 SNP ble gjennomført ved hjelp Jaspar CORE Vertebrata, en åpen tilgang til databasen av matrisebasert nukleotid profiler som beskriver binding preferanse for transkripsjonsfaktorer [25].
DNA-ekstraksjon og analyse genotyping
Genomisk DNA ble isolert fra perifere blodprøver eller frosne ikke-kreft lungevev som tidligere beskrevet [26, 27]. Følgende primer sett ble brukt til å forsterke et fragment inkludert SNP fokus i
EPAS1
intron1; Forward: 5′-CCTAATGAGCCTCTGGGAAAGTGC-3 «og bakover: 5′-CAATGGTGCCTCCTACCCTGTG-3». PCR-reaksjonsbetingelsene var 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 63 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Sekvensering av PCR produktene ble utført ved hjelp av BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit og ABI PRISM 310 Genetic Analyzer automatisert sekvenseringssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Cellelinjer og cellekultur
Tjuefire humane kreftcellelinjer som består av et hepatomceller HepG2, muntlig plateepitelkarsinom linjer HSC-2, HSC-3, HSC-4, KB og KOSC2, brystkreft MCF-7, MDA-MB-231, MDA -MB-435s, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-20, BT-474, SK-BR-3, T-47D, og ZR-75-1 og lungekreft cellelinjer A549, PC- 6, PC-9, PC14, RERF-LC-Ad-en, RERF-LC-Ad-2, RERF-LC-KJ, og LC-S ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia) eller JCRB (Osaka, Japan) mellom 2001 og 2007, og opprettholdt i RPMI 1640 eller Dulbeccos modifiserte Eagles minimale essensielle medium (DMEM) (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japan) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, BioWhittaker, Verviers, Belgia) som tidligere beskrevet [28 -30].
EPAS1
status av cellene ble bestemt ved sekvensanalyse som beskrevet ovenfor.
RNA-fremstilling og RT-PCR
Totalt RNA ble fremstilt fra frosne cellepelleter ved hjelp av QIAGEN RNeasy mini kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. To mikrogram total RNA ekstrahert fra hver cellelinje ble revers-transkribert ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). En 1/200 fortynning av cDNA ble utsatt for real-time RT-PCR bruker TaqMan Gene Expression Analyser (Applied Biosystems) for
EPAS1 Hotell og Pre-Utviklet TAQMAN assayreagenser (Applied Biosystems) for
ACTB
som housekeeping kontroll. Tre uavhengige målinger ble tatt, og i gjennomsnitt med relativ genekspresjon nivåer beregnet som forholdstall enn
ACTB
uttrykk for hver cellelinje.
immunoblotanalyse
For å analysere protein uttrykk, helcelle ekstraktene ble fremstilt fra dyrkede celler med eller uten hypoksisk behandling som tidligere beskrevet [30]. Femti ug protein ble blottet på nitrocellulosefiltere etter SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Anti-EPAS1 (HIF-2α) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo) eller anti-β-aktin (sigma) ble anvendt som primære antistoffer fortynnet som 1: 500 eller 1: 5000. Anti-kanin-IgG eller anti-mus-Ig-pepperrot-peroksidase-konjugat (Amersham Life Science) ble anvendt som et sekundært antistoff fortynnet i 1: 2000 eller 1: 5000. Immunkomplekser ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminiscence reagent ECL Plus (Amersham Life Science).
