Abstract
Bakgrunn
De fleste cellegifter for å drepe kreft celler er svært cytotoksiske i normale celler, som begrenser deres kliniske applikasjoner. Det er derfor en utfordring å identifisere et stoff som er overfølsomme for kreftceller, men har minimale skadelige effekter på friske celler. Målet med denne studien var å vurdere potensialet i 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) for selektivt å drepe kreftceller og å belyse relaterte mekanismer.
Metodikk og hovedfunnene
Endringer i overlevelse, oksidativt stress, DNA-skade, og apoptose signale ble sammenlignet mellom 4βHWE behandlede munnhulekreft (Ca9-22) og normal fibroblast (HGF-1) celler. Ved 24 timer og 48 timer, antallet Ca9-22 celler var vesentlig redusert, men antallet HGF-1-celler ble bare svakt redusert. I tillegg IC
50-verdier for 4βHWE i Ca9-22 cellene var 3,6 og 1,9 ug /ml etter 24 og 48 timer henholdsvis. Tidsavhengige unormale økninger i ROS og dose-responsive mitokondrie depolarisering kan utnyttes ved hjelp 4βHWE i chemotherapies for selektivt å drepe kreftceller. Doseavhengig DNA-skade målt ved komet-kjerneekstrakt analyse og flowcytometri-baserte γ-H2AX /propidiumjodid (PI) analyse viste relativt strengere skader i Ca9-22 celler. At både lave og høye konsentrasjoner, 4βHWE helst opprørt cellesyklus i Ca9-22 celler ved å øke subG1 befolkning og arrestasjonen av G1 eller G2 /M. Selektiv induksjon av apoptose i Ca9-22-celler ble ytterligere bekreftet ved Annexin V /PI analyse, ved foretrukket ekspresjon av fosforylert ataksi-telangiectasia- og Rad3-relaterte protein (p-ATR), og ved spalting av kaspase 9, caspase 3, og poly ADP-ribose polymerase (PARP).
Konklusjon /Betydning
Sammen funnene i denne studien, spesielt bedre forståelse av de selektive drapsmekanismer 4βHWE, kan brukes til å forbedre effektiviteten i å drepe muntlige kreftceller under chemoprevention og terapi
Citation. Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. (2013) gylne Berry-avledet 4β-hydroxywithanolide E for selektivt drepe Oral kreft celler ved å generere ROS, skade DNA, og apoptotiske Pathways. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10,1371 /journal.pone.0064739
Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada
mottatt: 22. januar 2013, Godkjent: 17 april 2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Chiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council (NSC101-2320-B-037-049), Department of Health Executive Yuan, Kina (DOH102-TD-C-111-002), og National Sun Yat- Sen universitetet i KMU Joint Research Project (# NSYSU-KMU 102-034). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral kreft er den sjette vanligste kreftformen i verden [1]. Dens høy sykelighet og dødelighet er delvis på grunn av sin relativt dårlige kjemoterapi resultater [2]. På grunn av deres høye cytotoksisitet i normale celler, er de forskjellige anti-oral cancer medikamenter som er utviklet så langt begrenset terapeutiske anvendelser. Derfor er en vedvarende utfordring å utvikle en anti-kreft i munnhulen terapi som er sikrere og mer effektive, spesielt i form av selektiv drapet effektivitet.
Ekstrakt av
barbadoslykt product: (golden bær), som er en spiselig plante i familien Solanaceae, velig overfører en anti-hepatoma effekt ved apoptose [3]. Vår tidligere arbeid [4] fant at
P. peru
avledede 4β-hydroxywithanolide E (4βHWE) har apoptotiske og antiproliferative effekter på humane lungekreftceller [4]. De 4βHWE withanolides er plante-avledet C (28) steroidale laktoner [5] med potente anti-kreft egenskaper [6]. Andre withanolides, slik som withaferin A, også velig indusere apoptose i mange krefttyper, inkludert brystkreft [7], melanom [8], og leukemi [9].