Plasmid konstruksjon og luciferaserapportørplasmid eksperimenter
glødet oligonukleotidfragmenter inneholder
EPAS1
SNP locus rs13419896 ( 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCGCTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3 «eller 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCACTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3») ble subklonet inn i
Kpn i-sete
av pGL4.26 (Promega, Madison, WI) med en minimal promoter som driver ildflue luciferase reporter. C /EBP-β eller c-MYC-cDNA ble amplifisert fra total RNA fra MCF-7 eller HSC2 celler ved RT-PCR og subklonet i pRc /CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO (Invitrogen ). Konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensanalyse og betegnet som pGL4.26-EPAS1_G, pGL4.26-EPAS1_A, pCMV-C /EBP-β, eller pcDNA-c-MYC, respektivt. Rotte c-Jun drevet av den humane β-aktin-promoter (c-Jun /β-aktin) og humane c-fos-ekspresjonsvektorer ble generøst tilveiebragt av dr Masaharu Sakai (Hokkaido University) [31]. Transiente transfeksjoner ble utført hvor hver pGL4.26-EPAS1 reporter-konstruksjonen (0,2 ug /15 mm brønn) med Renilla luciferase ko-transfeksjon kontroll (PRL-SV40, 100 pg /15 mm brønn) (Promega) ble blandet med 0,4 ul trans-IT LT1 Transfection Reagent (Takara, Japan) og tilsatt til mediet. I kotransfeksjonseksperimenter, 0,4 ug av pRc /CMV, c-Jun /β-aktin, c-Fos, pcDNA-c-MYC eller pCMV-C /EBP-β ble blandet med EPAS1 reportere som ovenfor. Celler ble inkubert med blandingen i 24 timer før kvantifisering av luciferase reporter aktivitet på enkelt-prøven Mini Lumat LB 9505 luminometer (Berthold Technologies GmbH 43 adenokarsinomer (AD), 29 plateepitelkarsinom (SCC), og 4 adeno-plateepitelkarsinom (ADSCC). Fordeling av lungekreftpasienter ved etapper (31 pasienter var på scenen jeg, 7 ved II, 25 ved III og 13 ved IV) er godt tilpasset den bredt representant for den japanske lungekreft befolkningen.
Statistisk analyse
Den primære resultater i denne studien var lungekreft spesifikk dødelighet og risiko for død. Overlevelse ble beregnet som tiden fra primær kirurgi i hjel på grunn av lungekreft, sensurere på datoen for siste kontakt eller ikke-kreft død. Chi-square eller Fishers eksakte test ble brukt til å undersøke fordelinger av variabler. Forskjeller i overlevelse ble undersøkt ved hjelp av log-rank test. Cox proporsjonal risikomodell ble brukt til å estimere den relative risikoen for død og 95% konfidensintervall (CI). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en statistisk programvare JMP versjon 10.0.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), noe annet er angitt. Utvidet Fishers eksakte test ble utført med «R»: (. R kjerneteam, 2013. R Foundation for Statistiske Computing, Wien, Østerrike URL https://www.R-project.org/) et språk og miljø for statistisk databehandling med en pakke «mynt». Hardy-Weinberg likevekt ble undersøkt for å sammenligne de observerte og forventede genotypefrekvensene ved hjelp av en Chi-kvadrat test. Statistisk signifikant reporter eksperimenter og genekspresjon analyser ble analysert ved hjelp av statistiske programvare JMP versjon 10.0.2 og Statview versjon 5.0 programvare (SAS Institute Inc.).
Resultater
Database overvåking av SNPs av
EPAS1
i forhold til sin genekspresjon
Blant de 3 Hap-tag SNPs (rs13419896, rs4953354, og rs4953388) som ble innblandet å bidra til tilpasning til høyde hypoksi i Sherpas [22 ], fant vi bindingsseter og bindende aktiviteter for C /EBP-β, AP-1 eller MYC familie av transkripsjonsfaktorer i en rekke kreftcelletyper i regionen i
EPAS1
rs13419896 locus innen intron 1 av genet ved overvåking av chip-seq datasett fra KODE (S1 fig). Interessant nok, når analysert sekvenser bruker Jaspar Kjerne Vertebrata, fant vi at relative score, indekser for sannsynligheten for transkripsjon faktor bindende, C /EBP-β og AP-1 ble rammet av rs13419896 SNP blant de 3 transkripsjonsfaktorer som nevnt ovenfor ; C /EBP-β og AP-1 viste mye høyere score på 0,842 og 0,855 i sekvensen med
En
allel på rs13419896 henholdsvis enn de med
G
allel (0,734 og 0,744) . Disse data bedt oss om å undersøke hvilken rolle rs13419896 i regulering av
EPAS1
genuttrykk.