Akkumulerende bevismateriale i nyere studier indikerer at selektiv aktivering av apoptose forbedrer effektiviteten av kreft kjemoterapi [10] – [15]. For forbedret modulasjon av apoptotiske potensialet til kreftceller, er en lovende linje av forskning ved bruk av withanolides som selektivt dreper tumorceller, men som har lav toksisitet i friske celler [13]. Men den potensielle bruken av apoptose-induserende withanolides eksempel 4βHWE [4] og withaferin A [7] – [9] for selektiv dreping, særlig i orale kreftceller, er sjelden omtalt
Derfor er denne studien. undersøkt mulighetene effektivitet og relaterte mekanismer for
P. peru
avledede 4βHWE brukes for selektivt å drepe muntlige kreftceller.
Materialer og metoder
Cellekulturer og narkotika informasjon
To cellelinjer, Ca9-22 (human gingival karsinom) [16] – [18] og HGF-1 (human normal gingival fibroblast) [19], ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) henholdsvis -F12 medium og DMEM-medium (Gibco, Grand Island, NY), , supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 0,03% glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Alle cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Den 4βHWE (C
28H
38O
8; MW: 502,6). Ble fremstilt fra gylden bær ekstrakt som beskrevet i [4] og oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) for testing
Vurdering av veksthemming
Celleveksten veksten~~POS=HEADCOMP ble målt ved hjelp av (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium ( MTS) analyse som beskrevet i [18]. i korthet ble cellene eksponert for bærerkontroll (DMSO) eller for å 4βHWE i konsentrasjoner på 1, 2, 5 og 10 ug /ml i 24 timer. cellene ble deretter eksponert for MTS-løsning ( CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, USA) og inkubert i 1-2 timer ved 37 ° C. produktet ble målt ved 490 nm absorbans ved hjelp av en Dynex MRX Model 96-brønners plate leser (MTX Lab Systems, Inc., Vienna, VA, USA).
Vurdering av intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS)
intracellulær ROS ble målt ved hjelp av to «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [17]. etter 4βHWE behandling ble cellene vasket med PBS og deretter inkubert med 10 pM H2DCF-dA i PBS i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Cellene ble deretter høstet og vasket med PBS. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i PBS og analysert med et FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, Mansfield, MA, USA) med Win-MDI programvaren (https://facs.scripps.edu/software.html) ved eksitasjon og emisjon innstillingene for 480 og 525 nm, henholdsvis
Vurdering av mitokondriemembranen potensial
mitokondriell membranpotensialet (ΔΨ
m; MitoMP). ble målt ved hjelp av en MitoProbe ™ DiOC
2 ( 3) analysesett (Invitrogen, San Diego, CA, USA) som beskrevet i [16]. De 4βHWE-behandlede celler ble suspendert i 1 ml varm PBS ved omtrent 1 x 10
6 celler /ml, lastet med 5 pl 10 pM DiOC
2 (3), og inkubert ved 37 ° C i fem % CO
2 for 20-30 min. Etter høsting ble cellene vasket, resuspendert i PBS, og analysert umiddelbart med et flowcytometer med Win-MDI programvare på eksitasjon og utslipps innstillingene for 488 og 525 nm, henholdsvis.
Vurdering av DNA-skader ved komet-NE analysen
De kjerneekstrakt (NE) av HGF-1-celler ble brukt til å utføre komet-NE-analyse i henhold til en tidligere beskrevet protokoll [4], [20] med små modifikasjoner. Kort sagt ble cellesuspensjoner blandet med like volumer av 1,2% lavt smeltepunkt agarose, umiddelbart fylt på 1,2% faste agarose-pre-belagte objektglass, og deretter avkjølt med is inntil stivning. Det tredje lag med et like stort volum av 1,2% lavtsmeltende agarose-gel ble deretter applisert på den størknede gel og andre igjen avkjølt med is. Etter celle-lysering behandling ved 4 ° C i 2 timer, ble platene behandlet for å NE fordøyelse med et dekkglass og inkubert ved 37 ° C i 2 timer i en fuktet plass. Denaturering av lysbildene i 0,3 N NaOH og 1 mM EDTA i 20 min ble etterfulgt av elektroforese. Etter vasking ble platene overført til 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5), og 40 ul propidiumjodid (PI, 50 ug /ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt for fluorescens mikroskopi observasjon (TE2000-U ; Nikon, Tokyo, Japan). I kometen analysen ble et freeware program (https://tritekcorp.com) brukes til å måle DNA-skade i form av prosentandel av halen DNA [21].
Vurdering av DNA-skader ved γ-H2AX /PI cytometri
Etter 4βHWE behandling ble cellene fiksert i 70% etanol, vasket to ganger i BSA-T-PBS-løsning (1% bovint serumalbumin og 0,2% Triton X-100 i PBS, Sigma), og inkubert over natten ved 4 ° C i 100 ul BSA-PBS-T-oppløsning inneholdende 0,2 ug p-Histone H2A.X (Ser 139) monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Etter vask ble cellene suspendert i 1 time i en 1:100 fortynning av Alexa Fluor 488-merket sekundært antistoff (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Etter nok en vask, ble cellene resuspendert i 5 mikrogram /ml PI for analyse med en FACSCalibur flowcytometer med Win-MDI programvare.
Vurdering av cellesyklus distribusjon og sub-G1 befolkningen
PI-farging ble utført som beskrevet tidligere [20]. I korthet ble cellene behandlet med bærer (DMSO) eller 0,5, 1, 2, 5 og 10 pg /ml 4βHWE for 24 og 48 timer. Etter høsting ble cellene fiksert over natten med 70% etanol. Etter sentrifugering ble cellepelletene ble inkubert med 10 ug /ml PI og 10 pg /ml RNase A i PBS i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Prøvene ble deretter analysert med en FACSCalibur flowcytometer og Win-MDI programvare.
Vurdering av apoptose
Apoptose ble målt ved annexin /PI dobbel farging (Pharmingen, San Diego, CA, USA) som tidligere beskrevet [22]. I korthet ble cellene behandlet med bærer eller med 4βHWE i doser på 1, 2, og 5 pg /ml i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 10 ug /ml av annexin V-fluorescein-isotiocyanat og 5 ug /ml PI og analysert med et FACSCalibur strømningscytometer (Becton-Dickinson) med Win-MDI programvaren.
Western blotting
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [23]. I korthet ble cellene først innhøstet og lysert. Lysatene ble sentrifugert, og proteinkonsentrasjoner ble bestemt. De 40 ug protein lysater ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og deretter elektrooverført. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk. Membranene ble deretter inkubert med primære antistoffer mot fosforylert ataksi-telangiectasia- og Rad3-relaterte protein (p-ATR) (# sc-109 912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, USA), spaltet caspase-9 (# 9501 , Cellesignalering signale~~POS=TRUNC Technology, Beverly, MA, USA), kløyvde caspase-3 (# IMG-144A, IMGENEX, San. Diego, CA, USA), kløyvde poly ADP-ribose polymerase (PARP) (# 9541, Cell Signaling Technology) og β-aktin (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), og deres tilsvarende sekundære antistoffer. ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, USA) chemiluminescence deteksjon kit ble så brukt for signaldeteksjon.
Statistisk analyse
Alle data ble presentert som betyr ± SD. Gruppe forskjeller i celle levedyktighet og cellesyklus ble vurdert ved hjelp JMP® 9 programvare for å utføre enveis ANOVA med Tukey HSD Post Hoc test. Nivåer ikke forbundet med den samme liten bokstav indikerte signifikante forskjeller. Andre data ble analysert ved Student
t
-test.
Resultater
Vurdering av veksthemming
MTS analysen av celle levedyktighet etter 24 timer og 48 h behandling med 4βHWE (0, 1, 2, 5 og 10 ug /ml) viste at, for hver forsøks konsentrasjon av 4βHWE, spredning av Ca9-22 oral kreftceller var signifikant lavere enn den til HGF-1 normale celler (en- veis ANOVA) (figur 1). I HGF-1-celler, behandling med 10 ug /ml 4βHWE noe redusert cellelevedyktighet til 89,02 ± 1,17% og til 65,42 ± 2,26% etter henholdsvis 24 timer og 48 timer,. I motsetning til dette, levedyktigheten av behandlet på lignende måte 4βHWE-behandlede Ca9-22 celler dramatisk redusert til 26,56 ± 2,22 og 16,01 ± 2,38 etter henholdsvis 24 timer og 48 timer. Den antiproliferative effekt av 4βHWE på Ca9-22 celler var både dose-responsive og tidsavhengig. I tillegg IC
50-verdier var 3,6 og 1,9 ug /ml etter henholdsvis 24 timer og 48 timer, i 4βHWE-behandlede celler, mens Ca9-22 IC
50 ble uoppdaget i behandlet på lignende måte HGF-1-celler.