Den rs13419896 SNP forandret reporter genet aktiviteter
For å teste mulig funksjonell forskjeller forårsaket av rs13419896 locus, neste forberedt vi luciferase reporter konstruerer husing
EPAS1
fragment som omfatter rs13419896 locus foran minimum promoter (fig 1A) og utført transient transfeksjon analyser i A549, PC-9 og HSC -2 kreft cellelinjer. Konstruksjonene med fragmentene inneholdende den rs13419896 locus viste økt rapportør aktiviteter sammenlignet med den opprinnelige reporter pGL4.26 i alle cellelinjene testet, uavhengig av genotype av SNP, noe som tyder på at dette kort sekvens innenfor intronet en av
EPAS1
funksjon som en transkripsjons enhancer element (
P
0,05, fig 1B-1D). Interessant, reporteren konstruksjon inneholdende fragment med
En
allel av rs13419896 (pGL4.26-EPAS1-A) viste signifikant høyere aktivitet enn en med
G
allel (pGL4.26- EPAS1-G) i alle cellelinjene som ble testet (
P
0,01,
P
0,05 som vist i figur 1B-1D), noe som tyder på at den forsterker aktiviteten til dette regulatoriske element påvirkes av genotype av rs13419896 SNP.
(A) Skjematisk fremstilling av luciferase reporter konstruerer med forskjellige
EPAS1
SNP lene som vist. Korte fragmenter som inneholder
EPAS1
SNP locus (rs13419896) ble subklonet inn i pGL4.26 minimal promoter luciferase reporter plasmid. (B-D) Bar diagrammer viser luciferase-rapportøraktivitet etter forbigående transfeksjon forsøk i A549 (B), PC9 (C), og HSC-2 (D) celler. Luciferase reporter-aktivitet ble beregnet som et forhold til Renilla luciferaseaktivitet generert av PRL-SV40 ko-transfeksjon kontroll. Hver verdi representerer middelverdien + standardavvik (SD) for minst tre uavhengige eksperimenter.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test med *:
P
0,05, **:
P
0,01 og ***:
P
0,0001.
Siden den rs13419896 SNP ble innblandet for å endre bindingsaffinitetene av AP-1 og C /EBP-β ved den ovenfor nevnte bioinformatikk analyse, vi neste utførte kotransfeksjonseksperimenter i A549-celler for å evaluere effekter av overekspresjon AP-1, c-myc, eller C /EBP-p transkripsjonsfaktorer på reporteren aktiviteter. Overraskende, tvunget ekspresjon av c-Jun eller c-Fos, komponenter i transkripsjonsfaktor AP-1, økt reporteren aktivitet av bare pGL4.26-EPAS1-A, men ikke det av pGL4.26-EPAS1-G (fig 2A signifikant og 2B). På den annen side, økes C /EBP-β den transkripsjonelle aktivitet av både av reporter konstruksjoner med tilsvarende amplitude, mens c-myc ikke viste signifikante endringer i aktiviteten til begge konstruksjoner.
(A og B ) for å evaluere effekten av overekspresjon AP-1 (c-Jun og c-FOS), MYC, eller C /EBP-p transkripsjonsfaktorer på rs13419896 SNP luciferase reporter aktivitet, ble kotransfeksjonseksperimenter utført i A549 lunge adenokarcinomceller. Stolpediagrammer viser luciferaserapportørplasmid aktiviteten pGL4.26-EPAS1-G (A) eller pGL4.26-EPAS1-A (B). Luciferase reporter-aktivitet ble beregnet som et forhold til Renilla luciferaseaktivitet generert av PRL-SV40 ko-transfeksjon kontroll. Hver verdi representerer middelverdien + standardavvik (SD) for minst tre uavhengige eksperimenter.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Dunnetts test med ***:
P
0,0001.