Celler ble behandlet med 0, 1, 2, 5 og 10 pg /ml 4βHWE for 24 og 48 timer. Data, middelverdi ± SD (n = 3). For de samme legemiddelkonsentrasjoner i fire forskjellige grupper (Ca9-22 for 24 timer, Ca9-22 for 48 timer, HGF-en for 24 timer, HGF-en for 48 h), data ikke forbundet med den samme liten bokstav ( øvre høyre hjørne av SD) signifikant forskjellig (enveis ANOVA med Tukey HSD Post Hoc test).
Vurdering av ROS
Noen withanolides som withaferin En velig indusere celledød i melanomceller ved å generere ROS [8]. Derfor denne studien neste sammenlignet regulerer effekten av ROS på spredning av Ca9-22 og HGF-1 celler. Figurene 2A og 2B viser ROS fluorescensstyrkene i form av prosentandeler av Ca9-22 og HGF-1-celler positive for DCFD-A, som ble tellet etter behandling med 3,6 ug /ml 4βHWE for varierende tidsintervaller. Figur 2C viser en svak induksjon av ROS observert i HGF-1 celler sammenlignet med den forholdsvis dramatiske tidsavhengig induksjon av ROS i Ca9-22 celler. For hver eksperimentell konsentrasjon av 4βHWE, prosentandelen av DCFD-A positive celler var signifikant høyere i Ca9-22 oral kreftceller enn i normale HGF-1 celler (
P
0,0001).
Celler ble administrert et kjøretøy og 3,6 ug /ml 4βHWE for varierende tidsintervaller (0 til 5 t). For å måle endringen ROS, 200 pM H
2o
2 ble anvendt som en positiv kontroll. (A, B) Representant flowcytometri-baserte ROS profiler for 4βHWE-behandlede celler. (C) Kvantifisering analyse av ROS intensitet i form av DCFD-A positivitet (%). Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom to cellelinjer etter behandling med liknende 4βHWE konsentrasjoner (
t
-test,
P
0,0001 **).
Assessment av mitokondrie membran potensialene (mitoMP)
Deretter en DiOC
2 (3) analysen ble utført for å undersøke effekten av 4βHWE-indusert ROS induksjon på mitoMP. Figurene 3A og 3B viser mitoMP fluorescensstyrkene i form av prosentandeler av DiOC
2 (3) -positivt Ca9-22 og HGF-1-celler etter 24 timers behandling med 0, 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE. Figur 3C viser at mitoMP redusert moderat i HGF-1-celler, men vesentlig redusert i Ca9-22-celler på en doseavhengig måte. For hver eksperimentell konsentrasjon av 4βHWE, prosentandelen av celler positivt for DiOC
2 (3) var signifikant lavere i Ca9-22 celler enn i HGF-1 celler (
P
0,0005).
(A, B) representant flowcytometri-baserte MitoMP profiler for 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner (0-5 ug /ml) av 4βHWE i 24 timer. (C) Kvantifisering analyse av MitoMP intensitet. Data er presentert som gjennomsnitt ± SDS% (n = 3). Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom de Ca9-22 og HGF-1 cellelinjer etter behandling med tilsvarende konsentrasjoner av 4βHWE (
t
-test,
P
0,0005 **).
Vurdering av DNA-skader ved komet NE analysen
i kometen-NE-analysen (figur 4A), de «tailing» effekter observert i Ca9-22 cellene var størst ved høy 4βHWE konsentrasjoner. I motsetning til dette har ingen av de eksperimentelle 4βHWE konsentrasjoner indusert en observerbar tailing effekt i HGF-1-celler. Figur 4B viser at HGF-1 celler viste ingen synlig økning i% hale-DNA, mens Ca9-22 celler viste dramatisk økt% hale-DNA i en dose-respons måte. For hver eksperimentell konsentrasjon av 4βHWE, DNA skader i form av% DNA i halene av celler behandlet med 4βHWE var betydelig mer alvorlig i HGF-1 celler enn i Ca9-22 celler (
P
0,0001) .
(A) Representative komet PI fargingsresultater for cellekontroller (DMSO) og celler ble behandlet med 0,5, 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE i 2 timer. Kjernene vises som røde flekker, og haler av flekker indikerer alvorlighetsgraden av DNA skader etter 4βHWE behandlinger. (B) Gjennomsnitt av% av halen DNA i 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. Data, gjennomsnitt ± SD (kjerner = 50). Stjernene viser signifikante forskjeller mellom Ca9-22 og HGF-1 cellelinjer etter behandling med liknende 4βHWE konsentrasjoner (
t
-test,
P
0,0001 **).
Vurdering av DNA-skader ved γ-H2AX /PI cytometri
for ytterligere bekreftelse på involvering av DNA-skader i 4βHWE-indusert hemming av vekst i Ca9-22 oral kreft celler, DNA dobbel tråd pause (DSB) ble målt ved γ-H2AX uttrykk. Figur 5A viser γ-H2AX /PI fargingsprofilene erholdt etter 24 timer behandlinger med positiv kontroll eller med 0, 0,1, 0,25, 0,5 og 1 pg /ml 4βHWE. Figur 5B viser at etter behandling med 4βHWE konsentrasjoner lavere enn 2 ug /ml, den HGF-1-celler opprettholdt lave nivåer av γ-H2AX ekspresjon, mens Ca9-22 celler viste doseavhengig økning i dramatiske γ-H2AX uttrykk. Ved høyere konsentrasjoner av 4βHWE imidlertid gangers endring i% av γ-H2AX-positive celler var signifikant større i Ca9-22 celler enn i HGF-1 celler (
P
0,0005).
Celler ble behandlet med 0, 1, 2, og 5 ug /ml av 4βHWE i 24 timer. (A) Representant flowcytometri-baserte DSB profil for 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. Celler ble behandlet med 5 uM camptothecin (CPT) i 24 timer ble ansett γ-H2AX positiv kontroll. (B) Kvantifisering analyse av fold endringer i γ-H2AX baserte DNA-skader i 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. Data, gjennomsnitt ± SD. Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom Ca9-22 og HGF-1 celler behandlet med liknende 4βHWE konsentrasjoner (
t
-test,
P
0,0005 ** n = 2 og 3, henholdsvis).
Vurdering av cellesyklus distribusjon
Figur 6 viser at etter 24 timers behandling med 4βHWE, den prosentvise endringen i sub-G1 populasjoner i HGF-1 celler ikke var statistisk signifikant ved konsentrasjoner lavere enn 2 pg /ml. Den prosentvise endringen i sub-G1 litt økt til 2,75% når konsentrasjonen nådde 5 ug /ml. I motsetning til dette, den prosentvise endring i sub-G1 i Ca9-22 celler behandlet med 4βHWE i 24 timer begynte å vise signifikante endringer i konsentrasjoner så lave som 2 pg /ml og til slutt nådde 30,59%. Etter 48 timers behandling var prosentandelen av sub-populasjoner G1 i HGF-1 celler moderat økt til 25,03% og 29,42% etter behandlinger med 2 og 5 ug /ml 4βHWE, respektivt. I motsetning til dette, andelen av sub-G1 i Ca9-22 celler behandlet med 4βHWE i 48 timer viste en statistisk signifikant endring (42,76%) etter behandling med 1 pg /ml og en mye større endring (78,89%) etter behandling med 5 ug /ml.
Celler ble behandlet med 0, 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE i 24 timer og 48 timer. (A) Representative cellesyklusfordelingen i 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1-celler. (b) Cellefase prosenter som oppnås for (A) i triplikate eksperimenter. For samme fase av forskjellige medikamentkonsentrasjoner, data ikke koblet med det samme liten bokstav (øverst til høyre på SD) signifikant forskjellig (enveis ANOVA med Tukey HSD Post Hoc test).