Sammenligning av uttrykk nivåer av
EPAS1
mRNA og protein i kreftcellelinjer ved rs13419896 SNP
For å explorer effekter av rs13419896 SNP på endogene genuttrykk nivåer av
EPAS1
, genotypet vi SNP og evaluert nivåer av genuttrykk i ulike kreftcellelinjer. Når cellene ble delt inn i to grupper av tilstedeværelse eller fravær av
En
allel på rs13419896 locus, kreftceller med
En
allel av rs13419896 viste signifikant høyere
EPAS1
genuttrykk nivåer enn for noen andre uten
En
allel (
P
= 0,022, Welch er
t
test) (figur 3A). Vi videre analysert nivåer av EPAS1 (HIF-2α) protein uttrykk i flere lungekreft cellelinjer ved immunoblotting analyser. Som resultat ble EPAS1 proteiner påvist i PC9 og LC-KJ med
En
allels også ved normoksisk forhold og var åpenbart økt i noen av hypoksiske kreftceller, A549, PC9, LC-KJ, og LC-S (fig 3B)
(A)
EPAS1
genuttrykk nivåer evaluert av real-time RT-PCR ble sammenlignet mellom kreftceller «grupper ved rs13419896 status.; ett med
En
allel på SNP stedet (med
A
allel) og andre uten (w /o
A
allel). Uttrykket nivåer av
EPAS1
i hver cellelinje ble beregnet som et forhold til den av
ACTB
, og hver verdi representerer middelverdien i minst tre uavhengige eksperimenter (åpen sirkel). Hver søyle viser gjennomsnittlig uttrykksnivået i hver gruppe.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Welch er
t
test med *:
P
= 0,022. (B) De EPAS1 protein ekspresjonsnivåer ble sammenlignet mellom genotypene som ovenfor. Flere lungekreft cellelinjer ble inkubert i henhold til normoksisk (21% pO
2) eller hypoksisk (1% pO
2) i 24 timer. Hele celleekstrakter preparert fra hver cellelinje underkastet i immunblotting-analyse under anvendelse av anti-EPAS1 (HIF-2α) eller anti-β-actin som en kontroll.
A-allel av rs13419896 SNP av
EPAS1
var assosiert med dårlig total overlevelse av ikke-småcellet lungekreft pasienter
Siden rs13419896 SNP ble foreslått å knytte kontakter med forbedret uttrykk for
EPAS1
genet, så vi utforsket mulig sammenslutninger av SNP med clinicopathological faktorer av japanske NSCLC pasienter. Genotyper av rs13419896 SNP ble bestemt i 76 NSCLC, og funnet å være i god overensstemmelse med Hardy-Weinberg likevekt (
P
= 0,45, Chi-kvadrat test, tabell 2). Ingen signifikant forskjell ble funnet blant genotypefrekvensene mellom de japanske NSCLC prøvene i denne studien og den sunne japanske befolkningen i HapMap prosjektet (
P
= 0,94, utvidet Fishers eksakte test, tabell 2). Vi deretter undersøkt forholdet mellom
EPAS1
SNPs og ulike clinicopathological egenskaper (Tabell 3). Hyppigheten av mindre allel av rs13419896 tendens til å være høyere hos kvinner enn hos menn: En frekvens av pasienter som har minst en
En
allel av rs13419896 (
En Twitter /
A
eller
En Twitter /
G
genotype) var 70,0% (14 av 20) hos kvinner og 44,6% (25 av 56) hos menn, selv om dette ikke var statistisk signifikant (
P
= 0,07, Fishers eksakte test). I tillegg utdeling av differensiering tendens til å avvike fra SNP med en marginal betydning (
P
= 0,06, utvidet Fishers eksakte test). Annet enn kjønn og differensiering, fant vi ikke noen statistiske sammenslutninger av SNP med clinicopathological kjennetegn som alder, histologi, tumor størrelse, og scene.
Vi så vurdert sammenslutning av rs13419896 SNP med total overlevelse for NSCLC. Median overlevelse for pasienter med minst en
En
allel av rs13419896 (
En Twitter /
En
eller
En Twitter /
G
) var betydelig kortere enn at med
G Twitter /
G
homozygot (28,0 måneder versus 52,5 måneder,
P
= 0,047, log-rank test, fig 4). Sammenlignet kumulative overlevelse på 12, 24 og 48 måneder, pasienter med
G /G
homozygot viste mye høyere priser enn de med
A /G
eller
A /A
genotype 12 og 48 måneder (
P
= 0,009 og 0,004, henholdsvis) (S1 Table). En multivariat analyse av de 74 NSCLC (2 pasienter ble ekskludert på grunn av mangel på tumorstørrelsen data) ved hjelp av en Cox proporsjonal fare modell viste at besittelse av
A
allel (
A /G
eller
A /A
genotype) av rs13419896, sammen med klinisk stadium, var en uavhengig variabel for estimering av risiko for total overlevelse for NSCLC [fare ratio (HR) = 2,31, 95% CI = 1,14 til 4,81
P
= 0,021], etter justering for alder, kjønn, stadium, histologi, tumor størrelse, og differensiering.