På 24 timer, analyser av G1 og G2 /M-populasjoner i HGF-1 celler viste en ikke-signifikant endring i populasjonen G1 og et basalnivå av endring i G2 /M forurensning. I motsetning til dette, etter 24 timer 4βHWE behandling, de Ca9-22 cellene viste signifikante endringer i G1 rest (57,49% og 40,75% ved 0,5 og 1 ug /ml, henholdsvis) og i G2 /M rest (50,44% og 62,08% ved en og 2 ug /ml henholdsvis). Etter 48 timers behandling med 5 mg /ml βHWE, G1 befolkningen i de HGF-1 celler svakt redusert til 56,27%, mens G2 /M befolkning noe økt. I motsetning til dette Ca9-22 cellene viste betydelig (79,23%) G1 rest etter 48 timers behandling med et 4βHWE konsentrasjon på bare 0,5 ug /ml. I G2 /M befolkningen, behandling med 1 mg /ml 4βHWE ga moderat (27,34%) G1 arrest kombinert med dramatiske subG1 ansamlinger som beskrevet ovenfor.
Vurdering av apoptose
For å undersøke involvering av apoptose i 4βHWE-indusert sub-G1 opphopning, flowcytometri-baserte annexin V /PI dobbel farging ble utført. Figur 7A viser γ-H2AX /PI fargings profiler av HGF-1 og Ca9-22 celler behandlet med varierende konsentrasjoner 4βHWE. Den doble positive områder av y-H2AX og PI intensiteter blir vanligvis definert som sent apoptose. Analyser av sen apoptose (figur 7B) viste en mild doseavhengig økning i HGF-1-celler, men en dramatisk doseavhengig økning i Ca9-22 celler. For hver eksperimentell konsentrasjon av 4βHWE, prosentandelen av celler som gjennomgikk sent apoptose etter 4βHWE behandling var signifikant høyere i Ca9-22 celler enn i HGF-1 celler (
P
0,0001).
Celler ble behandlet med 0, 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE i 24 timer. (A) Representative apoptotiske profiler innhentet av Annexin V /PI dobbel farging i 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. (B) Kvantifisering analyseresultater for sent apoptose befolkningen (%). Bare annexin V (+) /PI (+) regioner ble analysert. Data, middelverdi ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom to cellelinjer (Ca9-22 og HGF-1) som ble behandlet med liknende 4βHWE konsentrasjoner (
t
-test,
P
0,0001 **).
Vurdering av apoptotisk aliserte
apoptotisk signalering ble undersøkt ved Western blotting-analyser av Ca9-22 og HGF-1-celler behandlet med varierende konsentrasjoner av 4βHWE (0, 1, 2, og 5 ug /ml). Figur 8 viser at økende konsentrasjoner av 4βHWE induserte trinnvise økninger i ATR fosforylering assosiert med cellulær DNA-skade i Ca9-22 cellene. Spalting av kaspase 9, caspase 3 og PARP ble også indusert i Ca9-22 celler, spesielt ved 4βHWE konsentrasjoner på 2 ug /ml og 5 ug /ml. I motsetning til dette ble 4βHWE ikke utløse enten ATR fosforylering eller aktiveringen av caspase kaskade i HGF-1-celler.
Celler ble behandlet med 0, 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE i 24 timer. Apoptose aliserte proteiner, slik som p-ATR, og spalting av pro-kaspase 9, ble pro-kaspase 3 og PARP detektert. Den β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Hver blot representerer en selvstendig eksperiment utført i tre eksemplarer.
Diskusjoner
withanolides er plante-avledet C (28) steroide lakton med potent anti-kreft aktivitet [24], [25] . Imidlertid har bruken av withanolides for selektivt å drepe kreftceller har ikke blitt intensivt studert. Withaferin A er kjent for å indusere apoptose i mange krefttyper, inkludert leukemi [9], melanom [8], og kreft i bryst [7], lever [26], bukspyttkjertel [27], tykktarm [28], lunge [29 ], og prostata [30]. I tidligere studier, XTT analyser utført etter 24 timer behandling med withaferin A viste IC
50 verdier av 2 mikrometer i leukemiceller (HL-60) [31], 4 mikrometer i prostatakreftceller (PC3) [30], og 6 uM i hepatom (SK-Hep1), tarmkreft (HT29) og nyrekreft (Caki) celler [26]. Rapportert IC
50-verdier oppnådd ved MTT-analyser av brystcancer-celler (MDA-MB-231) inkludere 13 uM for anomanolide A, 15 uM for tubocapsanolide E, og ved 20 uM for tubocapsenolide B, tubocapsanolide C, og peruvianolide H [ ,,,0],6].
Nylig withanolide avledet fra ashwagandha blad ekstrakt [32] har vist en potensiell rolle for selektivt å drepe brystcancer MCF7-celler ved en konsentrasjon på 24 ug /ml [33]. Denne studien viste likeledes at IC
50 verdier av Ca9-22 orale kreftceller var 3,6 ug /ml (7,16 um) og 1,9 ug /ml (3.78 pm) og etter 24 timer og 48 timer behandling med 4βHWE, respektivt. Vi hypotese at selektiv drapet effekten av 4βHWE kan være tilsvarende eller enda mer potent i andre orale kreftcellelinjer. I HGF-1-celler, men IC
50-verdier var upåviselig ved MTS-analyse ved konsentrasjoner lavere enn 10 ug /ml. I andre studier av 4βHWE behandlinger for 24 timer, ble en IC
50 verdi på 6 pM rapportert i en MTT analyse av brystkreft MDA-MB-231-celler [6] og en IC
50 verdi på 1,41 pM var rapporterte i en trypan blå analyse av lungekreft H1299-celler [4]. Disse data indikerer at den medikamentsensitivitet av 4βHWE varierer i henhold til kreftcelletype. Dessuten er denne studien den første for å bekrefte at 4βHWE dreper orale kreftceller fortrinnsvis til normale orale vev.
Videre er den beskyttende effekt av withanolides er funnet i normale fibroblastceller. For eksempel withanone avledet fra Ashwagandha blad beskytter normale humane fibroblaster mot metoksyeddiksyre-indusert senescence-like growth arrest i form av alderdom-forbundet β-galaktosidase flekker [34]. Tilsvarende dagens forskning funnet at morfologien til HGF-1-celler behandlet med 1, 2, og 5 pg /ml 4βHWE var lik den for ubehandlet fibroblast HGF-1-celler (data ikke vist). Videre studier av vekst arrest fenotyper er nødvendig for å fastslå om 4βHWE er trygt for normale celler.
Selv om akkumulere bevis enig i at withanolides induserer ROS-mediert apoptose, er relativt uklart deres potensielle bruk for selektivt å drepe kreftceller. For eksempel, withaferin A er kjent for å indusere ROS-mediert apoptose i brystkreft [7], melanom [8], og leukemi [9], [31]. Selv om kreftceller forventes å ha høyere oksidativt stress sammenlignet med normale celler [35], kan normale celler tolerere et eksogent oksidativt stress nivå tilstrekkelig til å forhindre overbelastning som fører til celledød. I motsetning til dette, kan kreftceller utsettes for høye oksidativt stress ikke tolerere eksogene ROS-modulerende midler, og celledød øker når terskelnivået er overskredet [36]. Dette konseptet kan delvis forklare de selektive drepe virkningene av 4βHWE i orale kreftceller observert her, og de av withanone i brystkreftceller som rapportert i [33], det vil si, både ROS induksjon og reduksjon av mitokondriemembranpotensialet er høyere i kreftceller sammenlignet til normale celler. Disse resultatene tyder på at behandling for selektivt å drepe kreftceller bør være rettet mot modulerende redoks-status på både kreftceller og normale celler [36]. Men rollene til caspases og kaspaseinhibitorer [37] i 4βHWE-indusert selektiv apoptose trenger videre studier.
ROS-medierte effekter av withanolides kan moduleres av antioksidanter. For eksempel kan N-acetylcystein velig redde humane melanomceller fra withaferin A-indusert, ROS-mediert apoptose [8]. Følgelig kan rollen ROS i den selektive drap på 4βHWE bli ytterligere avklart ved å studere ROS-modulatorer.