Kaplan-Meier overlevelses tomter stratifisert i henhold til genotyper av rs13419896 vises. Forskjell i total overlevelse over genotypiske grupper av NSCLC pasienter ble undersøkt ved hjelp av log-rank test med
P
-verdier som angitt.
Diskusjoner
Nylig flere SNPs av
EPAS1
har vist seg å korrelere med utvikling av ulike sykdommer som artrose [16], prematuritetsretinopati [17], maksimal metabolsk makt i eliteutholdenhetsutøvere [18], fysiologisk tilpasning i høyden populasjoner [19-22], og mottakelighet mot nyrecellekreft (RCC) og prostatakreft [23, 24]. Men en mekanisk kobling mellom disse SNPs og genuttrykk nivåer av
EPAS1
nesten ikke har vært kjent, med unntak av rs17039192 plassert i den 5′-utranslaterte region, som ga endret promoter-aktivitet i reportergen analyse i chondrogenic celler [16].
i denne studien bioinformatiske analyser bedt oss om å teste en rolle i en av Hap-tag SNPs, rs13419896 ligger innenfor intron1 av genet, i regulering av
EPAS1
uttrykk. Faktisk fant vi at et fragment i intron 1 av
EPAS1
inneholder transkripsjonsregulerende elementer og nucleotide forskjell på rs13419896 locus kan funksjonelt påvirke enhancer aktiviteter i kreftcellelinjer. Interessant, ytterligere kotransfeksjonseksperimenter sterkt indikerte at AP-en transkripsjonsfaktor kan være involvert i differensialtranskripsjons aktiviteter mellom rs13419896 lene. Den observerte spesifikke trans av eksogene AP-1 komponentene i konstruksjoner med
En
allel på rs13419896 avtalt godt med høyere relativ score for AP-en med
En
allel på SNP som vist av Jaspar Kjerne Vertebrata analyse. Tidligere har overekspresjon av c-Jun og c-fos-proteiner ble observert i 31 til 50 og 60%, henholdsvis, av NSCLC-vev [34, 35]. Den overuttrykt c-Jun eller c-Fos kan transactivate
EPAS1
genekspresjon
via
, i det minste delvis, en enhancer element innenfor en intron av genet i en allel-spesifikk måte ved den rs13419896 locus. Dette ble også støttet av observasjon av gen- og protein uttrykk nivåer av
EPAS1
ved rs13419896 SNP i ulike kreftceller. Selv om vi ikke helt bekrefte genotyper (inkludert allel tap, forsterkning, eller mutasjoner) av kreft cellelinjer som ble testet, fant vi at cellene med
En
allel på rs13419896 av
EPAS1
viste betydelig høyere
EPAS1
gen og protein uttrykk nivåer sammenlignet med de som mangler
En
allel uavhengig av forskjeller i genetisk bakgrunn. Til sammen disse dataene, er det sterkt anbefalt at
En
allel på rs13419896 SNP av
EPAS1
spiller en viktig rolle i endring av bindende affinitet av AP-1, som resulterer i differensierte nivåer av uttrykk av EPAS1 i NSCLC vev.
den observerte assosiasjon av
En
allel av rs13419896 SNP med økt uttrykk nivåer av EPAS1 inspirerte oss til ytterligere å undersøke den mulige rollen til SNP i prognose Japansk NSCLC, siden overekspresjon av EPAS1 ble rapportert å være assosiert med en dårlig prognose. Vi demonstrerte for første gang at rs13419896 locus var en uavhengig variabel for estimering av risiko for total overlevelse av NSCLC.