ROS er kjent for å indusere DNA-skade og sjekkpunkt svar [38]. For eksempel, de komet-NE og γ-H2AX analyser i denne studien viste at 4βHWE indusert DNA skade og G1 eller G2 /M cellesyklus arrest, som begge har blitt observert tidligere i andre withanolides. For eksempel tubocapsanolide A velig hemmer spredning av lungekreft A549 celler via G1 arrest [39]. Imidlertid 4βHWE [4] og withanone [33] er kjent for å indusere DNA-skade, og deretter arrest i G2 /M i lungekreft H1299-celler og i brystcancer MCF-7-celler, respektivt.
Selective DNA-skader ( dvs. DSB) kan overvåkes ved H2AX, som er fosforylert i et ATR-avhengig måte [40]. Den H2AX bidrar også til å stabilisere genomet [41] og er essensiell for caspase-aktivert DNA-fragmentering [42]. Som forventet, 4βHWE behandling indusert høyere uttrykk av ATR og caspase signaliserer proteiner i Ca9-22 celler sammenlignet med HGF-1 celler.
Etter 24 timers behandling med 2 mg /ml 4βHWE, Ca9-22 og HGF-en cellene viste celle viabilities (%) av 56,09 ± 1,78 og 92,81 ± 2,20 (figur 1); mitoMP (%) av 61,18 ± 3,21 og 99,81 ± 0,74 (figur 3); γ-H2AX (fold) på 8,47 ± 0,54 og 0,73 ± 0,19 (Figur 5); subG1 populasjoner (%) av 14,74 ± 0,30 og 1,32 ± 0,15; G2 /M arrestasjoner av 62,08 ± 1,03 og 15,89 ± 0,19 (figur 6) sent apoptose (%) av 13,80 ± 1,05 og 7,97 ± 0,06 (figur 7); og over- og under-ekspresjon av apoptose signaleringsproteiner (figur 8), henholdsvis. Resultatene viste konsekvent effektene av 4βHWE i form av selektiv drapet, selektiv mitokondriedysfunksjon, skade selektiv DNA (dvs. DSB), selektiv G2 /M arrest, og selektiv apoptose av Ca9-22 celler fortrinnsvis til HGF-1 celler. Etter at lignende behandling med 3,6 ug /ml 4βHWE i 2 timer, den Ca9-22 og HGF-1 celler viste ROS-induksjon (%) av 158,83 ± 0,34 108,63 ± 1,04, og (figur 2) og komet-NE-baserte DNA-skade av 29,21 ± 5,93 og 0,27 ± 0,52 (figur 4), respektivt. Disse resultatene ytterligere bekreftet at 4βHWE behandling selektivt induserer ROS og DNA-skader i Ca9-22 celler i innstillingen til HGF-1 celler.
I konklusjonen, resultatene av denne studien bekrefter at 4βHWE behandling selektivt induserer ROS, mitokondrie depolarisering og DNA-skade, som i sin tur induserer apoptose selektiv signalering, som til slutt resulterer i selektiv dreping av orale kreftceller (figur 9). Følgelig denne studien viste, for første gang, at 4βHWE behandling selektivt dreper orale kreftceller fremfor til normale orale celler. Videre studier av målet kandidatene og signalmekanismer som presenteres her kan også gi en tilstrekkelig bedre forståelse av de selektive draps mekanismer 4βHWE å muliggjøre effektiv bruk i behandling av kreft i munnhulen med minimale bivirkninger.
Endringer i Ca9-22 cellene er angitt med blå piler. Normale orale celler (ikke vist) viste at forholdsvis små endringer i forhold til Ca9-22 celler. I Ca9-22 behandlet med 4βHWE, forbedret ROS generasjon resultert i økt oksidativt stress. Induksjon av ROS deretter økt mitokondriell dysfunksjon og tilrettelagt reduksjon av mitokondriemembranen potensial i Ca9-22 celler. Induksjon av ROS også resulterte i økt DNA-skade i Ca9-22 celler, f.eks, γ-H2AX i DSB, som deretter indusert ATR fosforylering. Sammen mitokondrieskade signalering og DNA-skade signale resulterte i økt apoptose signalering, som deretter førte til selektiv apoptose og drap av Ca9-22 celler.