I human NSCLC, overekspresjon av HIF-2α (EPAS1) var konsekvent assosiert med histologi som SCC være dominerende økt tumorstørrelse, og angiogenese, som resulterer i dårligere prognose og redusert overlevelse [13, 14]. I vår studie fant vi ikke noen tilknytning til rs13419896 SNP med histologi og tumorstørrelse. På den annen side er det fare forholdet mellom besittelse av
A
allel over
G
allel i Cox fare modellen var 2,31, som kan sammenlignes med forholdet mellom høy ekspresjon av HIF-2α oppnådde tidligere (2,01 og 1,71) [13, 14]. Nyere meta-analyse undersøker total overlevelse ved overekspresjon av HIF-2α protein også demonstrert HR på 2,02 (95% KI: 1,47 til 2,77) [36]. Tatt i betraktning disse, kan det rs13419896 SNP er en av de viktige faktorer som bidrar til overekspresjon av HIF-2α i NSCLC vev og således være en nyttig prognostisk markør for NSCLC. Vi observerte en statistisk signifikant forskjell på kumulativ overlevelse mellom pasienter med
En
allel og uten 12 måneder etter operasjonen (S1 tabell). Hvis vår observasjon er bekreftet av andre kohorter i fremtiden, kan genotyping av SNP bli klinisk viktig for å vurdere pasientens omsorg og rådgivning umiddelbart. Foruten NSCLC ble andre kreftformer som colorectal og hode og nakke kreft også rapportert å vise en dårlig prognose med overekspresjon av HIF-2α i meta-analyser [37, 38]. Siden overekspresjon av AP-1-komponenter kan observeres for disse cancere [39, 40], kan det rs13419896 SNP bidra til overekspresjon av HIF-2α og være en nyttig prognostisk markør i ulike kreftformer.
Som konklusjon, vi fant her for første gang at nukleotid forskjell på rs13419896 SNP kan påvirke
EPAS1
gen og protein uttrykk, spesielt i respons til AP-en, og at
En
allel av
EPAS1
SNP er assosiert med dårligere prognose av lungekreftpasienter. For å etablere
EPAS1
SNP som et nyttig klinisk prognostisk markør og for ytterligere å klargjøre sine molekylære mekanismer, større skala clinicopathological studier av lungekreft og /eller andre typer kreft vil gi ytterligere innsikt i disse aspektene.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. UCSC Genome Browser representasjon av KODE Consortium ChIP-Seq data for transkripsjonsfaktor binding kledde på menneskelige genom bygge hg19.
Topp panelene viser genomisk struktur av
EPAS1
genet kompilert fra UCSC, RefSeq og GenBank med tykke barer indikerer exonic kodende sekvenser, tynne barer som viser ikke-kodende ekson-regioner (5 «og 3» UTR) og piler som angir introner med 5 «til 3» retningen. Den horisontale aksen viser genom posisjon i bp i intervallet fra chr2: 46,514,938-46,626,784. Posisjonen til rs13419896 SNP er vist i rødt, og dens relative stilling blir ekstrapolert for alle datasettene som en stiplet blå linje. ChIP-Seq data vises på samme genomet beliggenhet med den vertikale aksen indikerer ChIP berikelse av transkripsjon faktor bindende for CEBPB (svart), MYC (rød), FOS (grønn), juni (blå), JUNB (fiolett) og JUND ( oransje) i de angitte cellelinjer. Scale bar indikerer genomisk avstand på 50 kb
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134496.s001 product: (PDF)
S1 Table. Sammenligninger av kumulative overlevelse mellom pasienter med genotype
G Twitter /
G Hotell og
En Twitter /
G
eller
A
/
A
.
doi:10.1371/journal.pone.0134496.s002
(DOCX)
Acknowledgments
The Forfatterne takker professor N. Kohno, emeritus professor K. Inai (Hiroshima University), Prof. F. Yunus og Dr. E. Syahruddin (University of Indonesia) for støtten og oppmuntring. Vi takker også Ms C. Oda for henne teknisk assistanse. En del av dette arbeidet ble utført ved Analysis Center of Life Science, Hiroshima University.
